樟芝抗氧化酶的蛋白質與核酸及其製造方法與用途的製作方法

2023-05-18 16:41:51 1

專利名稱：樟芝抗氧化酶的蛋白質與核酸及其製造方法與用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種樟芝抗氧化酶的蛋白質、胺基酸及其核酸、核苷酸，及可供製造該蛋白質的表現載體、宿主細胞及製造方法，與含有該蛋白質的醫藥組成物。
背景技術：
抗氧化酶包含超氧歧化酶(superoxide dismutase，SODEC 1.15.1.1)及過氧化還原酶(peroxiredoxin，Prx，例如1-Cys Prx和2-Cys Prx等)，它們對維持身體健康起重要作用。在2003年，Gems和McElwee氏指出長壽基因是包含多種抗氧化酶和熱休克蛋白，這些抗氧化酶和蛋白能恢復已不正常折迭的蛋白質〔misfolded proteins〕的構形和活性，而有利於壽命增長。同年，Neumann氏等人指出Prx在小鼠〔mice〕中如使上述抗氧化酶失去活性將造成嚴重的溶血性貧血和癌化致使壽命劇減，足見對生物體的壽命、健康和解毒有重要作用，值得研究分述如下超氧歧化酶SOD它的功能是排除O2·-，有報告指出SOD應用在創傷傷口能加速癒合和清除臉部黑斑、雀斑。又，SOD具有調節神經細胞產生IL-1β、NO和TNF-α的功能(Chang，et al.，2001)，故SOD在維持身體健康中有重要作用。SOD存在於好氧性或厭氧性的真核或原核生物中，能將超氧自由基催化成氧分子或過氧化氫，提供了生物體抵抗毒性氧所帶來的破壞與傷害的機能，其反應式如下。SOD是含金屬的酵素蛋白，根據其活性位置所結合的金屬輔因子的不同一般可分為銅鋅型、錳型及鐵型三種類型(Bannister，et al.，1987)，這三種不同類型的SOD分布於不同的物種與不同的區位。1969年美國學者McCord與Fridovich發現此種含銅鋅的蛋白質具有清除超氧自由基的功能，因此將它命名為SOD，隨後陸續在各種生物體內發現有Cu/Zn-SOD的存在。在真核細胞中，以甘薯和木瓜Cu/Zn-SOD為例，其次單元體分子量為19kDa，純化出來的蛋白質呈淡藍色，在pH2.2～12之間安定，熱安定性甚高，4％ SDS or 2M的咪唑〔imidazole〕的環境的下仍能維持其活性(Lin，etal.，1995，1999)。由X-光晶格繞射牛類動物〔bovine〕的Cu/Zn-SOD蛋白分子，發現有三個帶正電荷的胺基酸形成帶正電荷的活性通道，分別是Arg141、Lys120、Lys135，銅離子在活性中心的位置是由四個His(44、46、61、118)的咪唑環基〔imidazolering〕形成配位鍵，鋅離子則是以His61做為橋梁與銅離子連結，其它與鋅離子鍵結的胺基酸殘基尚有His61、His69、His78及Asp81。上述Cu/Zn-SOD蛋白分子的內生性的雙硫鍵位於Cys60及Cys161(Steinman，et al.，1974；Schinina，etal.，1996)。SOD與超氧自由基的反應速率極快，幾乎接近於擴散極限，但活性中心的銅離子暴露於溶劑的面積卻不及酵素表面積的0.1％，Cu/Zn-SOD蛋白質次單元體表面多是帶負電，所以因為同性電荷的斥力，將同樣帶負電的超氧自由基送到帶正電的活性中心，進行酵素的催化反應(Tainer，et al.，1983)，因此靜電力被認為對引導負電性的超氧自由基到達活性中心有促進作用。銅離子在歧化反應中扮演了氧化與還原兩種角色，而鋅離子並沒有參與催化作用，其功能主要是在安定整個酵素的結構。若以其它金屬離子取代銅離子時，酵素將失去活性，但若以Co2+、Hg2+或Cd2+甚至空位取代鋅離子，則酵素分子仍具有部分活性(Fridovich，1986)。Mn-SOD在1970年由大腸桿菌中分離出來呈淡紅色，主要位於原核細胞與真核細胞的粒線體中。蛋白質的活性隨著次單元體活性中心錳離子的價數改變而改變，當活性中心錳離子帶正二價電荷時具有酵素的催化能力，當活性中心錳離子帶正三價電荷時則呈休息狀態，不具有酵素的催化能力。Mn-SOD多為由兩個蛋白質次單元體組成的二元體，但也發現有四元體甚至三元體的存在。以T.thermophilus菌的Mn-SOD為例，其每單元體分子量約19～22kDa，每個蛋白質單元體中含有一個錳離子。該菌的Mn-SOD由His26、His81、Asp175、His179與錳離子鍵結(William，et al.，1984)。Fe-SOD分布於原核細菌細胞基質中，藻類、某些高等植物及其葉綠體中，然而在所有的動物組織中都沒有發現Fe-SOD存在，但在一些高等植物組織中則發現有Fe-SOD存在，例如銀杏(Ginkgo biloba)、蕃茄、十字花科的油菜、水稻的花器(Pan and Yan，1991)。Fe-SOD呈淡黃色，在核酸與胺基酸序列上與Mn-SOD相似(William，et al.，1984；Wayne，et al.，1991)，對熱及pH值安定性較差，也不受氰化物〔cyanide〕抑制，但對過氧化氫則較無抵抗力，且與Cu/Zn-SOD的胺基酸序列有明顯的不同。Fe-SOD通常是由兩個蛋白質次單元體組成，每個蛋白質單元體的分子量約18.5～22kDa左右，但也有發現以四元體(Lim，et al.，1997)的形式存在，在每個單元體中含有0.5～1個鐵離子。以大腸桿菌E.coli為例，其Fe-SOD以His27、His81、Asp163、His167與鐵離子鍵結(Lim，et al.，1997)。酵素的活性隨著單元體活性中心鐵離子的價數而改變。當活性中心鐵離子帶正二價電時，具有酵素的催化能力，帶正三價電時酵素呈現休止狀態。
過氧化還原酶Prx於2003年Horling氏等在阿拉伯芥的芽中發現有七種基因產物，來適應多種氧化還原環境，分別稱2-Cys PrxA、2-Cys PrxB、PrxQ、PrxIIA、PrxIIB、PrxIIC、PrxIIE，尤其PrxIIB受tB氧化劑〔tertiarybutylhydroperoxide〕所誘發，PrxQ對過氧化物〔peroxide〕和雙胺化合物〔diamide〕的處理最容易被誘導。另外2002年Castro氏等人報告，寄生蟲(Leishmania infantum)因2-Cys Prx的表現〔expression〕可增強對H2O2和tB氧化劑的防禦力。其分子量約21kDa。
過氧化還原酶Prx主要功能在排除生物體內的過氧化物如H2O2、3-丁基過氧化物〔t-butylperoxide〕、異丙苯過氧化物〔cumene peroxide〕等，這些過氧化物如不及時清除，則會對生物體(如蛋白質，脂質，和核酸)造成許多傷害，累積這些受傷害的物質是致使老化或神經退化疾病的原因。由蛋白質序列比較，依據保守區的半胱氨酸位置〔cysteine residues〕，過氧化還原酶Prx可分成二大族群〔1〕、1-Cys Prx是缺乏Cys170而僅具有Cys47保守區。〔2〕、2-Cys Prx是具有Cys47和Cys170二保守區。Kawazu氏等人從瘧疾原蟲(P.falciparum)分別選殖到2-Cys Prx和1-Cys Prx。
過氧化還原酶Prx是一種新奇的抗氧化蛋白，屬於過氧化酶peroxidase的家族中的一員，分子量約25KDa，其以硫氧化還原蛋白系統thioredoxin(Trx)system(Trx，Trx reductase和NADPH)作為電子提供者。過氧化還原酶Prx可保護一些易受自由基傷害的酵素系統恢復活性〔例如，經由金屬催化自由基產生系統metal-catalyzed oxidation systems維他命C氧化系統ascorbateoxidation system(Fe3+，O2and ascorbate)和硫氧化系統thiol oxidation system(Fe3+，O2and RSH)〕，除此之外，過氧化還原酶Prx尚具多種功能轉譯調控，細胞凋零，免疫力和感染力，最顯著的是它的抗氧化性質。Prx依據胺基酸序列，組織分布，和細胞位置至少可分成5大族群(Gourlay，et al.2003)。
活性氧ROS(reactive oxygen speceies)的產生主要是在於呼吸或外在的陽光，輻射和藥物的氧化還原及刺激宿主的吞噬細胞(phagocytes)所造成氧的不完全還原。ROS的增加及氧化壓力的增加，生物均具抗氧化壓力的機制如抗氧化酶和抗氧化分子如SOD、過氧化氫酶(catalase)、過氧化酶(peroxidase)、硫氧化還原蛋白(thioredoxin)和穀胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase)來保護，以免受到ROS的傷害。
過氧化還原酶Prx主要是還原H2O2和烷基過氧化氫(alkyl hydroperoxide)成為水和醇類(Jeon and Ishikawa，2003)。細胞也會產生活性硫(reactive sulfurspecies，RSS)如亞硫醯自由基(thinyl radicals，RS)，二硫自由基陰離子(disulfideradical anions，RSSR)和過氧磺胺自由基(peroxysulfenyl radicals，RSOO.)。Prx也能排除活性硫，以避免活性硫造成的傷害。
樟芝(Antrodia camphorata)又名牛樟芝、牛樟菇(臧和蘇，1990)，報導指出對肝腫瘤及子宮頸腫瘤的治療非常有效，因只能在臺灣牛樟樹生長，故民間視樟芝為珍寶。因樟芝是菇類唯一能代謝牛樟樹中大量抑菌性黃樟素而能生長的菇類，因有不同於他種菇類的生理機能。樟芝在民間傳統療法上最主要應用於食品中毒，腹瀉、下腹部疼痛、皮膚癢及肝癌等症狀。在眾多具有生理活性的成分中，抗氧化物特別受到重視，因此針對其抗氧化成分，其抗氧化成分的分析，在深層培養(A.camphorata in submerged culture)中被詳細的研究，指出在樟芝菌絲體的萃取液中，三萜類對於脂質的過氧化作用具有抑制的功能，三萜類與多酚化合物對於清除氧自由基有非常重要的作用(Song and Yen，2002)。由於樟芝中含有大量且成分複雜的抗氧化成分，因此一系列通過提高抗氧化效果而達到保護正常細胞或毒殺癌化細胞的機制，也陸續做了研究。以樟芝菌絲體甲醇萃取物在低劑量下，對肝腫瘤細胞株Hep G2有很強的細胞毒殺作用，其次為水萃取部分，但發酵濾液則幾乎不具毒殺性。以C57BL/6和BALB/c兩種小鼠進行試驗，結果顯示鼠血中TNF-a、IFN-γ和IL-2皆明顯增加，而IL-4和IL-10則與控制組無明顯差異。此外，樟芝菌絲體發酵過濾液利用其抗氧化物與清除自由基的能力，有保護其肝功能正常的效果。透過樟芝菌絲體萃取液的處理，可避免人類正常的紅血球細胞中的GSH與ATP的消耗，並對白血病leukimia HL-60細胞產生細胞毒性，顯示樟芝菌絲體可能具有抗氧化物與抑制腫瘤的效應(Hseu，et al.，2002)。樟芝對於肝功能的疾病療效十分良好，其多糖體對於B型肝炎病毒有明顯的抑制效果。在已發表的菇類多糖體中，樟芝為第一個被證實其多糖體對於B型肝炎病毒有直接抑制效果的物種(Lee，et al.，2002)。但關於樟芝子實體的研究報告較少，其療效應高於菌絲體，故以新鮮樟芝子實體為材料。
SOD和抗氧化相關基因常因來源不同使其蛋白質的穩定性和活性不同，但樟芝子實體SOD和抗氧化相關基因產物所知甚少，即使其它生物，尤其上述抗氧化相關基因，也是近幾年的報告，因此值得將樟芝子實體SOD和抗氧化相關基因作系統的研究。
以採自臺灣地區的南投縣鹿谷鄉的新鮮樟芝子實體為材料，抽取RNA，合成cDNA。藉由EST序列信息設計引子，用樟芝子實體cDNA為模板，以PCR增生SOD和Prx DNA並進行篩選，篩得樟芝子實體SOD和Prx的片段DNA，再進行5′RACE和3′RACE，最後得到全長Mn-SOD和1-Cys Prx，2-Cys Prx的cDNAs，繼之與表現型載體連接，植入E.coli和酵母菌進行大量生產並純化。SOD和Prx基因產物均為蛋白質，分子量介於41～16kDa之間，而如何植入真核細胞是另一大考驗，因此在N端分別接上幾個胺基酸(Tat)，則Tat-SOD，-Prx產物將容易植入真核細胞以發揮其功能。可應用於美白淡斑化妝品，或添加在燙傷藥膏中。

發明內容
本發明提供一種樟芝抗氧化酶的蛋白質與核酸，及製造該蛋白質的載體、宿主細胞及方法，與含該蛋白質的組成物。
本發明由新鮮樟芝子實體的選殖並選擇表現至少一種抗氧化酶(Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx)。該酶蛋白可去除過氧化物並因此可應用於化妝品、燙傷藥膏及皮膚移植等。
蛋白質本發明是關於一種抗氧化酶蛋白質，其選擇包含序列辨識編號如序列表1至3所示的序列辨識編號1至6〔SEQ ID NO1～6〕的胺基酸序列。根據本發明，凡具有與本發明樟芝抗氧化酶蛋白質及其基因相同的去自由基與過氧化物功能的相似物也包含於本發明的範圍內。如本文所使用，詞語″去自由基與過氧化物的功能相似物″為一具有與本發明樟芝抗氧化酶蛋白質的去自由基與過氧化物功能相同的蛋白質。較佳的，本發明蛋白質包含如序列辨識編號SEQ ID NO1～6所示的胺基酸序列。
根據本發明的較佳具體實施例，選殖出具有去自由基與過氧化物活性的抗氧化酶蛋白質，其具有序列辨識編號1～6的胺基酸序列，分別實質包含229，223與188個胺基酸。將本發明樟芝抗氧化酶胺基酸序列與其它物種的Mn-SOD，Prx序列加以比較，本發明樟芝抗氧化酶應屬於Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx。此外本發明也發現樟芝抗氧化酶蛋白質具有良好的比活性，pH值安定性，熱安定性，蛋白酶安定性及化學藥劑安定性。例如本發明樟芝抗氧化酶蛋白質具下列特性本發明樟芝抗氧化酶的Mn-SOD酶比活性約為5320U/mg；在80℃加熱7分鐘後，仍能維持相當高(約50％)的活性；經5.4～11.0的pH值處理，對其活性無影響；經2％SDS或0.8M濃度的咪唑(imidazole)處理，蛋白質或活性都沒有明顯改變；加入酶液量1/20的]胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)或胰蛋白酶(trypsin)，在37℃下反應3h後，進行電泳分析，經蛋白質染色及活性染色的結果發現蛋白質或活性都沒有明顯改變。
本發明樟芝抗氧化酶的1-Cys Prx在60℃加熱16min後，仍能維持37％的活性；經5.4～11.0的pH值處理，對其活性無影響；1.6M濃度的咪唑處理，仍能維持14％的活性；加入酶液量1/20的胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶，在37℃下反應20min之後，仍能維持15％的活性。
本發明樟芝抗氧化酶的2-Cys Prx在60℃加熱2min後，仍能維持相當高(約68％)的活性；經5.4～11.0的pH值處理，對其活性無影響；經2％SDS或0.4M濃度的咪唑處理，仍能維持相當高(約50％)的活性；加入酶液量1/20的胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶，在37℃下反應3h後，仍能維持相當高(約50％)的活性。
再有，根據本發明，樟芝抗氧化酶蛋白質的製備是在可容許該蛋白質表現的條件下，培養包含編碼本發明蛋白質的核酸分子的宿主細胞及回收該蛋白質。
核酸本發明提供一種分離核酸分子，包含編碼具SEQ ID NO1～6(見序列表1～6)所示樟芝抗氧化酶蛋白質胺基酸序列的核酸序列。本文所使用的詞語″核酸分子″意指包括DNA分子(如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(如mRNA)、使用核酸同類物所產生的DNA或RNA同類物及其衍生物、片段及同源物。核酸分子可為單股或雙股，但以雙股DNA較佳。本文所使用的詞語″分離核酸″分子意為分離存在於天然物質的其它核酸。
根據本發明，核酸可僅包含編碼樟芝抗氧化酶蛋白質生物活性的部分片段。本文所使用的語詞″片段″意指編碼仍具生物活性的樟芝抗氧化酶蛋白質片段的核苷酸序列部分。
根據本發明的一較佳具體實施例中，本發明分離核酸分子具有SEQ IDNO1～6的核苷酸序列(見序列表中第1、第3、第5個序列)或其簡併序列(擺動假說，Wobble hypothesis)。在另一較佳具體實施例，本發明分離核酸分子包括如SEQ ID NO1(Mn-SOD)所示的核苷酸序列，其全長為891，轉譯區有687bp，可以轉譯出229個胺基酸。SEQ ID NO3(1-Cys Prx)所示的核苷酸序列，其全長為837，轉譯區有669bp，可以轉譯出223個胺基酸。SEQ ID NO5(2-Cys Prx)所示的核苷酸序列，其全長為939，轉譯區有564bp，可以轉譯出188個胺基酸。本發明核酸分子與其它來源的序列比較，有高的相似性。本發明核酸所編碼的樟芝抗氧化酶蛋白質可將O2·-還原成H2O2和將過氧化物如H2O2，t-butylperoxide，cumenene peroxide等還原成水和醇類，提供了生物體抵抗毒性氧所帶來的破壞與傷害。本領域技術人員，基於基因密碼的簡併性(擺動假說)，可製得許多編碼本發明樟芝抗氧化酶蛋白質的核酸。因此，針對一已被鑑定的特定胺基酸序列，本領域技術人員可在不改變樟芝抗氧化酶蛋白質的胺基酸序列的情況下，借簡單修飾一或多個密碼而制出各種不同核酸。
根據本發明，編碼樟芝抗氧化酶蛋白質的核酸可使用標準雜交及選殖技術來分離。特別的，本發明核酸可使用標準選殖及篩選技術，自新鮮樟芝子實體的cDNA庫分離出來。本發明核酸的放大(amplification)可根據標準PCR放大技術，使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板及適當的寡核苷酸引子而得。經放大的核酸可選殖至適當載體並借DNA序列分析來鑑定。
表現載體及宿主系統本發明還提供一表現載體，包含本發明的核酸。本發明表現載體包含一編碼如SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5所示的蛋白質核酸序列。
本文所使用的詞語″表現載體″是可直接表現連接至其上的基因核酸分子。較佳的載體為可自行複製及表現連接於其上的核酸。一般而言，可用於重組DNA技術的表現載體通常為″載體″形式，一般為環狀雙股的DNA，在其為載體形式時並未融合至染色體。
本發明編碼抗氧化酶蛋白質或其功能相似物的核酸序列可插入適當的表現載體中以表現具生物活性的抗氧化酶蛋白質。該表現載體需含有插入編碼序列的轉錄及轉譯等必要組件。根據本發明，本領域技術人員可利用熟知的方法構築含有編碼抗氧化酶蛋白質及適當轉錄及轉譯控制組件的表現載體。此等方法包括體外重組DNA技術，合成技術及體內基因重組技術等。
本發明另一目的是提供包含表現載體的宿主細胞，該載體包含編碼抗氧化酶蛋白質的核酸序列。本文所使用的詞語″宿主細胞″為可經載體(如質體)感染的宿主細胞。根據本發明，許多宿主系統可用於包含且表現編碼抗氧化酶蛋白質的序列。此等宿主系統包括但不限於微生物(如以重組質體或表現載體轉形的細菌)、酵母菌(如以酵母菌表現載體轉形的酵母菌)、或動物細胞系統。本發明的宿主細胞為大腸桿菌及酵母菌。本發明將抗氧化酶蛋白質的cDNA在大腸桿菌或酵母菌系統表現，確實能表現出具有活性的重組蛋白質，經親和性管柱進行快速純化後，獲得純的抗氧化酶蛋白質。
根據本發明的一具體實施例本發明樟芝抗氧化酶的Mn-SOD是以pYEX-S1為表現型載體的構築；設計N端含限制Eco RI片段(5』GGAATTCGATG TCC ATG CTC AGT ACT GCT C3』)與C端引子含6His-tag片段及Eco RI片段(5』GGAATTCCTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG TTT CTG TGC AGCTTC GAC GTA G 3』)，以抗氧化酶蛋白質的cDNA為模板與引子進行PCR得到的DNA。將該DNA送入大腸桿菌中進行篩選，抽取的質體DNA是使用限制酶Eco RI處理，所得片段與相同限制酶處理過的pYEX-S1接合，送入酵母菌(yeast)，並以介質YPD medium(1％酵母提取物yeast extract，2％蛋白腖peptone，2％葡萄糖glucose)在30℃下培養5D(170rpm)，打破菌體，以10,000xg離心5min，收集上清液後，經親和性管柱進行快速純化後。電泳後作蛋白質染色，經12.5％SDS-PAGE，於25kDa處可看到明顯色帶，此即為抗氧化酶蛋白質。為方便抗氧化酶蛋白質穿過細胞膜，可在前端接上含有九個胺基酸的Tat，並將接上Tat的抗氧化酶蛋白質DNA送入酵母菌中進行表現。
本發明樟芝抗氧化酶的1-Cys Prx也以pYEX-S1為表現型載體；設計N端含限制酶Eco RI片段(5』GGAATTCG ATG CCT AGC CTC CGC CTT GGA 3』)與C端引子含6His-tag片段及Eco RI片段(5』GGAATTCCTCA GTG GTG GTGGTG GTG GTG TAC GTT GAG AGG GGT GGT TCG 3』)，以1-Cys Prx的cDNA為模板與引子進行PCR得到的DNA。其餘步驟與Mn-SOD相同。
本發明樟芝抗氧化酶的2-Cys Prx也以pYEX-S1為表現型載體；設計N端含限制酶Eco RI片段(5』GGAATTCG ATG GTC GCC ATC GTC CAG AA3』)與C端引子含6His-tag片段及Eco RI片段(5』GGAATTCCTA GTG GTG GTG GTGGTG GTG CCA TGT TCG TCC TTT TAA ACG G 3』)，以2-Cys Prx的cDNA為模板與引子進行PCR得到的DNA。其餘步驟與Mn-SOD相同。
醫藥組成物本發明還包括一種醫藥組成物，其包含本發明的蛋白質。除本發明蛋白質外，該醫藥組成物可含有適當的醫藥上可接受的載劑。
本發明的醫藥組成物可以本領域已知的方式(例如利用常用方法)製造，該常用方法包括混合、溶解、制粒、制錠、磨細、乳化、包膠、包陷及/或冷凍乾燥等步驟。
本發明的醫藥組成物可借任何途徑投藥，這些途徑包括(但不限於)口服、靜脈內、肌內、動脈內、穿皮、皮下、腹膜腔內、鼻內或腸道給藥。
實用性本發明來源於樟芝的樟芝抗氧化酶蛋白質，其活性皆比其它來源的抗氧化酶蛋白質為佳。因此，本發明樟芝來源的樟芝抗氧化酶蛋白質在醫學、食品、學術研究等方面更具利用價值及貢獻。
本發明樟芝抗氧化酶蛋白質可將O2·-還原成H2O2和過氧化物如H2O2，t-butylperoxide，cumenene peroxide等還原成水和醇類，提供生物體抵抗過氧所帶來的破壞與傷害的能力。本發明抗氧化酶蛋白質應用於化妝品，可去除黑斑、雀斑及防止皺紋；添加於燙傷藥膏可加速傷口癒合；在整形外科的皮膚移植及人造皮移植應用中，可藉由抗氧化酶蛋白質防止移植皮膚的組織壞死，進而加速移植皮膚的縫合。
序列1為樟芝子實體第一種抗氧化酶蛋白質(Mn-SOD)的核苷酸序列，全長為891bp；轉錄區為687bp；編碼區域為229個胺基酸殘基。
序列3為樟芝子實體第二種抗氧化酶蛋白質(1-Cys Prx)的核苷酸序列，全長為837bp；轉錄區為669bp；編碼區域為223個胺基酸殘基。
序列5為樟芝子實體第三種抗氧化酶蛋白質(2-Cys Prx)的核苷酸序列，全長為939bp；轉錄區為564bp；編碼區域為188個胺基酸殘基。
具體實施例方式下列實施例進一步說明本發明，但非欲限制本發明的範圍，任何本領域技術人員所知的替代和改變，均包含於本發明的範圍中，而不偏離本發明的精神和目的。
樟芝抗氧化酶(Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx)cDNA的選殖由新鮮樟芝子實體總RNA的抽取、cDNA的合成並建立cDNA庫和EST序列信息、藉由EST序列信息設計引子，用樟芝cDNA為模板，以PCR增生抗氧化相關DNA並進行篩選，再進行RACE，最後得到全長抗氧化酶cDNA。
樟芝子實體總RNA的抽取取4g樟芝子實體以液態氮急速冷凍，於研缽中磨成粉末後取出，馬上與20M1的溶解緩衝液(lysis buffer)(Novalgen’s Straight’s mRNA Isolation System)於30mL離心管中混合，置於4℃下5min後以9,000xg在4℃離心15min，離心後取上面水溶液層，大約有20mL。將水溶液吸至50mL Falcon中加入3mg磁化顆粒(magnetight particles)混勻，置於4℃下以磁座吸住磁化顆粒(magnetightparticles)，以1.5mL wash buffer洗滌三次，在60℃以0.5mL水洗離即為RNA(10ug)，加入0.1 vol.3 M醋酸鈉(sodium acetate)和0.8vol.異丙醇(isopropanol)置於-75℃20min，隨後以12,000rpm在4℃下離心15min，以70％乙醇(ethanol)共清洗三次，乾燥後儲存於-70℃備用。
樟芝5』-RACE-Ready cDNA與3』-RACE-Ready cDNA的合成Based on BDBiosciences Clontech’s SMART RACE cDNA Amplification Kit.
5』-RACE-Ready cDNA將下列所有反應溶液加入於1.5mL的微量試管中並在冰上完成mRNA(ug/uL)(1ug) 1uL5』-CDS primer 1uLSmart II A Oligo 1uLH2O 2uL總計 5uL3』-RACE-Ready cDNAmRNA(ug/uL)(1ug) 1uL3』-CDS primerA1UlH2O 3uL總計 5uL小心均勻混合反應溶液，並稍微離心後置於72℃恆溫水浴槽中2min。作用後將離心管置於冰上2min。加入2uL 5X first-strand buffer，1uL 20mM DTT，1uL 10mM dNTP混合，1uL powerscript reverse transcriptase於42℃恆溫水浴槽中1.5h。後加入200uL tricine-EDTA buffer於72℃恆溫水浴槽中7min後儲存於-70℃備用。
樟芝抗氧化酶Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx基因的選殖藉由樟芝EST序列信息設計引子，用樟芝5』-RACE-Ready cDNA與3』-RACE-Ready cDNA為模板，以PCR增生抗氧化相關基因DNA並進行篩選，得樟芝抗氧化基因的片段DNA，再進行5′RACE與3』-RACE，最後得到全長抗氧化酶的cDNA。
Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx cDNA的表現經由PCR、膠體的製備及電泳、次選殖(subcloning)、在酵母菌表現型載體(pYEX-S1)的構築、及蛋白質的誘發與樣品的電泳分析等程序達成。
PCR程序將下列反應試料加至0.5mL微量試管中，依序加入下列試劑模板DNA 0.2ug5′-正義引子10pmol3′-反義引子10pmol10X Taq DNA聚合酶緩衝液 5uL15mM MgCl26uLTaq DNA聚合酶 2.5units10mM dNTP 1.5uL加入無菌水至總計50uL加入50～100uL礦物油，進行25 cycles of PCR(94℃ for 30min，50℃for 30min，72℃for 1.5min)PCR反應結束後，可得DNA產物，經回收後可用來進行下一步的實驗，例如進行DNA重組，分析其序列。
膠體的製備及電泳所用的膠體為1.0％瓊脂糖膠，倒入1X TAE緩衝液以能完全覆蓋住膠為原則。取15uL PCR產物，加上其1/10體積的追蹤染劑(0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯藍FF，30％甘油於水中)，注入孔中，另外也注入6uL的1kb DNA標記用來了解DNA樣品的大小，接著以100伏特的電壓進行電泳，待DNA染料移動至膠的2/3處，即可中止電泳。將完成電泳的膠以溴乙啶(EtBr)染色15min後，放入水中退染，之後即可置於紫外光源箱下觀察，另外也以拍立得照相。
次選殖1.PCR產物與載體接合與宿主細胞轉形取1uL PCR產物，加入1uL鹽溶液，1uL的無菌水與0.5uL的pCR4之後，於室溫下反應5min以進行連接。取前述已接合好的重組DNA，加入18uL TOPO10活性細胞中，置於冰上30min，後置於42℃的水浴中30sec進行熱休克後立即置於冰上2min，加入150uL SOC培養基，在37℃下振蕩培養60min，將其均勻塗布在含有50ug/mL抗生素氨苄青黴素(ampicillin)的LB瓊脂糖的培養皿，在37℃培養12-16h之後，挑選50-80個單一菌株置於新的ampicillin的LB瓊脂糖上，待進一步實驗。
2.菌體的轉印與放射性探針的製備將轉印紙覆於培養皿表面，並以針頭扎洞作定位之後，輕輕取出轉印紙，此時培養皿上的菌落(colony)轉印到轉印紙上，轉印工作完成。準備一淺盤，上覆3mm濾紙，倒入變性溶液(0.5M NaoH，1.5M NaCl)，倒入量以能充分溼潤3mm濾紙為原則，將轉印紙以吸附菌面朝上，放在溼潤的3mm濾紙之上7min，接著取另一淺盤以中和溶液(1MTris-HCl，1M NaCl，pH7.5)充分溼潤3mm濾紙之上7min。重複中和液步驟之後，將轉印紙置於烘箱中，以60-70℃烘乾，需時40min。之後，將轉印紙放於紫外交聯儀機器(Amersham)中，進行網狀連結15sec後，待進一步以放射性探針來篩選。
放射性探針的製備寡核苷酸(3pmole/uL)0.5uL10X T4聚核苷酸基酶緩衝液 3.0uL聚核苷酸基酶(12unit) 1.5uL[r-32p]ATP 3.5uLH2O 21.5uL總計 30.0uL混合均勻，置於37℃下反應30min後。即完成放射性探針的製備，將放射性探針加入雜交溶液中，用來篩選所要的目標基因。
3.目標基因DNA的選殖取出前述經網狀連結的轉印紙，加入以1.5X SSC及0.1％SDS配製成的洗劑，在44℃下震搖30min，倒掉洗劑，加入不含放射性探針的雜交溶液(5X SSC，5X Denhardt溶液，0.5％SDS，100ug/mL鮭魚精子DNA)，目的為去除一些非特異性的結合，以降低背景值，此一過程稱為預雜交。倒出雜交溶液，加入含有放射性探針的雜交溶液，置於44℃水浴震搖16h以上，倒出含有放射性探針的雜交溶液，用前述洗劑，在44℃震搖15min，重複此一步驟2-4次。壓幹轉印紙，進行自動放射顯影，衝片後，挑出正反應株。
4.細菌質體的純化與檢視挑出正反應株培養於含ampicillin(50ug/mL)的LB，於37℃下培養6-8h。以10,000xg離心3min，取得菌體沉澱物，加入200uL再懸浮溶液(50mM Tris，pH7.5，10mM EDTA)振蕩，使菌體懸浮狀態。加入200uL溶裂液(0.2M NaOH，1％SDS)，輕輕的混勻，使菌體能被完全溶掉，質體能溶離出來。加入200uL中和液(1.32M醋酸鉀)，小心的混勻，而後以12,000xg離心10min，取上清液，注於0.5mL離心管(含DNA吸附膜)，以12,000xg離心1min，使DNA能吸附於膜上，之後加入700mL的洗滌溶液，以12,000xg離心2min後。再以12,000xg離心2min以去除殘留的酒精，最後加入50uL的熱水(60℃)靜置30sec後，以12,000xg離心2min，收集離心下來的質體DNA作質體的限制酶反應與電泳分析。即取DNA以及適量的限制酶，加上10 x reactin緩衝液，最後加無菌水使體積為10uL，在適當的溫度下反應2h，以1％瓊脂糖膠電泳分析，以確定嵌入DNA的大小。
5.序列的判讀利用ABI PRISM 377-96DNA定序儀進行自動定序。
在酵母菌表現型載體的構築表現載體為pYEX-S1，Mn-SOD是以pYEX-S1為表現型載體的構築；設計N端含限制酶Eco RI片段(5』GGAATTCG ATG TCC ATG CTC AGT ACT GCTC3』)與C端引子含6His-tag片段及Eco RI片段(5』GGAATTCCTA GTG GTGGTG GTG GTG GTG TTT CTG TGC AGC TTC GAC GTA G 3』)，以抗氧化酶蛋白質的cDNA為模板與引子進行PCR得到的DNA。將該DNA送入大腸桿菌中進行篩選，抽取的質體DNA是使用限制酶Eco RI處理，所得片段與相同限制酶處理過的pYEX-S1接合，送入yeast，並以YPD medium(1％yeast extract，2％peptone，2％glucose)在30℃下培養5D(170rpm)，打破菌體，以10,000xg離心5min，收集上清液後，經親和性管柱進行快速純化後。電泳後作蛋白質染色，經12.5％SDS-PAGE，於25kDa處可看到明顯色帶，此即為抗氧化酶蛋白質。更好的，為方便抗氧化酶蛋白質穿過細胞膜，可在前端接上含有九個胺基酸的Tat，並將接上Tat的抗氧化酶蛋白質DNA送入酵母菌中進行表現。
1-Cys Prx也以pYEX-S1為表現型載體；設計N端含Eco RI片段(5』GGAATTCG ATG CCT AGC CTC CGC CTT GGA 3』)與C端引子含6His-tag片段及Eco RI片段(5』GGAATTCCTCA GTG GTG GTG GTGGTG GTG TAC GTT GAG AGG GGT GGT TCG 3』)，以1-CysPrx的cDNA為模板與引子進行PCR得到的DNA。其餘步驟與Mn-SOD相同。
2-Cys Prx是以pYEX-S1為表現型載體；設計N端含限制酶Eco RI片段(5』GGAATTCG ATG GTC GCC ATC GTC CAG AA3』)與C端引子含6His-tag片段及Eco RI片段(5』GGAATTCCTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CCA TGTTCG TCC TTT TAA ACG G 3』)，以2-CysPrx的cDNA為模板與引子進行PCR得到的DNA。其餘步驟與Mn-SOD相同。
將其轉殖入酵母菌[trp--ada---ura---]作為表現宿主。pYEX-S1(均先以Eco RI處理連接)，取前述已接合好的重組DNA，加入酵母菌活性細胞中，篩選挑出正反應株以進行蛋白質表現。
在酵母菌轉形1.製備轉形細胞(1)方法1選取單一菌落並完全的在YPD培養皿上劃線，在28-32℃培養8～96h，從細菌培養基表層刮取菌，加入Yeastern商品SCOS混合液至110μL使試管中細菌濃度達5×107個/試管。
(2)方法2選取單一新鮮菌落加入1～10mL YPD培養液中，於28-32℃搖晃培養20～30h。將培養液加入10～100mL YPD培養液中靜置8-24h，以2000xg離心10min，去掉上清夜，以無菌水清洗兩次去除殘餘的YPD培養液，將沉澱物混合攪拌入110-115μL SCOS混合液直至細菌濃度達5×107個/試管。
2.製備SCOS混和液在1.5mL試管中加入100μL SCOS緩衝夜，加入5μL 1M DTT(保存於-20℃)，加入5μL ss DNA(保存於-20℃)，加入質體DNA(不超過5μL)。
3.製備乾式選擇性培養皿完全乾燥的培養皿在Yeastern’s SCOS轉形系統中可提供良好的轉形反應，因此建議在將培養皿迭置前先將無蓋培養皿置於無菌操作臺內1h左右，待其完全乾燥。
4.SCOS轉形(1)將SCOS混合液與酵母菌懸浮細胞混合攪拌製成SCOS轉形混合液。
(2)將試管加蓋，置於45.5℃10～60min。
(3)將轉形混合液直接塗敷於乾燥培養皿[YNBD(1.7g yeast nitrogen base，5g硫酸氨，20g葡萄糖，15g瓊脂糖溶於1L水)含有20ug Trp/mL]，此程序20sec內完成，將培養皿置於28-32℃下2～4天。
蛋白質表現取單一菌落(1～2mm)於10mL YWAAND(1.7g yeast nitrogen base，5g天冬醯胺酸，20g葡萄糖in one liter)含有20ug Trp/mL培養液，此容器使用125mL燒瓶，並於30℃培養箱中以250rpm震蕩培養過夜，次日再加入5mL培養液使OD600達到0.1時並繼續以30℃、250rpm震蕩培養72h後，再加入10mLYPD並繼續以30℃、250rpm震蕩培養48h。
將所有菌液以5000xg、4℃離心10min，收取菌加入0.5g玻璃球及2mLPBS(pH8.0)，打破菌體，以10,000xg離心5min，收集上清液後，再加入2mL緩衝液，重複此一萃取步驟，最後用2mL緩衝液再萃取一次，一共收集6mL上清液，此為粗蛋白質樣品，待進一步的電泳，電泳的膠體大小為10cm×8cm×0.75mm。
1.電泳膠體的製備將鋁板與玻板拭淨後，和隔條(spacer)組合好，放入制膠模型中，再依下表所列的用量配製膠體溶液分離凝膠，混勻並注入模型中，再加入適當的水壓平，約經過1h，膠體形成後，移去水層，再注入堆積凝膠，並插上槽梳，待成膠即可。
2.電泳取適量樣品與樣品載入緩衝液混勻後注入膠體孔洞中，以100伏特電壓進行電泳，native-PAGE約需65min，SDS-PAGE約需130min後中止電泳，小心取下膠體，進行考馬斯藍〔Coomassie blue〕染色將膠體浸於染劑中，均勻搖動30min，移去染劑，用無菌水清洗一次後，加入退染劑，退染12h即可。
3.膠體的乾燥將欲乾燥的膠體浸於10％甘油溶液中30min，取一玻板及兩張配合玻板大小的玻璃紙，用水充分溼潤玻璃紙，後將其中的一張平鋪於玻板上，再放上所要乾燥的膠體，最後鋪上另一張玻璃紙，用塑料夾固定，置於室溫下陰乾。
4.Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx的純化因C端帶有6個His，以Ni2+-nitrilotriacetic acid Sepharose superflow來進行親和性管柱純化，方法如下3mL的樹脂管柱，用5vol.的PBS平衡，之後將6mL的粗蛋白質樣品注入並收集流下來的液體(pass through)約6mL。再以3vol.PBS含20mM imidazole洗管柱，繼之以1.5mL PBS含100mM imidazole衝提，共收集6個部分，其中有2個部分共3mL有收集到蛋白質，因為含有imidazole，所以需經過透析除去。
透析液將樣品約3mL裝入透析膜中，以透析夾夾好，放入含200mL 1/3PBS含有1mM DTT and 5％glycerol透析液的燒杯中，於4℃下透析4h以上，重複此透析步驟即可分裝待進一步分析。
5.Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx的蛋白質含量先製作蛋白質標準曲線(BSA standard curve)即分別取蛋白質標準品(BSA，0.5mg/mL)1、2、3、4、5、6uL於其所對應的滅菌水中，使最後體積達800uL，之後分別加入呈色劑200uL室溫下反應5min，測OD595nm並依吸光值求出蛋白質標準曲線。將採收的樣品依相同方法測得吸光值即可由標準曲線求得蛋白質含量。
6.活性測定Mn-SOD(1)首先將完成電泳的膠體，浸泡於21.6mL 2.5mM NBT(nitroblue tetrazolium)的水溶液中，避光搖動15min，移去NBT溶液，以去離子水清洗膠體後，再浸泡於21mL含有8×10-5M核黃素(riboflavin)及30mM TEMED的水溶液中，照光搖動，呈現透明亮帶的區域為具有SOD活性之處。此法為利用riboflavin及光照條件下與TEMED反應，作為產生超氧的系統，NBT作為呈色劑(chromogenic reagent)。有SOD存在的膠體區域，超氧被分解，NBT不發生還原反應，而呈現透明的亮帶。無SOD存在的區域，超氧與NBT發生還原反應，而生成藍紫色的formaza(Beauchamp and Fridovich，1971)。
(2)依據RNASOD kit(Ardmore，UK)，取不同的稀釋度S1～S6；S10.05mLMn-SOD標準品(5.9U/mL)，加入1.7mL的混和基質(含0.05mM xanthine，0.025mM INT[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium chloride]，0.94mM EDTA，50mM CAPS buffer，pH10.2)。混和均勻後，加入0.25mLxanthine oxidase(0.02U)，混勻於37℃反應，分別在30sec及3min時，測定其在波長595的吸光值A1及A2，依據下列公式計算出抑制百分率後，以標準品的活性取對數作為橫軸，抑制百分率作為縱軸，經過線性回歸後，得到標準曲線。
(A2-A1)/2.5＝ΔAstandard or sample/min100-(ΔAstandhard or sample/min×100)/ΔAS1/min＝％inhibition取適量純化的酶與標準品的測定方法相同，得到反應時間30sec及3min在波長595nm吸光值的變化，並換算成抑制百分率，對照標準曲線，即可求出蛋白質樣品(sample)的SOD活性(U/mg)。
1-Cys Prx，2-Cys Prx活性測試先製作H2O2，t-butylperoxide和cumenene peroxide標準曲線即分別取H2O2，t-butylperoxide和cumenene peroxide標準品(1mM)各1、2、4、8、16uL於其所對應1/3PBS containing(5％glycerol and 1mM DTT)中，使最後體積達50uL，之後加入20uL 26.3％TCA，接著加入20uL 10mM Fe2+，最後加入10uL 2.5MKSCN，總體積100uL，測定OD475nm吸光值並依吸光值求出H2O2，t-butylperoxide和cumenene peroxide標準曲線。將採收的樣品依相同方法測得吸光值即可由標準曲線求得蛋白質在微量離心管中清除過氧化物(peroxide)的能力即微量離心管中加入1/3PBS含有(5％甘油和1mM DTT)，適量1mM H2O2和適量酶(enzyme)總體積達到50uL，室溫下反應10min，即加入20uL 26.3％TCA，接著加入20uL 10mM Fe2+，最後加入10uL 2.5M KSCN，總體積100uL，測定OD475nm吸光值。
7.Mn-SOD，1-Cys Prx，2-Cys Prx性質熱穩定性分別取適量酶液於1.5mL試管中，各5管，分別於80℃(for Mn-SOD)，60℃(for 1-Cys Prx)，60℃(for 2-Cys Prx)加熱0、2、4、8、16min後，置於冰上，進行15％Native-gel電泳，分別作蛋白質染色(1.5ug/Mn-SOD，3.6ug/1-Cys Prx，2ug/2-Cys Prx)及活性測試(1.5ug/Mn-SOD，1.8ug/1-Cys Prx，1ug/2-Cys Prx)。結果顯示此酶非常安定，Mn-SOD在80℃加熱其活性減少一半所需時間為7min，其降解常數為1.02×10-1min-1。
pH的影響分別取適量酶液，於1.5mL試管中，共6管，加入不同pH值緩衝液0.2M檸檬酸鈉緩衝液(pH2.3、or 5.4)，0.2M Tris-Hcl緩衝液(pH7.8、or 9.0)，0.2M甘氨酸NaOH緩衝液(pH10.4 or 11.2)，在37℃下反應1h後，置於冰上，分別進行15％Native-gel電泳後作蛋白質染色(1.5ug/Mn-SOD，3.6ug/1-Cys Prx，2ug/2-Cys Prx)及活性測試(1.5ug/Mn-SOD，1.8ug/1-Cys Prx，1ug/2-Cys Prx)。結果顯示此酶非常安定，顯示以酸鹼處理很安定，尤其至pH8～pH11處理1h對酶活性並沒有影響。
SDS的影響分別取適量酶液，於1.5mL試管中，共5管，分別加入不同量的20％SDS，使SDS最終濃度為0、1、2、3、4％，在37℃下反應1h後，分別進行15％Native-gel電泳後作蛋白質染色(1.5ug/Mn-SOD，3.6ug/1-Cys Prx，2ug/2-Cys Prx)及活性測試(1.5ug/Mn-SOD，1.8ug/1-Cys Prx，1ug/2-Cys Prx)。結果顯示Mn-SOD以SDS的處理也很安定，濃度高至4％時只抑制23％。
咪唑的影響分別取適量酶液，於1.5mL試管中，共5管，分別加入不同量的咪唑，使咪唑最終濃度為0、0.2、0.4、0.8、1.6M，在37℃下反應1h後，分別進行15％Native-gel電泳後作蛋白質染色(1.5ug/Mn-SOD，3.6ug/1-Cys Prx，2ug/2-Cys Prx)及活性測試(1.5ug/Mn-SOD，1.8ug/1-Cys Prx，1ug/2-Cys Prx)。結果顯示Mn-SOD以咪唑的處理也很安定，必須高至1.6M時對活性才有抑制(70％)。
蛋白酶的影響分別取適量酶液，於1.5mL試管中，共4管，分別加入相當酶液量1/20的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶於Tri-HCl緩衝液(pH8.5含20mM CaCl2)分別在37℃下反應1、2、3h，分別進行15％Native-gel電泳後作蛋白質染色(1.5ug/Mn-SOD，3.6ug/1-Cys Prx，2ug/2-Cys Prx)及活性測試(1.5ug/Mn-SOD，1.8ug/1-Cys Prx，1ug/2-Cys Prx)。結果顯示Mn-SOD以胰蛋白酶的處理很安定，3h後，活性只下降23％。胰凝乳蛋白酶處理也很安定，3h後，活性只下降33％。
雖然本發明已利用前述較佳實施例詳細化開，然其並非用以限定本發明，任何本領域技術人員，在不脫離本發明的精神和範圍內，可作各種的更動與修改，因此本發明的保護範圍當以權利要求書限定的範圍為準。
序列表1606170PatentIn version 3.32101211891212DNA213樟芝(Antrodia camphorata)220
221CDS222(36)..(725)4001ctattcacat ataaaaacca ccgttaactc tcgcc atg tcc atg ctc agt act53Met Ser Met Leu Ser Thr1 5gct cgc acc gct gct cgc aca gcg cgc gcg tcg cgc gct ctc ccc ttt101Ala Arg Thr Ala Ala Arg Thr Ala Arg Ala Ser Arg Ala Leu Pro Phe10 15 20gcc tcg ttc tcg ctc gcc gcg agg gcc aag tcg ctg cac acg ctc cct149Ala Ser Phe Ser Leu Ala Ala Arg Ala Lys Ser Leu His Thr Leu Pro25 30 35gag ctt gac tac gcg tac gat gca ctc gag ccg cac atc tct ggc cag197Glu Leu Asp Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu Pro His Ile Ser Gly Gln40 45 50atc atg aag ctg cac cat aca aag cac cac cag acg tac gtc acc ggc245Ile Met Lys Leu His His Thr Lys His His Gln Thr Tyr Val Thr Gly55 60 65 70ctc aac gcg gcg gag gag agc tac gcc aag gcg ccc tcg ccc aag gag293Leu Asn Ala Ala Glu Glu Ser Tyr Ala Lys Ala Pro Ser Pro Lys Glu75 80 85cgg att ctc ctt cag ccc gcg ctc aaa ttc aat ggc gga ggt cac atc341Arg Ile Leu Leu Gln Pro Ala Leu Lys Phe Asn Gly Gly Gly His Ile90 95 100aat cac tcg ctc ttc tgg aag aac ctt gcg ccc cag tcg cag ggt ggc389
Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ala Pro Gln Ser Gln Gly Gly105 110 115ggc cag ctc gct gcg ggt ccc ttc aaa gat gca gta gat gct gac ttc437Gly Gln Leu Ala Ala Gly Pro Phe Lys Asp Ala Val Asp Ala Asp Phe120 125 130ggc ggt gtc gat ggc ttg aag aag aaa ttg aac gcg gcg aca gct gcc485Gly Gly Val Asp Gly Leu Lys Lys Lys Leu Asn Ala Ala Thr Ala Ala135 140 145 150atc cag ggc tcc ggt tgg ggc tgg ctt gga tac aat ccg acc act aaa533Ile Gln Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu Gly Tyr Asn Pro Thr Thr Lys155 160 165aag ctt gag gtt gtc aca acc gca aac cag gat cct ctc ctc tct cac581Lys Leu Glu Val Val Thr Thr Ala Asn Gln Asp Pro Leu Leu Ser His170 175 180att ccc ata att ggc atc gac atc tgg gag cac tca tac tat ctt caa629Ile Pro Ile Ile Gly Ile Asp Ile Trp Glu His Ser Tyr Tyr Leu Gln185 190 195tac cag aat gtg aaa gcc gac tac ctc caa gcc atc tgg agc gtc atc677Tyr Gln Asn Val Lys Ala Asp Tyr Leu Gln Ala Ile Trp Ser Val Ile200 205 210aat ttc aag gag gct gag cgc cgc tac gtc gaa gct gca cag aaa taa725Asn Phe Lys Glu Ala Glu Arg Arg Tyr Val Glu Ala Ala Gln Lys215 220 225agtgacgata taacctagag agttcgaaca tgctattgag atgacgtgtc aaagtggcga 785cggaagaatg gcagaagcat gggaggaccc attcgtcgtc gcactactga actgcatttg 845taatatataa cgttccaacg acacgcaatt cgtctcaaaa aaaaaa 8912102211229212PRT213樟芝(Antrodia camphorata)4002
Met Ser Met Leu Ser Thr Ala Arg Thr Ala Ala Arg Thr Ala Arg Ala1 5 10 15Ser Arg Ala Leu Pro Phe Ala Ser Phe Ser Leu Ala Ala Arg Ala Lys20 25 30Ser Leu His Thr Leu Pro Glu Leu Asp Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu35 40 45Pro His Ile Ser Gly Gln Ile Met Lys Leu His His Thr Lys His His50 55 60Gln Thr Tyr Val Thr Gly Leu Asn Ala Ala Glu Glu Ser Tyr Ala Lys65 70 75 80Ala Pro Ser Pro Lys Glu Arg Ile Leu Leu Gln Pro Ala Leu Lys Phe85 90 95Asn Gly Gly Gly His Ile Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ala100 105 110Pro Gln Ser Gln Gly Gly Gly Gln Leu Ala Ala Gly Pro Phe Lys Asp115 120 125Ala Val Asp Ala Asp Phe Gly Gly Val Asp Gly Leu Lys Lys Lys Leu130 135 140Asn Ala Ala Thr Ala Ala Ile Gln Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu Gly145 150 155 160Tyr Asn Pro Thr Thr Lys Lys Leu Glu Val Val Thr Thr Ala Asn Gln165 170 175Asp Pro Leu Leu Ser His Ile Pro Ile Ile Gly Ile Asp Ile Trp Glu180 185 190
His Ser Tyr Tyr Leu Gln Tyr Gln Asn Val Lys Ala Asp Tyr Leu Gln195 200 205Ala Ile Trp Ser Val Ile Asn Phe Lys Glu Ala Glu Arg Arg Tyr Val210 215 220Glu Ala Ala Gln Lys2252103211837212DNA213樟芝(Antrodia camphorata)220
221CDS222(53)..(724)4003acgcggggga gattaatttt tcagccttca tcttcattgc agagacatca tc atg cct58Met Pro1agc ctc cgc ctt gga agc att gcc ccc aat ttt gaa gct gag act acc106Ser Leu Arg Leu Gly Ser Ile Ala Pro Asn Phe Glu Ala Glu Thr Thr5 10 15cag ggt cac att aag ttc cac gac tgg att ggt gat tca tgg gcc atc154Gln Gly His Ile Lys Phe His Asp Trp Ile Gly Asp Ser Trp Ala Ile20 25 30ttg ttc tct cac ccg ggt gac ttc act cct gtc tgt aca acg gag ctg202Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Val Cys Thr Thr Glu Leu35 40 45 50gct gag gtc gca cga aag gct cct gaa ttc gca aag cgc aat gtc aaa250Ala Glu Val Ala Arg Lys Ala Pro Glu Phe Ala Lys Arg Asn Val Lys55 60 65gtt atc ggt atc tct gcc aac gat ctc aat gac cat gag aaa tgg gtg298
Val Ile Gly Ile Ser Ala Asn Asp Leu Asn Asp His Glu Lys Trp Val70 75 80cag gac atc aac gag tat ggg acg aag tcc ctc ggg cct acg aac gtc346Gln Asp Ile Asn Glu Tyr Gly Thr Lys Ser Leu Gly Pro Thr Asn Val85 90 95cag ttt cca att ata gca gac ggg aac agg aag atc tca acc ttg tat394Gln Phe Pro Ile Ile Ala Asp Gly Asn Arg Lys Ile Ser Thr Leu Tyr100 105 110gac atg ttg gat gaa cag gat gct acc aat cgc gat gct aag ggc ctg442Asp Met Leu Asp Glu Gln Asp Ala Thr Asn Arg Asp Ala Lys Gly Leu115 120 125 130ccc ttc acc ata cgc act gta ttt gtg att gac cca aag aag gtc att490Pro Phe Thr Ile Arg Thr Val Phe Val Ile Asp Pro Lys Lys Val Ile135 140 145cgc ctt aca ctt tcc tac cct gct gca act gga cgt aac ttc gac gag538Arg Leu Thr Leu Ser Tyr Pro Ala Ala Thr Gly Arg Asn Phe Asp Glu150 155 160att ttg agg gtc gtc gac tct ctt caa ctt ggg gac aag tac cgt gtc586Ile Leu Arg Val Val Asp Ser Leu Gln Leu Gly Asp Lys Tyr Arg Val165 170 175aca act cct gtg aac tgg cag aaa ggt gat gac gtc att gta cac ccg634Thr Thr Pro Val Asn Trp Gln Lys Gly Asp Asp Val Ile Val His Pro180 185 190tcc gta agc aat gag gag gcg aaa acc ttg ttc cct gag gtt acc ttc682Ser Val Ser Asn Glu Glu Ala Lys Thr Leu Phe Pro Glu Val Thr Phe195 200 205 210cac aag caa tcg tat atc cga acc acc cct ctc aac gta taa724His Lys Gln Ser Tyr Ile Arg Thr Thr Pro Leu Asn Val215 220gtagaacaga tatggatttg ttatcggatc tgtgtaactg tatttgtata agtgatgcaa784tcctgaaacg tttctcattt ccgcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 8372104211223
212PRT213樟芝(Antrodia camphorata)4004Met Pro Ser Leu Arg Leu Gly Ser Ile Ala Pro Asn Phe Glu Ala Glu1 5 10 15Thr Thr Gln Gly His Ile Lys Phe His Asp Trp Ile Gly Asp Ser Trp20 25 30Ala Ile Leu Phe Ser His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Val Cys Thr Thr35 40 45Glu Leu Ala Glu Val Ala Arg Lys Ala Pro Glu Phe Ala Lys Arg Asn50 55 60Val Lys Val Ile Gly Ile Ser Ala Asn Asp Leu Asn Asp His Glu Lys65 70 75 80Trp Val Gln Asp Ile Asn Glu Tyr Gly Thr Lys Ser Leu Gly Pro Thr85 90 95Asn Val Gln Phe Pro Ile Ile Ala Asp Gly Asn Arg Lys Ile Ser Thr100 105 110Leu Tyr Asp Met Leu Asp Glu Gln Asp Ala Thr Asn Arg Asp Ala Lys115 120 125Gly Leu Pro Phe Thr Ile Arg Thr Val Phe Val Ile Asp Pro Lys Lys130 135 140Val Ile Arg Leu Thr Leu Ser Tyr Pro Ala Ala Thr Gly Arg Asn Phe145 150 155 160Asp Glu Ile Leu Arg Val Val Asp Ser Leu Gln Leu Gly Asp Lys Tyr
165 170 175Arg Val Thr Thr Pro Val Asn Trp Gln Lys Gly Asp Asp Val Ile Val180 185 190His Pro Ser Val Ser Asn Glu Glu Ala Lys Thr Leu Phe Pro Glu Val195 200 205Thr Phe His Lys Gln Ser Tyr Ile Arg Thr Thr Pro Leu Asn Val210 215 2202105211939212DNA213樟芝(Antrodia camphorata)220
221CDS222(13)..(579)4005ttgaatacga ct atg gtc gcc atc gtc cag aaa cct gcg ccc gga ttc aag51Met Val Ala Ile Val Gln Lys Pro Ala Pro Gly Phe Lys1 5 10gcc acg gcc gtc gtt gat ggt cag ttc cag gat att tct cta tct gac99Ala Thr Ala Val Val Asp Gly Gln Phe Gln Asp Ile Ser Leu Ser Asp15 20 25tac ttc gga caa tgg gtg gtt ctc ttc ttc tat ccc ctt gac ttc act147Tyr Phe Gly Gln Trp Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr30 35 40 45ttc gta tgc cca act gaa atc ctt gcc ttc aat gac gcc ctt cct caa195Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Leu Ala Phe Asn Asp Ala Leu Pro Gln50 55 60ttc aag gag ctg aac act act gtc ctc agc gtc tca act gat tca cac243Phe Lys Glu Leu Asn Thr Thr Val Leu Ser Val Ser Thr Asp Ser His65 70 75
tac gcg cat ttg gca tgg gcc acg caa gac cgc aag cag ggt ggt ctt291Tyr Ala His Leu Ala Trp Ala Thr Gln Asp Arg Lys Gln Gly Gly Leu80 85 90ggt ccg aac ctc aag ctc ccc atg att gcg gat aag aac acg cag atc339Gly Pro Asn Leu Lys Leu Pro Met Ile Ala Asp Lys Asn Thr Gln Ile95 100 105tca cgc gac tac ggg gtt ttg atc gag gaa gag ggt gtt gct ctt cgc387Ser Arg Asp Tyr Gly Val Leu Ile Glu Glu Glu Gly Val Ala Leu Arg110 115 120 125ggt ctc ttc ttg att gac ccc aag ggt acc ctg agg caa atc aca atc435Gly Leu Phe Leu Ile Asp Pro Lys Gly Thr Leu Arg Gln Ile Thr Ile130 135 140aac gat tta cca gtc ggt cgc tct gtc gat gag acc att cgt ctg atc483Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Ile Arg Leu Ile145 150 155aag gcg ttc cag ttc act gta tgt cga tct acc gtc att tcc att gat531Lys Ala Phe Gln Phe Thr Val Cys Arg Ser Thr Val Ile Ser Ile Asp160 165 170att aac act ggc agc cat act gac cgt tta aaa gga cga aca tgg tga579Ile Asn Thr Gly Ser His Thr Asp Arg Leu Lys Gly Arg Thr Trp175 180 185ggtttgccct gccaactgga cagaaggcgg caagacgatc aaagctgatc ccaagggttc639attggagtat ttttccacag cgggtgcaaa tggtcataca gacgctaaag ggactaccaa699gaagcgtgct cgcgttgact gaggttcatc tgttcattct tggaggctat agaagcaaag759actatgagaa gacgtcgaag actcagactt tgcagctatg gtacaccaac atcttgtgta819tctcacttta tttagacttt ccctgtagat atagagttga cagacagact gctgcttgat879tgcccaatgc taaaaacgac gattcgccgt cattaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa9392106211188212PRT213樟芝(Antrodia camphorata)
4006Met Val Ala Ile Val Gln Lys Pro Ala Pro Gly Phe Lys Ala Thr Ala1 5 10 15Val Val Asp Gly Gln Phe Gln Asp Ile Ser Leu Ser Asp Tyr Phe Gly20 25 30Gln Trp Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys35 40 45Pro Thr Glu Ile Leu Ala Phe Asn Asp Ala Leu Pro Gln Phe Lys Glu50 55 60Leu Asn Thr Thr Val Leu Ser Val Ser Thr Asp Ser His Tyr Ala His65 70 75 80Leu Ala Trp Ala Thr Gln Asp Arg Lys Gln Gly Gly Leu Gly Pro Asn85 90 95Leu Lys Leu Pro Met Ile Ala Asp Lys Asn Thr Gln Ile Ser Arg Asp100 105 110Tyr Gly Val Leu Ile Glu Glu Glu Gly Val Ala Leu Arg Gly Leu Phe115 120 125Leu Ile Asp Pro Lys Gly Thr Leu Arg Gln Ile Thr Ile Asn Asp Leu130 135 140Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Ile Arg Leu Ile Lys Ala Phe145 150 155 160Gln Phe Thr Val Cys Arg Ser Thr Val Ile Ser Ile Asp Ile Asn Thr165 170 175Gly Ser His Thr Asp Arg Leu Lys Gly Arg Thr Trp180 18權利要求
1.一種樟芝抗氧化酶的蛋白質，其屬於樟芝子實體抗氧化酶的蛋白質，其選自樟芝的超氧歧化酶Mn-SOD、過氧化還原酶1-Cys Prx、過氧化還原酶2-CysPrx其中，該樟芝的超氧歧化酶Mn-SOD包含(SEQ ID NO1)所示的胺基酸序列1 CTATTCACATATAAAAACCACCGTTAACTCTCGCC36 ATG TCC ATG CTC AGT ACT GCT CGC ACC GCT GCT CGC ACA GCG CGC GCG TCG CGC1 M S M L S T A R T A A R T A R A S R90 GCT CTC CCC TTT GCC TCG TTC TCG CTC GCC GCG AGG GCC AAG TCG CTG CAC ACG19 A L P F A S F S L A A R A K S L H T144 CTC CCT GAG CTT GAC TAC GCG TAC GAT GCA CTC GAG CCG CAC ATC TCT GGC CAG37 L P E L D Y A Y D A L E P H I S G Q198 ATC ATG AAG CTG CAC CAT ACA AAG CAC CAC CAG ACG TAC GTC ACC GGC CTC AAC55 I M K L H H T K H H Q T Y V T G L N252 GCG GCG GAG GAG AGC TAC GCC AAG GCG CCC TCG CCC AAG GAG CGG ATT CTC CTT73 A A E E S Y A K A P S P K E R I L L306 CAG CCC GCG CTC AAA TTC AAT GGC GGA GGT CAC ATC AAT CAC TCG CTC TTC TGG91 Q P A L K F N G G G H I N H S L F W360 AAG AAC CTT GCG CCC CAG TCG CAG GGT GGC GGC CAG CTC GCT GCG GGT CCC TTC109 K N L A P Q S Q G G G Q L A A G P F414 AAA GAT GCA GTA GAT GCT GAC TTC GGC GGT GTC GAT GGC TTG AAG AAG AAA TTG127 K D A V D A D F G G V D G L K K K L468 AAC GCG GCG ACA GCT GCC ATC CAG GGC TCC GGT TGG GGC TGG CTT GGA TAC AAT145 N A A T A A I Q G S G W G W L G Y N522 CCG ACC ACT AAA AAG CTT GAG GTT GTC ACA ACC GCA AAC CAG GAT CCT CTC CTC163 P T T K K L E V V T T A N Q D P L L576 TCT CAC ATT CCC ATA ATT GGC ATC GAC ATC TGG GAG CAC TCA TAC TAT CTT CAA181 S H I P I I G I D I W E H S Y Y L Q630 TAC CAG AAT GTG AAA GCC GAC TAC CTC CAA GCC ATC TGG AGC GTC ATC AAT TTC199 Y Q N V K A D Y L Q A I W S V I N F684 AAG GAG GCT GAG CGC CGC TAC GTC GAA GCT GCA CAG AAA TAA217 K E A E R R Y V E A A Q K *726 AGTGACGATATAACCTAGAGAGTTCGAACATGCTATTGAGATGACGTGTCAAAGTGGCGA786 CGGAAGAATGGCAGAAGCATGGGAGGACCCATTCGTCGTCGCACTACTGAACTGCATTTG846 TAATATATAACGTTCCAACGACACGCAATTCGTCTCAAAAAAAAAA 891再有，該樟芝的過氧化還原酶1-Cys Prx包含(SEQ ID NO3)所示的胺基酸序列1 ACGCGGGGGAGATTAATTTTTCAGCCTTCATCTTCATTGCAGAGACATCATC53ATGCCT AGC CTC CGC CTT GGA AGC ATT GCC CCC AAT TTT GAA GCT GAG ACT ACC CAG1 M P S L R L G S I A P N F E A E T T Q110 GGT CAC ATT AAG TTC CAC GAC TGG ATT GGT GAT TCA TGG GCC ATC TTG TTC TCT CAC20G H I K F H D W I G D S W A I L F S H167 CCG GGT GAC TTC ACT CCT GTC TGT ACA ACG GAG CTG GCT GAG GTC GCA CGA AAG GCT39P G D F T P V C T T E L A E V A R K A224 CCT GAA TTC GCA AAG CGC AAT GTC AAA GTT ATC GGT ATC TCT GCC AAC GAT CTC AAT58P E F A K R N V K V I G I S A N D L N281 GAC CAT GAG AAA TGG GTG CAG GAC ATC AAC GAG TAT GGG ACG AAG TCC CTC GGG CCT77D H E K W V Q D I N E Y G T K S L G P338 ACG AAC GTC CAG TTT CCA ATT ATA GCA GAC GGG AAC AGG AAG ATC TCA ACC TTG TAT96T N V Q F P I I A D G N R K I S T L Y395 GAC ATG TTG GAT GAA CAG GAT GCT ACC AAT CGC GAT GCT AAG GGC CTG CCC TTC ACC115 D M L D E Q D A T N R D A K G L P F T452 ATA CGC ACT GTA TTT GTG ATT GAC CCA AAG AAG GTC ATT CGC CTT ACA CTT TCC TAC134 I R T V F V I D P K K V I R L T L S Y509 CCT GCT GCA ACT GGA CGT AAC TTC GAC GAG ATT TTG AGG GTC GTC GAC TCT CTT CAA153 P A A T G R N F D E I L R V V D S L Q566 CTT GGG GAC AAG TAC CGT GTC ACA ACT CCT GTG AAC TGG CAG AAA GGT GAT GAC GTC172 L G D K Y R V T T P V N W Q K G D D V623 ATT GTA CAC CCG TCC GTA AGC AAT GAG GAG GCG AAA ACC TTG TTC CCT GAG GTT ACC191 I V H P S V S N E E A K T L F P E V T680 TTC CAC AAG CAA TCG TAT ATC CGA ACC ACC CCT CTC AAC GTA TAA GTA GAA CAG ATA210 F H K Q S Y I R T T P L N V *737 TGGATTTGTTATCGGATCTGTGTAACTGTATTTGTATAAGTGATGCAATCCTGAAACGTTTCTCATTTCCGCAAA812 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA←837再有，該樟芝的過氧化還原酶2-Cys Prx包含(SEQ ID NO5)所示的胺基酸序列1 TTGAATACGACT13 ATG GTC GCC ATC GTC CAG AAA CCT GCG CCC GGA TTC AAG GCC ACG GCC GTC GTT GAT1 M V A I V Q K P A P G F K A T A V V D70 GGT CAG TTC CAG GAT ATT TCT CTA TCT GAC TAC TTC GGA CAA TGG GTG GTT CTC TTC20G Q F Q D I S L S D Y F G Q W V V L F127 TTC TAT CCC CTT GAC TTC ACT TTC GTA TGC CCA ACT GAA ATC CTT GCC TTC AAT GAC39F Y P L D F T F V C P T E I L A F N D184 GCC CTT CCT CAA TTC AAG GAG CTG AAC ACT ACT GTC CTC AGC GTC TCA ACT GAT TCA58A L P Q F K E L N T T V L S V S T D S241 CAC TAC GCG CAT TTG GCA TGG GCC ACG CAA GAC CGC AAG CAG GGT GGT CTT GGT CCG77H Y A H L A W A T Q D R K Q G G L G P298 AAC CTC AAG CTC CCC ATG ATT GCG GAT AAG AAC ACG CAG ATC TCA CGC GAC TAC GGG96N L K L P M I A D K N T Q I S R D Y G355 GTT TTG ATC GAG GAA GAG GGT GTT GCT CTT CGC GGT CTC TTC TTG ATT GAC CCC AAG115 V L I E E E G V A L R G L F L I D P K412 GGT ACC CTG AGG CAA ATC ACA ATC AAC GAT TTA CCA GTC GGT CGC TCT GTC GAT GAG134 G T L R Q I T I N D L P V G R S V D E469 ACC ATT CGT CTG ATC AAG GCG TTC CAG TTC ACT GTA TGT CGA TCT ACC GTC ATT TCC153 T I R L I K A F Q F T V C R S T V I S526 ATT GAT ATT AAC ACT GGC AGC CAT ACT GAC CGT TTA AAA GGA CGA ACA TGG TGA GGT172 I D I N T G S H T D R L K G R T W *583 TTGCTGCCAACTGGACAGAAGGCGGCAAGACGATCAAAGCTGATCCCAAGGGTTCATTGGAGTATTTTTCCAC658 AGCGGGTGCAAATGGTCATACAGACGCTAAAGGGACTACCAAGAAGCGTGCTCGCGTTGACTGAGGTTCATCTGT733 TCATTCTTGGAGGCTATAGAAGCAAAGACTATGAGAAGACGTCGAAGACTCAGACTTTGCAGCTATGGTACACCA808 ACATCTTGTGTATCTCACTTTATTTAGACTTTCCCTGTAGATATAGAGTTGACAGACAGACTGCTGCTTGATTGC883 CCAATGCTAAAAACGACGATTCGCCGTCATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA←939
2.一種樟芝抗氧化酶的分離核酸，其包含一核苷酸序列，該核苷酸序列可用以編碼如權利要求1所述的樟芝抗氧化酶的蛋白質的胺基酸序列。
3.根據權利要求2所述的樟芝抗氧化酶的分離核酸，其中該分離核酸在酵母菌中進行表現及量化。
4.一種樟芝抗氧化酶的表現載體，其包含如權利要求2所述的樟芝抗氧化酶的分離核酸的核苷酸序列。
5.一種樟芝抗氧化酶的宿主細胞，其包含如權利要求4所述的樟芝抗氧化酶的表現載體。
6.一種樟芝抗氧化酶的蛋白質的製造方法，其用以製造如權利要求1所述的樟芝抗氧化酶的蛋白質，該製造方法包含下列步驟取得一樟芝抗氧化酶的核苷酸序列，其可用以編碼該樟芝抗氧化酶的蛋白質的胺基酸序列；將該樟芝抗氧化酶的核苷酸序列載入一表現載體中；將該樟芝抗氧化酶的表現載體載入一宿主細胞中；將該樟芝抗氧化酶的宿主細胞於一培養液中進行培養，該培養液可容許該樟芝抗氧化酶的核苷酸分子編碼的蛋白質表現，以合成樟芝抗氧化酶的蛋白質；及自該宿主細胞的培養液中回收該樟芝抗氧化酶的蛋白質。
7.一種樟芝抗氧化酶的醫藥組成物，其包含如權利要求1所述的樟芝抗氧化酶的蛋白質。
8.根據權利要求7所述的樟芝抗氧化酶的醫藥組成物，其中該樟芝抗氧化酶的醫藥組成物選擇用於化妝品、燙傷藥膏及皮膚移植。
9.根據權利要求8所述的樟芝抗氧化酶的醫藥組成物，其中由該樟芝抗氧化酶的醫藥組成物製成的化妝品選擇用以去除黑斑、雀斑及防止皺紋。
10.根據權利要求8所述的樟芝抗氧化酶的醫藥組成物，其中由該樟芝抗氧化酶的醫藥組成物製成的燙傷藥膏用以加速傷口癒合。
11.根據權利要求10所述的醫藥組成物，其中該樟芝抗氧化酶的醫藥組成物用於皮膚移植時，藉由樟芝抗氧化酶蛋白質防止移植皮膚的組織壞死，進而加速移植皮膚的縫合。
全文摘要
本發明涉及樟芝抗氧化酶的蛋白質與核酸，其包含序列辨識編號1、3及5所示的Mn－SOD、1－Cys Prx及2－Cys Prx的胺基酸序列，及可編碼該胺基酸序列的核酸。本發明還涉及上述樟芝抗氧化酶的蛋白質與核酸的製造方法及用途。
文檔編號A61P17/00GK1912113SQ200510089869
公開日2007年2月14日 申請日期2005年8月9日 優先權日2005年8月9日
發明者林棋財 申請人:林棋財