依託泊甙脂質體及其製備方法

2023-06-06 10:17:16 2

專利名稱：：依託泊甙脂質體及其製備方法
技術領域：
：本發明屬於藥劑學領域，具體涉及含有抗腫瘤活性成分依託泊戒的脂質體，以及該脂質體的製備方法。
背景技術：
：腫瘤是一種常見病與多發病，對人民的生命健康威脅很大，在醫學領域中是越來越受到重視的研究課題。全世界每年死於癌症者700萬以上，現在癌症患者約3700萬。在我國，每年約有no萬人死於腫瘤，估計發病率在180-200萬之間，總的發病率在不斷上升。在我國多個大城市中，惡性肺瘤已超過心腦血管疾病，排在所有疾病死亡原因的第一位，而在35-59歲年齡段，腫瘤一直是第一殺手。由於過去許多威脅人民生命健康的烈性傳染病得到了控制，人均壽命逐漸延長，診斷技術不斷提高，但是人類環境中的致癌因素日漸增多，因此在很多國家，癌症居死亡原因首位或第二位。目前腫瘤的治療有手術、放療、化療，很大程度上以化療為主。手術與放療的順應性差，而化療又會給患者帶來極大的毒副作用，在抑制和毒害增生活躍的腫瘤細胞的同時，對骨髓細胞、腸上皮細胞、毛髮細胞、生殖細胞也同樣產生抑制作用，同時容易產生耐藥性而失去治療作用。隨著社會經濟的發展和人民生活水平的提高，人們對生命、生活質量的要求也在不斷提高，高效低毒抗腫瘤藥物的出現也是眾望所歸。依託泊甙為鬼臼毒素的糖代謝產物，屬於細胞周期特異性抗腫瘤藥物，具有廣譜抗癌活性和相當高的治療指數，主要用於治療肺癌、淋巴癌、急性白血病、睪丸癌，尤其對早期擴散、預後惡劣的小細胞癌症效果良好，是治療小細胞肺癌和睪丸癌的最強活性單體。依託泊戒通過抑制哺乳類動物DNA拓樸異構酶II的活性發揮抗腫瘤效應，是拓樸異構酶的嵌入性抑制劑，它作用於DNA拓樸酶，使單鏈或雙鏈DNA斷裂，雙鏈DNA斷裂數是單鏈斷裂數的2-3倍，這表明細胞毒性機制是該藥的作用機制，這使該藥的毒副作用也很大，其主要毒性為骨髓抑制、嗜中性白細胞的嚴重減少、噁心嘔吐等消化道毒性、過敏反應如寒戰、發熱、心動過速、支氣管痙攣、呼吸困難和低血壓等。目前，用於臨床的依託泊甙有兩種劑型注射液和口服軟膠嚢，劑量為每支50-100mg和每粒50-100mg。血管給藥的劑量是每3-5天300-600mg/m2。臨床上使用的注射液是採用無水乙醇及聚乙二醇400等助溶劑製備的非水溶液系統，患者用藥後對血管剌激性大，且聚乙二醇易透過人紅細胞膜使紅細胞變性和溶血，易引起血壓下降或支氣管痙攣，甚至可致死亡；該注射液靜脈給藥時，一般先用生理鹽水稀釋，由於其在5%葡萄糖溶液中不穩定，可能析出形成微細沉澱，造成病人局部血管堵塞；口服軟膠嚢的應用限於非急症患者，其絕對生物利用度低，僅50%,血中濃度僅為靜脈注射的52±8%,不同患者之間口服生物利用度差異大(25%-75%)，主要原因是依託泊戒的水溶性差及在酸性和鹼性介質中夯解成無活性產物，為延長有效血藥濃度，勢必要增加服藥次數或增大服藥劑量，導致毒副作用增加。為使依託泊戒更好發揮臨床療效，提高其抗腫瘤活性和穩定性，降低其毒副作用，國內外藥學工作者致力於依託泊戒新給藥系統的研究和開發。中國專利文獻(申請號200610109406.9)公開了依託泊甙靜脈注射乳劑，獲得高生物利用度和抗腫瘤效果；唐星等人(申請號200610169149.8)將依託泊戒包裹於油相和界面膜中製備成依託泊戒脂微球注射液，提高了依託泊戒的穩定性，降低了其血管剌激性及毒性，增強其療效；中國專利文獻(申請號200410101404.6)/>開了一種依託泊戒的藥物組合物，含有機酸、聚乙二醇、丙二醇、賦性劑，將此藥物組合物製備成凍乾粉針，增強了依託泊戒的穩定性，改善現有劑型的不足；也有單位研製了依託泊戒的腸溶緩控釋固體分散體製劑(專利號ZL02153962.6)，該製劑臨床療效好，毒副反應低，口服生物利用度高。儘管對依託泊甙製劑的研究取得了長足進展，但目前這些新劑型多數處於實驗室的研究階段，大都不符合用藥的安全性和工業化生產的要求，至今未見上臨床、上市的報導。因此，急需尋求一種有效的製劑，提高藥物的穩定性、溶解度及抗腫瘤效果，減少藥物的血管刺激性和毒副作用，增強依託泊甙的臨床應用性。
發明內容本發明的一個目的在於提供一種性質穩定且可採用現有技術工業化生產的依託泊甙脂質體。本發明增加了依託泊甙的水溶性和穩定性，阻止藥物析出晶體，既能消除市售製劑的血管刺激性，減少依託泊甙自身的毒性反應，又能提高依託泊甙的生物利用度及其治療指數；本發明的另一目的是提供上述依託泊甙脂質體的製備方法，且製備方法靈活多樣，均採用常規的工藝設備，可工業化規模、高效率生產，產品質量保持穩定，可直接或二次加工製備注射或口服製劑。本發明的又一目的是提供一種依託泊甙脂質體固體製劑，該固體製劑是上述依託泊甙脂質體加入支架劑並採用冷凍乾燥或噴霧乾燥的工藝製成的。本發明的再一目的是提供一種依託泊甙注射劑或口服製劑，其是由上述的依託泊戒脂質體製備而成的。本發明所述的依託泊甙脂質體，由包含以下重量份的原料製備而成依託泊戒l-10份磷脂類物質1-100份固醇0-5(H分附加劑0-50份。優選地，上述的依託泊甙脂質體，由包含以下重量份的原料製備而成依託泊甙H分磷脂類物質2-30個分固醇0-l(H分附加劑0-10份。進一步地，上述依託泊戒脂質體的原料還可包含修飾材料0.1-50重量份。當脂質體原料中含有上述的修飾材料時，即為依託泊甙長循環脂質體。上述的磷脂類物質選自磷脂醯膽鹼、磷脂醯肌醇、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油、二月桂醯磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯甘油、二棕櫚醯磷脂醯甘油、二棕櫚醯磷脂酸、二油醯磷脂醯膽鹼、二油醯磷脂醯乙醇胺、卯磷脂、大豆磷脂、氬化卯磷脂、氬化大豆磷脂、心磷脂和腦磷脂及其混合物，其中優選卵磷脂、大豆磷脂、心磷脂和腦磷脂及其混合物。所述的固醇選自膽固醇、二氨膽固醇、大豆甾醯糖普、大豆甾醇和麥角固醇，其中優選膽固醇。所述的附加劑包括抗氧劑、表面活性劑和穩定劑。其中所述的抗氧劑選自維生素E、維生素E酯、亞^5克酸鈉、亞^5危酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、沒食子酸丙酯、叔丁基對羥基茴香醚、二叔丁基對甲酚、半胱氨酸和蛋氨酸中的一種或多種。其中所述的表面活性劑選自脫氧膽酸鹽、膽酸鹽、脫氧膽酸、牛^璜膽酸鹽、膽酸、吐溫-80、泊洛沙姆、汴澤和司盤中的一種或多種；其中所述的穩定劑選自硬脂胺、磷脂酸、十四酸、油酸和甘油中的一種或多種。所述的修飾材料包括聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、神經節鞘酯、聚丙烯醯胺、殼聚糖、聚乙二醇-磷脂衍生物或它們的混合物；其中聚乙二醇-磷脂衍生物可選用聚乙二醇-二硬酯醯磷脂醯乙醇胺、聚乙二醇-二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、聚乙二醇-二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺、聚乙二醇-氫化大豆磷脂醯乙醇胺和聚乙二醇-二硬脂醯磷脂醯膽鹼；其中所述的聚乙二醇的平均分子量為200-20000，優選平均分子量為2000-5000。所述的依託泊戒脂質體的粒徑小於1000nm,優選粒徑小於500nm。所述的依託泊戒脂質體，可進一步製成注射劑或口服製劑。本發明所述的依託泊甙脂質體的製備方法，可以採用下述方法中的任意一種方法一薄膜分散法將依託泊甙、磷脂類物質、固醇、脂溶性附加劑按上述比例溶解於適量有機溶劑中，20-60。C下減壓蒸發除去有機溶劑，形成一層脂質薄膜，加入適量含水溶性附加劑的水相介質溶解脂膜，超聲或高壓均質處理，即得依託泊甙脂質體。方法二注入法將依託泊戒、磷脂類物質、固醇、脂溶性附加劑溶於適量有機溶劑中製成脂質溶液，吸」取該溶液緩緩注入含水溶性附加劑的水相介質中，注入完畢去除有機溶媒，然後可進行超聲或高壓均質處理得到依託泊戒脂質體。這裡水相介質的溫度為20-60。C。方法三逆向蒸發法將依託泊甙、磷脂類物質、固醇、脂溶性附加劑按比例溶於有機溶劑，滴入含水溶性附加劑的水相介質，通過超聲或高速剪切使形成穩定的w/o型乳劑，減壓蒸去有機溶劑，滴加水相介質，旋轉幫助器壁上的凝膠脫落，然後在減壓下繼續蒸發，製得水性混懸液，然後可進行超聲或高壓均質處理得到依託泊甙脂質體。方法四熔融法按比例稱取依託泊甙、磷脂類物質、固醇、脂溶性附加劑於60-80"C加熱熔融，加入含水溶性附加劑的水相介質混合，然後可進行超聲或高壓均質處理得到依46泊甙脂質體。上述製備方法中，所述的有機溶劑選自乙醇、曱醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、氯仿和二氯甲烷及其混合物；所述的水相介質可以為注射用水、磷酸鹽緩衝液、枸櫞酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、三羥甲基氨基甲烷緩衝液、生理鹽水溶液、甘露醇溶液或葡萄糖溶液，其中上述緩沖液的pH為4-8。為進一步延長依託泊戒脂質體的血液循環時間，提高依託泊戒脂質體的耙向性和生物利用度，降低毒副作用，可進一步在上述製備脂質體的過程中(最好在磷脂類物質溶解熔融或水相介質配製過程)加入修飾材料，採用同樣的工藝條件，製備成依託泊甙長循環脂質體。為延長依託泊甙脂質體的存放時間，便於運輸，可將本發明的依託泊甙脂質體或其長循環脂質體通過噴霧乾燥或冷凍乾燥工藝製成固體製劑；為防止乾燥工藝中脂質體的聚集需加入支架劑，可以選擇的支架劑為甘氨酸、絲氨酸、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、阿拉伯膠、木糖醇、山梨醇、果糖、右旋糖苷、氯化鈉和白蛋白及其混合物，其用量按磷脂類物質重量比計算為i份磷脂加0.1-4份。本發明製得的依託泊甙脂質體加一定量的注射用水、生理鹽水或葡萄糖注射液振蕩水合後，即得本發明依託泊戒脂質體注射劑。當然，也可以採用常規方法製備成口服製劑。本發明的依託泊甙脂質體能夠以注射或口服方式給藥，其中注射方式可以為靜脈輸注、靜脈注射，優選靜脈輸注方式給予患者。脂質體屬於超微粒藥物載體，具有淋巴系統定向性，屬於靶向給藥系統的一種新劑型。它具有類細胞結構，或是通過內吞作用進入溶酶體，然後被酶消化釋放藥物，或是通過細胞融合作用，即脂質膜材與細胞膜構成物相似而融合進入細胞內，繼而被消化釋放藥物，使藥物在靶區組織中維持較高濃度，並改變被包封藥物的體內分布，使藥物主要在肝、脾、肺和骨髓等組織器官中蓄積，從而提高藥物的治療指數、減小藥物的給藥劑量和降低藥物的毒性；經脂質體攜帶後，可保護藥物活性基團在內環境中不被降解，還可延長藥物血中循環時間。本發明將依託泊戒包封於類脂雙分子層中，製成一種超微球狀脂質體，增加了藥物的水溶性和穩定性，使包裹的依託泊戒具有靶向性，能選擇性到達病變部位、組織和細胞，且在更長時間內維持有效血藥濃度，提供持續的治療效果，從而增加依託泊甙的療效，降低不良反應。對依託泊甙脂質體修飾得到的依託泊戒長循環脂質體，緩慢釋放藥物，在體內可以逃匿MPS的捕獲，延長脂質體在血液中的循環時間，達到緩釋、靶向、長效的作用，從而提高依託泊戒抗腫瘤活性。採用本發明方法所製備的依託泊甙脂質體和依託泊甙長循環脂質體能降低血管刺激性，提高藥物化學穩定性和療效，並降低毒副作用，因而具有一定創新性和實用性；其平均粒徑在1000nm以下，包封率大於80°/。；所得製劑穩定性好；且該製劑製備工藝成熟，方法簡便易行,材料來源廣，成本低，便於工業化生產。圖1為依託泊甙脂質體及其原料藥體外釋藥曲線。具體實施例方式實施例1:取依託泊甙100mg、卵磷脂500mg、膽固醇40mg於50ml茄形瓶中，加入20ml乙醇:丙酮(2:1)超聲^f吏其充分溶解。茄形並瓦置於40。C恆溫水浴中減壓旋轉蒸發除去有機溶劑，在瓶內壁上形成一層脂質薄膜，緩慢加入10ml磷酸鹽緩衝液(pH7.0)，水合，渦旋振蕩，使茄形瓶上的脂質薄膜完全溶解下來。混合液經室溫超聲分散(超聲功率600W)30min,即製得依託泊戒脂質體。其平均粒徑為179nm，全部粒子均在300nm以下，粒徑分布狹窄，表明脂質體大小較為均一；該脂質體可在室溫下穩定數天並在4。C下穩定至少3個月，貯存期間觀察不到沉澱和依託泊甙的降解。實施例2精密稱取100mg依託泊甙、400mg大豆磷脂、40mg腦磷脂、30mg大豆甾醯糖苷、20mg維生素E,用10ml乙醚將之溶解。然後將此溶液用注射器緩慢注入30ml含0.5。/。膽酸鈉的生理鹽水(40°C)中，用電子恆速攪拌器以2000r/min的轉速攪拌至乙醚除盡，混合液高壓均質(均質壓力10000psi)5次，即得依託泊戒脂質體，置4。C冰箱中保存備用。實施例3準確稱取100mg依託泊甙、2000mg氬化卵磷脂、800mg大豆甾醇、50mg心磷脂、50mg硬脂胺於三角燒瓶中，加熱熔融，置於75。C水浴中備用。將100mg泊洛沙姆188、400mg甘油、100mg維生素C溶於20ml5%葡萄糖溶液中，加熱至75。C,加入脂質熔融液中，高速剪切混合，經高壓均質(均質壓力15000psi)3次，即得依託泊甙脂質體。實施例4準確稱取1OOmg依託泊戒、1300mg氬化豆磷脂、180mg二硬脂醯磷脂醯膽鹼、1000mg麥角固醇、50mg油酸溶於30ml氯仿曱醇(1:1)混合溶劑中使完全溶解成澄明溶液，得有機相；另稱取100mg吐溫-80、100mg焦亞硫酸鈉溶於10ml醋酸鹽緩沖液(pH6.0)中，得水相；再將有機相與水相混合，經高速剪切(Fluko,10000rpm)5min得W/0初乳，然後於旋轉蒸發儀上減壓蒸發除去有機溶劑，即得依託泊甙脂質體。實施例5準確稱取1OOmg依託泊甙、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼2000mg、二棕櫚醯磷脂酸100mg、二氨膽固醇400mg、十四酸100mg溶於30ml二氯曱烷得有機相。另稱取500mg脫氧膽酸鈉、100mg亞硫酸鈉溶於10ml枸櫞酸鹽緩衝液(pH6.2)中得水相；再將有機相與水相混合，經水浴式超聲處理8min,直至形成穩定的W/O型乳劑(水浴溫度控制在20。C),然後於旋轉蒸發儀中減壓蒸發除去有機溶劑，達到膠態後滴加5ml枸櫞酸鹽緩衝液，水化，繼續短時減壓蒸發，經超聲處理20min後，即得依託泊戒脂質體。實施例6取依託泊戒100mg、卵磷脂500mg、二硬脂醯磷脂醯甘油100mg、膽固醇100mg、叔丁基對羥基茴香醚50mg於梨形瓶中，用10ml乙酸乙脂溶解後，旋轉蒸發，30。C減壓除去有機溶劑。真空乾燥2-3天得恆重薄膜。加入10ml含10。/。蔗糖、10。/。甘露醇的tris-HCl緩沖液(20mmol/L,pH7.0，含0.15mol/LNaCl),旋轉搖動梨形瓶，得到脂質體懸液。經高壓均質處理(均質壓力12000psi)5次，藥液於-40。C預凍24小時，於冷凍乾燥機中凍幹，凍幹程序為-40。C，8小時;-30。C，6小時;-20。C，6小時;-10°C,5小時;0°C,5小時;15°C，5小時。所得依託泊戒脂質體凍幹製劑加水復溶後平均粒徑為150士31nm,全部粒子均在400nm以下。實施例7精密稱取100mg依託泊甙、1400mg大豆磷脂、160mg聚乙二醇(平均分子量4000)-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(PEG柳o-DSPE)、60mg沒食子酸丙酯，用10ml乙醇將之溶解。然後將此溶液用注射器緩慢注入30ml含0.5%牛磺膽酸鈉溶液(60°C)中，用電子恆速攪拌器以1000r/min的轉速攪拌至乙醇除盡為止，混合液經高壓均質(均質壓力10000psi)5次，即得依託泊甙長循環脂質體，置4。C冰箱中保存備用。實施例8稱取依託泊甙100mg、卵磷脂1200mg、聚乙二醇(平均分子量200)-氫化大豆磷脂醯乙醇胺(PEG2oo-HSPE)80mg、膽固醇100mg、叔丁基對羥基茴香醚50mg於梨形瓶中，用10ml乙酸乙脂溶解後，旋轉蒸發，30。C減壓除去有機溶劑。真空千燥2-3天得恆重薄膜。加入10ml含100/0山梨醇、5%右旋糖苷、5°/。白蛋白的溶液，旋轉搖動梨形瓶，得到脂質體懸液。經超聲處理(超聲功率600w)20min,藥液於噴霧乾燥機中乾燥，噴霧乾燥條件為進風溫度120。C,進料速度50ml/min,旋風分離器壓差50mm水，霧化盤轉速2500r/min，收集得到依託泊武長循環脂質體固體製劑。實施例9準確稱取100mg依託泊戒、氫化卵磷脂1500mg、聚乙二醇(平均分子量IOOO)-二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(PEGkxktDPPC)150mg溶於30ml二氯曱烷得有機相。另稱取150mg硫代硫酸鈉溶於10ml水中得水相；再將有機相與水相混合，經水浴式超聲處理10min,直至形成穩定的W/0型乳劑(水浴溫度控制在20。C),然後於旋轉蒸發儀中減壓蒸發除去有機溶劑，加入1000mg乳糖、500mg葡萄糖、500mg海藻糖超聲溶解，即得依託泊甙長循環脂質體混懸液。該混懸液於微型噴霧乾燥機中減壓乾燥，進口溫度130~140°C，出口溫度5060。C，空氣壓力1.2Atm，加料速度60ml/min，即得依託泊甙長循環脂質體噴霧乾燥製劑。實施例IO準確稱取100mg依託泊甙、1800mg卵磷脂、100mg聚乙二醇(平均分子量4000)-二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(PEG柳o-DPPE)於三角燒瓶中，加熱熔融，置於80。C水浴中備用。將1000mg甘氨酸、600mg麥芽糖、1000mg甘露醇溶於加ml水中，加熱至80。C，力。入脂質熔融液中，高速剪切混合，經高壓均質(均質壓力15000psi)3次，即得依託泊甙長循環脂質體。該混懸液於-80。C預凍10小時，於冷凍乾燥^L中凍幹(凍幹程序為-40。C，IO小時;-20°C,8小時;0°C，8小時;20°C,5小時)，即得依託泊甙長循環脂質體凍幹製劑。實施例ll取依託泊戒100mg、卵磷脂1600mg、聚乙二醇(平均分子量3350)-二硬脂醯磷脂醯膽鹼(PEG335o-DSPC)100mg溶於10ml乙醇，混合溶液在旋轉蒸發器內40。C減壓除去溶媒，形成薄膜。然後加入含1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的水溶液10ml，超聲處理30min，製得依託泊戒長循環脂質體懸液。加入8%乳糖和8%甘露醇作支架劑，經冷凍乾燥得依託泊戒長循環脂質體的凍幹製劑。依託泊戒長循環脂質體的凍幹製劑臨用前只需充分水化短時振蕩，就能重新形成脂質體。實施例12將聚乙二醇(平均分子量5000)-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(PEG漏-DSPE)400mg、氫化大豆磷脂300mg、膽固醇150mg、a-生育盼30mg和依託泊戒100mg溶於30ml氯仿，置梨形瓶內，在氮氣流下旋轉蒸發，減壓除去溶媒。真空乾燥2-3天，得恆重薄膜。加入含1.0。/。PEG4000水溶液10ml，旋轉搖動梨形瓶，得到脂質體懸液。用氮氣衝洗後，封口室溫下平衡l天，探針超聲處理15min,然後在10000psi均質壓力下高壓均質處理3次，^J旨質體粒徑逐漸減小。然後加入8%葡萄糖、8%甘露醇、6%海藻糖，冷凍乾燥得依託泊戒長循環脂質體。實施例13取實施例1中的依託泊戒脂質體進行形態觀察、並測定粒徑及其分布。取脂質體適量，加入適量注射用水稀釋，用2%磷鎢酸染色，透射電鏡下觀察粒子形態。取脂質體懸液適量，加入適量水稀釋，以Zetamaster光子相關光譜儀測定脂質體的粒徑大d、和分布以及Zeta電位。結果電鏡下觀察依託泊甙脂質體呈均勻規則的球形粒子，無聚集和粘連。實驗測得的依託泊甙脂質體粒徑分布均勻，平均粒徑為179nm，多分散指數為0.157，zeta電位為-26.8mv。實施例14取實施例1中的依託泊甙脂質體進行包封率的測定。包封率依據RP-HPLC方法測定，依託泊甙脂質體溶液經超濾結合高速離心法(4000rpm,10min)分離游離的依託泊甙，用RP-HPLC測定游離依託泊戒含量。色譜柱DiamonsilC18柱(250mmx4.6mm,5nm);流動相乙腈-pH值4.0醋酸鹽緩衝液(32:68);柱溫25°C;^企測波長254nm;流速l.Oml.min";進衝羊20pl，4安下列公式計算包封率。包封率(％)=(脂質體中依託泊戒總量-游離依託泊戒量)/依4乇泊戒總量結果測得包封率為84.32%。實施例15體外釋藥特性精密量取實施例1中的依託泊甙脂質體9ml至透析袋中，置於250mlpH7.4磷酸鹽緩沖液中，於(37±0.5)。C下石茲力攪拌，定時吸取介質6ml,加氯仿4ml，充分提耳又，離心，吸取氯仿層，將其揮幹，加入曱醇4ml溶解，測定吸光度，並按標準曲線方程計算累積釋放百分率，同時做依託泊戒原料藥的體外釋放試驗作為比較。結果依託泊戒脂質體50h累積釋藥(96.30±1.11)%,其原料藥3h累積釋藥(97.10±1.84)%。依託泊戒脂質體及其原料藥體外釋藥曲線見圖l,從圖l中可以比較出，依託泊戒製成脂質體後，達到了長效緩釋的效果。實施例16取實施例6中的凍千品適量，密封，於冰箱4。C放置，於0、1、2、3、6月取樣，對粒徑、包封率、滲漏率、含量等指標進行測定，評價依託泊戒脂質體凍幹品的穩定性。結果見表l。表l批號測定項目0個月l個月2個月3個月6個月070801外觀色澤符合規定符合規定符合規定符合規定符合規定有關物質(％)0.910.981.051.161.38tableseeoriginaldocumentpage19表1說明，依託泊甙脂質體凍幹品在水箱4。C放置6個月，其粒徑、包封率、含量等質量指標基本不變，表明依託泊甙脂質體凍幹品穩定性好。實施例17取上述實施例中的依託泊武脂質體或長循環脂質體製劑進行刺激性實驗。(1)對家兔耳緣靜脈血管刺激試驗將依託泊戒注射液的兩種不同劑型按臨床用藥量(100mg/次)進行體表面積換算得出實驗兔用劑量(5.2mg/kg)。實驗前按2ml/kg的給藥量用無菌生理鹽水注射液新鮮配製。選用體重2.5-3.0kg的健康紐西蘭白兔6隻，雌雄兼有。注射部位用碘酊和乙醇消毒後，3隻白兔於右耳耳緣靜脈注射依託泊戒注射液，左耳注射相同體積無菌生理鹽水注射液作對照；另3隻白兔於右耳耳緣靜脈注射依託泊甙脂質體，左耳注射相同體積無菌生理鹽水注射液作對照，注射速度為lml/min(相當於人臨床注射速度)。每日一次，連續3天，末次給藥24小時後，由耳緣靜脈注入空氣處死白兔，肉眼觀察注射部位的反應情況，並解剖兔耳血管及周圍組織作石蠟切片(注射部位下向心段lcm及5cm處)，染色，光鏡檢查。肉眼觀察注射部位反應情況。結果見表2。表2製劑序號右耳左耳1正常正常依託泊甙脂質體2正常正常3正常輕微充血1充血輕〗殷充血依託泊戒注射液2充血正常3充血輕糹鼓充血結果，如表2所示，依託泊戒脂質體血管刺激性明顯弱於依託泊式注射液。(2)肌肉剌激性試驗依託泊戒注射液的劑量換算、藥物配製、紐西蘭白兔的選擇同上(共4隻，每種劑型2隻)。剪去白兔兩側股四頭肌部位的兔毛，用碘酊和乙醇消毒後，分別在右側股四頭肌注射依託泊戒脂質體和依託泊戒注射液lml,左側股四頭肌注射等量無菌生理鹽水注射液作對照，注射48小時後，由耳緣靜脈注入空氣處死白兔，解剖股四頭肌，縱向切開，觀察注射部位肌肉組織的反應情況，確定反應級數。0級無變化l級輕度充血，其範圍在0.5cmxl.0cm以下2級中度充血，其範圍在0.5cmxl.0cm以上3級重度充血，伴有肌肉變性4級出現壞死，有褐色變性5級出現廣泛性壞死然後算出4塊股四頭肌反應級數總和，如果股四頭肌反應級數的最高值與最低值之差大於2，則應另取2隻白兔重新實驗。得到結果後，若四塊股四頭肌反應級數總和小於IO，則認為供試品的局部刺激性實驗符合規定。表3tableseeoriginaldocumentpage21結果(見表3)表明，依託泊戒脂質體的肌肉刺激性明顯弱於依託泊戒注射液。實施例18過每丈試-瞼給藥方法取適量依託泊戒注射液用生理鹽水稀釋一定倍數，為樣品A;取自製依託泊甙脂質體用生理鹽水稀釋一定倍數，為樣品B。依託泊戒給藥劑量為2.5mg/kg。取豚鼠12隻，分成A、B兩組，分別供樣品A和B進行過敏性試驗用。每組豚鼠6隻，體重250350g。隔天ip供試品0.5ml，連續3次。然後將A、B組豚鼠再分別平均分成A1、A2及B1、B2組，其中A1、Bl組於首次注射後的第14天由後腳掌外側靜脈注入供試品lml進行攻擊，觀察注射後動物有無用爪搔鼻、噴嚏、豎毛、抽搐、呼吸困難、大小便失禁、休克、死亡等反應，A2、B2組於首次注射後的第21天同樣由後腳掌外側靜脈注入供試品並進行觀察。結果依託泊甙注射液多次抓鼻、多次顫抖、噴咬、豎毛、抽搐、呼吸困難，兩例動物出現大小便失禁；依託泊甙脂質體豎毛、少悽t動物顫4牛。根據豚鼠過每丈反應級數標準表，對本試驗進行評定，反應級數達2級以上(包括2級)時，可認為該供試品過敏反應試驗陽性。結果A組為3級，B組為l級。即A組(市售依託泊甙注射液)可導致明顯的過敏反應，為陽性，而B組(自製依託泊甙脂質體)過敏試驗為陰性。實施例19溶血性實驗自紐西蘭白兔的頸總動脈取血20ml，置於燒瓶內，用玻璃棒輕輕攪動數分鐘後，除去纖維蛋白，取出血液，加等量生理鹽水注射液，離心(1500rpm,10min),除去上清液；沉澱的紅細月包再加生理鹽水注射液清洗。如此反覆直到上清液透明，按紅細胞的容量用生理鹽水配成2%的混懸液。取乾淨試管7支，分別編號，依次加入各液，第6管不加供試品作空白對照管，第7管用蒸餾水代替生理鹽水，搖勻，置於37。C水浴中，分別於0.5、1、2、3小時觀察是否有溶血現象發生。結果表明，依託泊戒注射液和依託泊戒脂質體都未見溶血發生，兩種劑型的溶血性實驗均合格。實施例20取實施例10中的依託泊戒脂質體凍幹製劑溶於蒸餾水中，製成lmg/ml的溶液，在4。C、25。C和36。C放置四周，於8、12、16、20、24和28天高速離心收集沉澱，用HPLC法測定依託泊甙含量，結果見表4。表4依託泊戒含量(％)0天8天12天16天20天24天28天4°C10.990.990.980.980.970.9625°C10.970.960.930.860.810.7135°C10,960.910.820.770,730.57結果表明，依託泊甙脂質體在4。C放置一個月，基本無滲漏；在室溫條件下存放兩周基本無滲漏；在35。C放置8天，濃度僅下降4%左右，放置12天，濃度變化10°/。；在環境溫度不高於35。C的情況下，該脂質體能保持8天以上的穩定性，表明依託泊甙脂質體穩定性好。實施例21利用實施例10中所述的製劑評價依託泊甙脂質體的毒性。取體重1822g性別一致的昆明小鼠60隻，隨機分成6組，每組IO只，分別尾靜脈注射依託泊甙脂質體和依託泊甙注射液，組間劑量按等比級數排列，比值1:0.8，觀察並記錄給藥7天內各組動物的反應和死亡率，用簡化機率單位法計算LD50，其95%的可信限為依託泊戒注射液LD5Q=30.2±1.2mg/kg，依託泊戒脂質體LD50=68.4士1.6mg/kg。LDso毒性實驗結果表明，依託泊甙脂質體與依託泊甙注射液相比，毒性明顯降低。實施例22大鼠體內藥代動力學HPLC色譜條件DiamonsilC18柱(250mmx4.6mm,5pm);流動相曱醇-pHW.0醋酸鹽緩沖液(40:60);流速l.Oml25°C;4企測波長254nm;進樣量20^1。藥代動力學實驗將12隻大鼠隨機分成2組，每組6隻，實驗前禁食。分別於右後股靜脈注射依託泊甙溶液(將依託泊甙注射液用生理鹽水稀釋至lmgml")和本發明依託泊甙脂質體(lmg.ml"),給藥劑量為10mg.kg"。分別於5、15、30、45min和l、2、4、6、8、12、24h眼眶取血。將血樣置預先肝素化的1.5ml尖底離心試管中，4000r.min"離心10min，分離出血漿於-20'C冰箱保存待測。血漿樣品處理方法血漿樣品20(Hi1,加入4pg.ml—'對羥基苯曱酸丙酯內標溶液10)a1,氯仿3ml，渦旋震蕩lmin,4000rmin"離心10min,取有機相2ml，置離心管中，於4(TC水浴中氮氣吹乾，殘留物用50iil流動相溶解後20pl進樣分析。數據分析將主要藥代動力學參數進行統計分析，用SPSS1110軟體按配對t檢驗進行處理，評價依託泊甙脂質體與依託泊甙注射液的藥代動力學參數有無差異。參數依託泊甙脂質體依託泊甙注射液T,力a/h0.29±0.210,24±0.191.74±0.311.68±0.15CL/L-h—10.24±0.110.49±0.15**48.91士2.1331.54士1.卯87.56±8.8018.30±6.45*AUCo隱J^ig如L"87.94±8.9118.80±6.56*MRT/h5.78±0.861.46±0.32**P<0.05;**P<0.01。以依託泊甙溶液為對照，考察依託泊甙脂質體在大鼠體內的藥代動力學行為。用3P97藥代動力學程序處理依託泊甙脂質體和注射液的平均血藥濃度數據。根據AIC和擬合度判斷兩者的模型歸屬。結果表明，依託泊戒脂質體和溶液的血藥濃度數據均符合雙隔室模型。依託泊甙脂質體的MRT、AUCo-24和AUQ^分別是參比製劑的3.96、4.78和4.68倍，具有顯著差異，CL是參比製劑的0.49倍，具有極顯著差異，這說明在同樣劑量條件下，藥物被脂質體包裹後延長了藥物在血液中的滯留時間，使藥物在體內消除速度較慢並保持了較高的血藥濃度，從而發揮長效作用。依託泊戒脂質體改變了依託泊甙在大鼠體內的藥動學性質，具有一定的緩釋和長循環特徵。權利要求1、一種依託泊甙脂質體，其特徵在於，由包含以下重量份的原料製備而成依託泊甙1-10份磷脂類物質1-100份固醇0-50份附加劑0-50份。2、根據權利要求1所述的依託泊甙脂質體，其特徵在於，由包含以下重量份的原料製備而成依託泊戒1份磷脂類物質2-30份固醇0-l(H分附加劑0-l(H分。3、根據權利要求1所述的依託泊戒脂質體，其特徵在於，所述原料進一步包含0.1-50重量份的修飾材料。4、根據權利要求1-3中任意一項所述的依託泊甙脂質體，其特徵在於，所述的磷脂類物質選自磷脂醯膽鹼、磷脂醯肌醇、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油、二月桂醯磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯甘油、二棕櫚醯磷脂醯甘油、二棕櫚醯磷脂酸、二油醯磷脂醯膽^成、二油醯磷脂醯乙醇胺、卵磷脂、大豆磷脂、氫化大豆磷脂、氫化卵磷脂、腦磷脂和心磷脂及其混合物；所述的固醇選自膽固醇、二氨膽固醇、大豆甾醯糖苷、大豆甾醇和麥角固醇；所述的附加劑包括抗氧劑、表面活性劑和穩定劑；其中所述抗氧劑選自維生素E、維生素E酯、亞闢u酸鈉、亞碌u酸氫鈉、焦亞》克酸鈉、硫代硫酸鈉、沒食子酸丙酯、叔丁基對羥基茴香醚、二叔丁基對曱酚、半胱氨酸和蛋氨酸中的一種或多種，所述表面活性劑選自脫氧膽酸鹽、膽酸鹽、脫氧膽酸、牛磺膽酸鹽、膽酸、吐溫-80、泊洛沙姆、汴澤和司盤中的一種或多種，所述穩定劑選自硬脂胺、磷脂酸、十四酸、油酸和甘油中的一種或多種。5、根據權利要求4所述的依託泊甙脂質體，其特徵在於，所述的磷脂類物質選自卵磷脂、大豆磷脂、腦磷脂和心磷脂及其混合物；所述的固醇為膽固醇。6、才艮據權利要求3所述的依託泊甙脂質體，其特徵在於，所述的修飾材料包括聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、神經節鞘酯、聚丙晞醯胺、殼聚糖和聚乙二醇-磷脂衍生物或它們的混合物；其中所述的聚乙二醇-磷脂衍生物選自聚乙二醇-二硬酯醯磷脂醯乙醇胺、聚乙二醇-二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、聚乙二醇-二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺、聚乙二醇-氫化大豆磷脂醯乙醇胺和聚乙二醇-二硬脂醯磷脂醯膽鹼；其中所述聚乙二醇的平均分子量為200-20000。7、根據權利要求6所述的依託泊甙脂質體，其特徵在於，所述的聚乙二醇平均分子量為2000-5000。8、根據權利要求1-3中任意一項所述的依託泊甙脂質體，其特徵在於，所述脂質體的粒徑小於1000nm。9、根據權利要求1-3中任意一項所述的依託泊甙脂質體，其特徵在於，所述脂質體的粒徑小於500nm。10、權利要求1或2所述的依託泊甙脂質體的製備方法，其特徵在於，採用下述不同方法中的任意一種l)薄膜分散法將依託泊甙、磷脂類物質、固醇、脂溶性附加劑按比例溶於有機溶劑，並在20-60。C下減壓揮去有機溶劑，形成薄膜，然後加入含水溶性附加劑的水相介質水合，超聲或高壓均質後即得依託泊戒脂質體；或2)注入法將依託泊戒、磷脂類物質、固醇、脂溶性附加劑溶於適量有機溶劑中製成脂質溶液，吸取該溶液緩緩注入20-60。C含水溶性附加劑的水相介質，注入完畢繼續攪拌去除有機溶劑，然後進行超聲或高壓均質處理得到依託泊武脂質體；或3)逆向蒸發法將依託泊甙、磷脂類物質、固醇、脂溶性附加劑按比例溶於有機溶劑，加入含水溶性附加劑的水相介質，進行超聲或高速剪切使形成穩定的w/o型初乳，減壓蒸去有機溶劑，加入水相介質，旋轉幫助器壁上的凝膠脫落，然後在減壓下繼續蒸發，製得水性混懸液，然後進行超聲或高壓均質處理得到依託泊甙脂質體；或4)熔融法按比例稱取依託泊戒、磷脂類物質、固醇、脂溶性附加劑於60-80。C加熱熔融，加入含水溶性附加劑的水相介質混合，然後進行超聲或高壓均質處理得到依託泊甙脂質體；上述製備方法中，所述的水相介質為注射用水、磷酸鹽緩衝液、枸櫞酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、三羥曱基氨基曱烷緩衝液、生理鹽水溶液、甘露醇溶液或葡萄糖溶液，且上述緩衝液的pH為4-8;所述的有機溶劑選自乙醇、曱醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、氯仿和二氯曱烷及其混合物。11、根據權利要求IO所述的依託泊戒脂質體的製備方法，其特徵在於，在磷脂類物質的溶解或熔融過程或水相介質的配製過程中進一步加入修飾材料。12、一種依託泊戒脂質體固體製劑，其特徵在於，該固體製劑是權利要求1-3中的依託泊甙脂質體加入支架劑並採用冷凍乾燥或噴霧乾燥的工藝製成的。13、根據權利要求12所述的依託泊武脂質體固體製劑，其特徵在於，所述的支架劑選自甘氨酸、絲氨酸、蔗糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、阿拉伯膠、木糖醇、山梨醇、果糖、右旋糖苷、氯化鈉和白蛋白及其混合物，並且其用量按磷脂類物質重量比計算為1份磷脂加0.1-4份。14、一種依託泊甙注射劑或口服製劑，其特徵在於，是由權利要求1-3中的依託泊戒脂質體製備而成的。全文摘要本發明提供一種可用於注射或口服的依託泊甙脂質體。它的特點是用磷脂類物質包封依託泊甙，製得粒徑小、包封率高、穩定性好、毒副作用低的依託泊甙脂質體。本發明製備的依託泊甙脂質體提高了依託泊甙的溶解度和穩定性，並降低其毒性，延長藥物在血液中的循環時間，從而提高了藥物的療效，使本脂質體製成的製劑在臨床應用上具有低毒性、低過敏性和高效性的特點。本發明還涉及依託泊甙脂質體的製備方法，該製備工藝簡單、成本低廉，適合工業化生產。文檔編號A61K31/7048GK101584662SQ20081003777公開日2009年11月25日申請日期2008年5月21日優先權日2008年5月21日發明者李亞平,陳伶俐,顧王文申請人:中國科學院上海藥物研究所