阿爾茨海默病治療藥物的製作方法

2023-05-26 11:12:31 3

專利名稱：阿爾茨海默病治療藥物的製作方法
技術領域：
本發明涉及阿爾茨海默病的治療。具體涉及利用抗炎症細胞因子或攜
帶抗炎症細胞因子基因的負鏈RNA病毒載體等表達抗炎症細胞因子的載 體，治療阿爾茨海默病。
背景技術：
隨著日本快速步入老齡化社會，老年性痴呆症及其護理問題日漸成為 巨大的社會問題。據報告顯示，10%的65歲以上老人患有老年性痴呆症。 阿爾茨海默病是導致老年性痴呆症的兩大原因之一，約佔老年性痴呆症患 者的50%，看護問題也已經成為重大的社會問題。
目前，阿爾茨海默病的治療藥物有乙醯膽鹼類活性劑和乙醯膽鹼酯酶 抑制劑等乙醯膽鹼調控劑、抑制澱粉樣蛋白肽生成的P分泌酶(BACE)阻斷 劑和澱粉樣蛋白肽的凝集阻斷劑等(3-澱粉樣蛋白調控劑、神經肽及神經成 長因子等神經保護和神經營養藥，此外還有螯合劑、抗氧化劑、抗炎藥物等。
阿爾茨海默病治療藥物從治療效果上可劃分為以下3種。在阿爾茨海 默病的初期使用可在某種程度上改善認知功能，但幾乎不能控制痴呆本身 的發展，此為第一代藥物；既能改善認知功能又可望能夠控制病情發展， 此為第二代藥物；從根本上進行預防、治療的為第三代藥物。目前得到評 價的幾乎只有第一代藥物。關於阿爾茨海默病的發病及進展機制， 一種較 有力的"澱粉樣蛋白級聯反應假說"認為，P -澱粉樣蛋白肽的生成和儲積是 形成老年斑的主要原因，期待以P澱粉樣蛋白肽為目標的部分藥劑有助於 第二代或第三代藥物有關聯的藥物的開發。目前的現狀是，確實有效的第
一代藥效自不必說，人們強烈期望出現能夠徹底治癒阿爾茨海默病的第二、 第三代藥物。
另一方面，作為被一向認可的發病機制，"炎症假說"認為，阿爾茨海 默病的發病是由於阿爾茨海默病患者腦內的炎症性小膠質細胞的活性亢進導致神經細胞死亡。實際已獲確認的是，阿爾茨海默病患者腦內的小膠質 細胞活性亢進尤其聚積在老年斑周圍，且淋巴細胞侵潤腦內，進而被炎症 激活的物質(如補體)儲積腦內。流行病學的調查分析結果表明，抗炎劑尤其
是非類固醇抗炎藥(Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs: NSAIDs )有望 控制阿爾茨海默病的發展，也有報告顯示P引咮美辛(indomethacin)在試驗 性臨床試驗中明顯控制了阿爾茨海默病情的進展(Rogers J et al., Neurology. 1993 Aug;43(8):1609國11.),並以較少影響消化功能的Cox-2特異性抑制劑 為主開展了大規模的臨床試驗。遺憾的是，在以輕到中度的阿爾茨海默病 患者為對象進行的l年試驗中，沒有得到第一代NSAIDs和新一代NSAIDs 對阿爾茨海默病情的發展具有控制效果的報告(Aisen PS et al., JAMA. 2003 Jun 4;289(21 ):2819-26.， Imbimbo BP. Expert Opin Investig Drugs. 2004 Nov;13(ll):1469-81., Townsend KP et al" FASEB J. 2005 Oct;19(12):1592-601.)。報告還顯示，作為神經膠質細胞中的誘發炎症的細 胞因子產生的選擇性抑制劑，被稱為MW01-5-188WH的化合物口服給藥小 鼠後，可控制澱粉樣蛋白卩l-42誘導下的海馬中白細胞介素1 p、胂瘤壞死 因子a、 S100B的上調，此外，海馬神經鍵不全同時得到恢復，海馬依存性 Y迷宮行為也得到改善(Ralay Ranaivo H et al., J Neurosci. 2006 Jan ll;26(2):662-70.)。
非專利文獻1 Rogers J et al.， Neurology. 1993 Aug;43(8): 1609-11 非專利文獻2 Aisen PS et al.， JAMA. 2003 Jun 4;289(21):2819-26 非專利文獻 3 Imbimbo BP, Expert Opin Investig Drugs. 2004 Nov;13(ll):1469-81
非專利文獻4 Townsend KP et al.， FASEB J. 2005 Oct; 19(12): 1592-601 非專利文獻5Ralay Ranaivo H et al" J Neurosci. 2006 Jan ll;26(2):662-70

發明內容
發明所要解決的課題
鑑於以上情況，本發明所要解決的課題為提供一種以治療阿爾茨海默 病為目的的新型治療方法和治療藥物。 解決課題的方法本發明者們為完成這一課題不懈努力，發明了有效治療阿爾茨海默病
的全新方法。#元炎症細月包因子(anti-inflammatory cytokines )之一 的白細月包 介素10(interleukin-10: IL-10 )與炎症細胞因子(pro-inflammatory cytokines ) 活性的竟爭性作用可調節炎症反應。有報告指出，阿爾茨海默病中IL-10啟 動子區域的基因多態(polymorphism)與病情的發展有關(Lio D et al., Genes Immun. 2003 Apr;4(3):234畫8.; Scassellati C et al" Neurosci Lett. 2004 Feb 12;356(2):119-22.; Arosio B et al.， Neurobiol Aging. 2004 Sep;25(8):1009-15.; Ma SL et al" Neurobiol Aging. 2005 Jul;26(7): 1005-10.)。但沒有以阿爾茨海 默病的治療為目的對抗炎症細胞因子進行評價的實例。本發明使用抗炎症 細胞因子和表達抗炎症細胞因子基因的負鏈RNA病毒載體等載體，提供阿 爾茨海默病的新型療法。本發明還提供一種以治療和預防阿爾茨海默病為 目的的新型基因治療方法。
即本發明涉及 一 種用於阿爾茨海默病治療或治療藥物開發的攜帶抗炎 症細胞因子基因的負鏈RNA病毒載體、包含該負鏈RNA病毒載體在內的 阿爾茨海默病藥物組合物及使用該負鏈RNA病毒載體的阿爾茨海默病治療 和預防方法等，具體為，
〔1 〕 一種阿爾茨海默病預防或治療用藥物組合物，其包含抗炎症細胞因 子或其部分肽、或者攜帶編碼該細胞因子或其部分肽的負鏈RNA病毒載體；
〔2 〕 〔 1 〕所述的組合物，其包含攜帶編碼抗炎症細胞因子或其部分肽 基因的負鏈RNA病毒載體；
〔3 〕 〔 1 〕所述的組合物，其包含抗炎症細胞因子或其部分肽；
〔4 〕 〔 1 〕或〔2 〕所述組合物，其中，負鏈RNA病毒載體為副粘病毒 載體；
〔5 〕 〔 1 〕或〔2 〕所述組合物，其中，負鏈RNA病毒載體為仙臺病毒 載體；
〔6 〕 〔 1 〕 - 〔 5 〕中任一項所述的組合物，其中，抗炎症細胞因子從 白細胞介素4 、白細胞介素1 0 、白細胞介素1 3及其部分肽組成的群體 中選擇；
〔7 〕 〔 1 〕 - 〔 6 〕中任一項所述的組合物，其用於經鼻給藥； 〔8 〕 一種用於阿爾茨海默病治療或藥物開發的攜帶抗炎症細胞因子或其 部分肽的基因的負鏈RNA病毒載體；〔9 〕 一種用於阿爾茨海默病治療或藥物開發的抗炎症細胞因子蛋白質； 〔10〕 〔 8 〕所述載體，其中，負鏈RNA病毒載體為副粘病毒載體； 〔11〕 〔 8 〕所述載體，其中，負鏈RNA病毒載體為仙臺病毒載體； 〔12〕 〔8〕、 〔10〕或〔11〕所述載體，其中，抗炎症細胞
因子是從由白細胞介素4 、白細胞介素1 0 、白細胞介素1 3及它們的部
分肽組成的群體中選擇的；
〔13〕 一種包含抗炎症細胞因子或其部分肽、或者攜帶編碼該細胞因子 或其部分肽的基因的負鏈RNA病毒載體的給藥步驟的阿爾茨海默病治療或 預防方法；
〔14〕 〔13〕所述方法，所述給藥為經鼻給藥； 本發明還包含，
〔1 〕 一種用於阿爾茨海默病治療或藥物開發的攜帶抗炎症細胞因子或其
部分肽的基因的負鏈RNA病毒載體； 〔2〕 〔 1 〕所述載體，其中，負鏈RNA病毒載體為副粘病毒載體； 〔3〕 〔 1 〕所述載體，其中，負鏈RNA病毒載體為仙臺病毒載體； 〔4〕 〔1〕 - 〔3〕任一項所述載體，其中，抗炎症細胞因子是從白細胞
介素4、白細胞介素l0、白細胞介素l3及其部分肽組成的群體中選擇的。
〔5 〕 一種包含〔1 〕 - 〔 4 〕中的任一載體的阿爾茨海默病治療或預防 藥物組合物。
〔6 〕 〔 5 〕所述的藥物組合物，其用於經鼻給藥。
本發明還涉及一種包含抗炎症細胞因子或對其進行編碼的載體的給藥 步驟的治療或預防阿爾茨海默病的方法。本發明尤其涉及一種包含攜帶抗 炎症細胞因子基因的負鏈RNA病毒載體等可以表達抗炎症細胞因子的載體 的給藥步驟的治療或預防阿爾茨海默病的方法。該負鏈RNA病毒載體優選 副粘病毒載體，更優選仙臺病毒載體。同時抗炎症細胞因子優選IL-IO。給 藥方式優選經鼻給藥。
此外，本發明還涉及在生產治療或預防阿爾茨海默病藥物中，抗炎症 細胞因子或對其進行編碼的載體的應用。本發明尤其提供在生產治療或預 防阿爾茨海默病藥物中，抗炎症細胞因子、攜帶該抗炎症細胞因子基因的 載體、特別是攜帶抗炎症細胞因子基因的負鏈RNA病毒載體的應用。該負鏈RNA病毒載體優選副粘病毒載體，更優選仙臺病毒載體。抗炎症細胞因
子優選IL-IO。含有負鏈RNA病毒載體的藥物優選製成適合經鼻給藥的劑型。
發明的效果
本發明提供一種利用抗炎症細胞因子的阿爾茨海默病新型治療藥物和
的阿爾茨海默病治療藥和利用該載體對阿爾茨海默病進行基因治療的方 法。本發明的方法可以成為一種可替代其他阿爾茨海默病治療方法或者與 其並用的新型治療方法。


圖1
IL-10表達SeV載體給藥後的血中IL-10量的測定圖。對照組使用了 LacZ表達SeV載體。血中IL-10以IL-10表達SeV載體特異性及劑量依賴 性的方式被檢出。圖2
大腦新皮質頭頂葉及海馬的老年斑圖(抗A(3抗體染色)。載體給藥4 周后(上圖面)和8周後(下圖面)，SeV18+mlL10/TSAF群(右)大腦新 皮質的老年斑(紅褐色斑狀物)明顯少於SeV18+LacZ/TSAF群(左)。圖3
老年斑佔大腦新皮質的面積率(％ )示意圖(平均士SE)。通過圖像解 析軟體測出給藥8周後大腦新皮質中老年斑的面積率(％ )， SeV18+mlL10/TSAF群明顯(p<0.01 Student t檢驗)少於對照群
(SeV18+LacZ/TSAF群)。
圖4
嗅球中的小膠質細胞活性化(Iba-1染色)示意圖。給藥4周後(上圖 面)和8周後(下圖面)，SeV18+mlL10/TSAF群(右)嗅球的活性化小膠 質細胞(紅褐色的變形細胞)明顯多於SeV18+LacZ/TSAF群(左)。圖5
Iba-l染色嗅球切片的一個分區中的小膠質細胞面積的比率(％ )圖(平 均士SE)。通過圖像解析軟體測出的給藥8周後嗅球的一個分區中Iba-l陽
7性小膠質細胞面積率(％ ) , SeV18+mlL10/TSAF群明顯(p<0.01 Student t test)多於對照群(SeV18+LacZ/TSAF群)。圖6
IL-10表達SeV載體給藥後腦組織中的A卩量的測定圖。對照使用了 LacZ表達SeV載體。IL-10表達SeV載體給藥群幾乎所有級分均可見A卩 量減少，尤其可溶性A(340 ( TBS級分、1% Triton級分)和不溶性Ap42 (蟻 酸級分)明顯減少。圖7
IL-10表達SeV載體給藥後正常小鼠血中IL-10量的測定圖。血中IL-10 以劑量依賴性的方式被檢出。圖8
IL-10表達SeV載體給藥後的血中IL-10量動力學圖。 SeV18+mlL10/TSAF —次經鼻給藥(5xl07 CIU/只)得到的值為AUC = 176,000 pg h/ml。圖9
IL-10表達SeV載體給藥後的血中IL-10的腦內轉移示意圖。對正常 C57BL/6N小鼠(N=5 )以5xl08 CIU/只/53(！1經鼻給藥SeV18+mlL10/TSAF 或SeV18+LacZ/TSAF。對照組同量給藥DPBS(-)。給藥第3天回收腦(分為 嗅球、大腦/海馬、小腦/延髓3部分)、鼻黏膜、氣管/肺、血漿，使用ELISA 對各組織中的mIL-lO進行了定量。
(B)為(A)嗅球、大腦/海馬及小腦/延髓中mlL-10表達量的縱坐標放大圖。
圖1 0
IL-10表達SeV載體經鼻給藥後的IL-10腦內轉移示意圖。對正常 C57BL/6N小鼠(N=5 )以5xl08 ClU/只/53fi1經鼻給藥SeV18+mlL10/TSAF 或SeV18+LacZ/TSAF。對照組同量給藥DPBS(-)。給藥第3天回收了灌流腦。 使用ELISA對腦(分為嗅球、大腦/海馬、小腦/延髓3個部分)、鼻黏膜、 氣管/肺及血漿中的mlL-10進行了定量。
(B)為(A)嗅球、大腦/海馬及小腦/延髓中mlL-10表達量的縱坐標放大圖。
圖1 1IL-10表達SeV載體經鼻給藥後的IL-10腦內轉移示意圖。對正常 C57BL/6N小鼠(N=5 )以5xl08 ClU/只/53ial經鼻給藥SeV18+mlL10/TSAF 或SeV18+LacZ/TSAF。對照組同量給藥DPBS(-)。給藥第7天回收腦(分為 嗅球、大腦/海馬、小腦/延髓為3等分)、鼻黏膜、氣管/肺、回收血漿，使 用ELISA對各組織中的mIL-lO進行了定量。
(B)為(A)嗅球、大腦/海馬及小腦/延髓中mlL-10表達量的縱坐標放大圖。
圖1 2
IL-10表達SeV載體經鼻給藥後IL-10腦內轉移示意圖。對正常 C57BL/6N小鼠(N=5 )以5xl08 CIU/只/53nl經鼻給藥SeV18+mlL10/TSAF 或SeV18+LacZ/TSAF。對照組同量給藥DPBS(-)。給藥第7天回後回收灌流 腦。使用ELISA對腦(分為嗅球、大腦/海馬、小腦/延髓3個部分)、鼻粘 膜、氣管/肺及血漿中的mlL-10進行了定量。
(B)為(A)嗅球、大腦/海馬及小腦/延髓中mlL-10表達量的縱坐標放大圖。
圖1 3
IL-10表達SeV載體經鼻給藥後的IL-10腦內轉移(CSF內濃度)示意 圖。對正常Wistar大鼠(N=5 )以lx109 CIU/只/106pl經鼻給藥 SeV18+mlL10/TSAF (大鼠#1-#5)或SeV18+LacZ/TSAF (大鼠#6畫#10)。 對照組同量給藥DPBS(-)(大鼠#11-#15)。給藥後第3天回收血漿和腦脊 髓液，使用ELISA對mIL-10進行了定量。圖1 4
正常小鼠(C57BL/6N) IL-10蛋白質皮下給藥後的血中IL-10量動力學 圖。背部皮下給藥源自重組小鼠的IL-10(2.0嗎/10(Hil/只)，使用ELISA對 血中mIL-lO進行定量。得到的值為AUC = 40,800 pg h/ml 。 Cmax二約 12，000pg/ml; Tmax:約1.5hr; t1/2 =約lhr (初始值)。圖1 5
APP小鼠IL-10蛋白質皮下給藥後的血中IL-10量示意圖。圖1 6
APP模型小鼠(Tg2576 ) IL-10連續皮下給藥的效果照片。顯示了抗A卩 抗體(4G8)的大腦新皮質頭頂葉和海馬切片的免疫染色結果。上圖面表示IL-10給藥群的結果，大腦新皮質中可見少量的老年斑(茶色斑點)。下圖
面表示DPBS(-)給藥群的結果，大腦新皮質多見老年斑。圖1 7
IL-10連續皮下給藥的APP模型小鼠(Tg2576)中老年斑的半定量結果 圖。按老年斑的大小分別設定大斑9分、中斑3分、小斑1分，算出腦全 部範圍(腦幹、小腦除外)可觀察到的老年斑合計分，在群間進行統計分 析(Student's t檢驗、平均士標準誤差)。圖1 8
IL-10連續皮下給藥的APP模型小鼠(Tg2576 )的嗅球、大腦新皮質及 海馬的老年斑面積比率圖(Studentt檢驗)。
圖注表記I L -10為I L -10給藥群、DPBS (-)為DPBS (-)給藥
群的結果。
發明的
具體實施例方式
阿爾茨海默病治療和預防藥物。載體有質粒、棵DNA、核糖體組分及病毒 載體等。本發明尤其涉及用於阿爾茨海默病治療或治療藥物開發的攜帶抗 炎症細胞因子基因的負鏈RNA病毒載體以及包含該載體的阿爾茨海默病治 療和預防藥物組合物。負鏈RNA病毒(也記述為(-)鏈RNA病毒)是以負 鏈RNA (與編碼病毒蛋白的有義鏈互補的反義鏈)為基因組的病毒。負鏈 RNA病毒也可稱為負鏈RNA病毒。本發明中所使用的負鏈RNA病毒尤其 優選單鏈負鏈RNA病毒(也可稱非分節型(non-segmented)負鏈RNA病 毒)。所謂單鏈負鏈RNA病毒是指以一條負鏈RNA為基因組的病毒。該 類病毒包4舌屬副粘病毒(包含副粘病毒一牛(Paramyxoviridae);副粘病毒屬 (genus Paramyxovirus),麻滲病毒屬(genus Morbillivirus)，月思&泉炎病毒屬 (genus Rubulavims)以及肺病毒屬(genus Pneumovirus)等)、腮腺炎病毒(包含 彈狀病毒科(Rhabdoviridae);水泡性病毒屬(genus Vesiculovirus),萊薩病毒 屬(genus Lyssavirus)，以及短暫熱病毒屬(genus Ephemerovirus)等)、纖絲病毒 科(Filoviridae)等病毒科的病毒。本發明的負鏈RNA病毒載體可以是具有傳 播性或非傳播性的載體。"傳播性"是指，病毒載體感染宿主細胞時，在該細 胞內病毒可以進行自我複製，並產生感染性病毒粒子。
本發明中尤其優選的負鏈RNA病毒具體包括，屬於副粘病毒科
10(Paramyxoviridae)病毒的仙臺病毒(Sendai virus)、 新城疫病毒(Newcastle disease vims)、月思腺炎病毒(mumps virus)、麻滲病毒(measles virus)、 RS病毒 (respiratory syncytial virus)、 牛瘕病毒(rinderpest virus)、 瘋熱病毒(distemper virus)、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒1型和2型及3型；屬於正粘病 毒牙牛(Orthomyxoviridae)的流感病毒；屬於彈4犬病毒-牛(Rhabdoviridae)的水泡 性口內炎病毒(Vesicular stomatitis vims)及狂犬病毒(rabies vims)等。
本發明優選使用副粘病毒。副粘病毒是指屬於副粘病毒科 (Paramyxoviridae )的病毒或其衍生物。副粘病毒中優選使用副粘病毒亞科 (Paramyxovirinae)(包4舌呼吸道病毒屬(Respirovirus)、月思&泉炎病毒屬和麻滲 病毒屬(Morbillivirus), 以及肺病毒亞牙+ (Pneumovirinae)(包4舌肺病毒屬 (Pneumovims)和間質'I"生月申病毒屬(Metapneumovirus》等病毒；更優選p乎吸道 病毒屬(genus Respirovirus )(也稱副粘病毒屬)的病毒或其書f生物。書亍生物 包含為了不破壞、病毒基因導入能力而改變病毒基因的病毒以及化學修飾 病毒等。本發明適用的呼吸道病毒屬如人副流感病毒1型(HPIV-1)、人 副流感病毒3型(HPIV-3 )、牛副流感病毒3型(BPIV-3 )、仙臺病毒(Sendai virus;也稱小鼠副流感病毒1型)以及猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。 本發明中的副粘病毒最優選仙臺病毒。這些病毒可源自天然林，野生型抹， 突變抹，實驗室傳代株，人工構建抹等。
本發明中的"載體"是將核酸導入細胞的承運體。仙臺病毒等負鏈RNA 病毒作為基因導入載體非常優越，在它們的生命周期內，沒有DNA期，僅 通過宿主細胞的細胞質進行轉錄和複製，所以不會整合(integration)到染 色體。因此，不會造成由染色體異常所導致的癌化或永生化等安全問題。 負RNA病毒的這種特徵在作為載體使用時對其安全性具有重大意義。從表 達外來基因的結果來看，即使對仙臺病毒進行連續多次傳代，也基本上不 發生鹼基突變。這表明其基因組具有高度穩定性，並且能長期穩定表達所 插入的外來基因(Yu，D.etal., Genes Cells 2， 457-466 (1997))。同時，因缺失 衣殼結構蛋白，所以在插入基因的大小或包裝的柔軟性(flexibility)等性質上 也具有優勢。
本發明的負鏈RNA病毒載體可以是，例如負鏈RNA病毒的基因組RNA 和病毒蛋白形成的複合體，即核糖核蛋白體(RNP)。具體來說，這種RNP 是包含負鏈RNA病毒的基因組RNA、 N蛋白、P蛋白、和L蛋白的複合體。RNP導入細胞後，在病毒蛋白的作用下，從基因組RNA轉錄編碼病毒蛋白 的順反子的同時，基因組也進行自我複製，形成子代RNP，所以可以期待 進行持續表達。向細胞導入RNP時，可以與所期望的轉染試劑一起組合導 入。對於基因組RNA的複製，可以通過RT-PCR、 Northern雜交等檢測RNA 拷貝數的增加來確認。
本發明的負鏈RNA病毒載體優選負鏈RNA病毒的病毒粒子。術語"病 毒粒子"是指在病毒蛋白的作用下由細胞中釋放出的核酸微粒子。負鏈RNA 病毒的病毒粒子的結構是，由基因組RNA和病毒蛋白形成的上述RNP被 包在源自細胞膜的脂質膜(也稱包膜)中。病毒粒子可以具有感染性。感染性 是指，負RNA病毒載體由於具有細胞吸附能力和膜融合能力，而能夠將載 體內部的核酸導入吸附著的細胞內的能力。本發明的負鏈RNA病毒載體可 以是具有傳播能力或不具有傳播能力的載體。"具有傳播能力"是指，病毒載 體感染宿主細胞時，在該細胞內病毒可以進行自我複製，並產生感染性病 毒粒子。
負鏈RNA病毒載體的基因組RNA以反義序列編碼攜帶基因。通常， 負鏈RNA病毒的基因組在3，前導區和5，尾隨區之間病毒基因成反義序列排 列。各基因的開放閱讀框(ORF)之間呈轉錄終止序列(E序列)-間插序列(I序 列)-轉錄起始序列(S序列)，由此，編碼各基因ORF的RNA可以分別被轉 錄成單獨的順反子。本發明載體的基因組RNA反義編碼該RNA編碼的基 因群的表達以及RNA本身自我複製所需的病毒蛋白N(核衣殼，又稱核蛋白 (NP))、 P(磷)和L(大蛋白)。該RNA還可以編碼形成病毒粒子所需的M(基 質)蛋白。該RNA進而還可以編碼病毒粒子感染所需的包膜蛋白。負鏈RNA 病毒的包膜蛋白具體包括產生細胞膜融合的F(融合)蛋白以及病毒吸附於細 胞所需的HN(血凝素-神經氨酸酶)蛋白或H(血凝素)蛋白。但是，某些特定 細胞的感染並不需要HN蛋白(Markwell， MA. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(4): 978-982 (1985))，只要有F蛋白便可感染。RNA也可以編碼除了 F蛋白及/或HN蛋白以外的包膜蛋白。
例如，副粘病毒亞科各病毒的基因通常表述如下。NP基因通常也可表 示為"N"。另外，HN不具有神經氨酸酶活性時表述為H(血凝素)。
呼吸道病毒 NPP/C/V M F HN- L
腮腺炎病毒 NP P/V M F HN(SH)L
12麻滲病毒 NPP/C/V M F H- L
本發明的負鏈RNA病毒載體也可以缺損野生負鏈RNA病毒中的某幾 個基因。病毒基因組RNA只要編碼RNP重構時所需的病毒蛋白(N、 L及 P)，即使不編碼包膜構成蛋白也可在細胞內進行複製，表達攜帶基因。例如， 雖然因病毒種類而異，^旦可以例示至少缺失一種以上編碼F、 H、 HN、 G、 M及Ml等包膜構成蛋白的基因(WO 00/70055及WO 0(V70070; Li， H,O. et al" J. Virol. 74(14): 6564-6569,2000)。具體來說，對副粘病毒載體來說，不 含M、 F、 HN基因或它們的任意組合的病毒載體也可用作本發明優選使用 的載體。這種病毒載體可以通過例如外源性提供所缺失的基因產物來進行 重構。如此製備的病毒載體和野生型病毒一樣，吸附於宿主細胞後，產生 細胞融合。但由於導入細胞中的載體基因組中缺失病毒原本具有的某一基 因，不會形成與本來的病毒具有同樣感染力的子代病毒粒子。因此，這種 病毒是一種具有一次性基因導入能力的安全實用型病毒載體。基因組中缺 失的基因為，例如F基因及/或HN基因。至少缺失F基因的載體是本發明 的優選。例如，通過將表達F基因缺失型重組負鏈RNA基因組的質粒載體 與F蛋白表達載體和P、 L蛋白表達載體一起轉染宿主細胞，可以重構病毒 載體(國際
發明者井上誠, 原裕人, 巖崎仁, 德炭由美子, 田畑壽晃, 長谷川護 申請人:生物載體株式會社