一種來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3⁺CD56⁺細胞的製備方法

2023-06-18 07:45:56

專利名稱：一種來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3+CD56+細胞的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞培養和免疫療法，尤其涉及一種高殺傷K562細胞的⑶3+CD56+細胞的製備方法。
背景技術：
⑶3+CD56+細胞是一種在體外利用多種細胞因子誘導的免疫細胞。由人血液中的單個核細胞在體外用多種細胞因子共同培養一段時間後獲得。由於該種細胞同時表達⑶3+ (⑶3+為T細胞表面特異性蛋白，僅存在於T細胞表面)和⑶56+ (⑶56+為NK細胞表面特異性蛋白)兩種膜蛋白分子，故又被稱為NK細胞(natural killer cell,自然殺傷細胞)樣T淋巴細胞(N KT細胞)，兼具T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC(major histocompatibility complex主要組織相容性複合體)限制性殺瘤優點。相對於LAK細胞(lymphokine activated killer cells,淋巴因子激活的殺傷細胞)以及CTL細胞(cytotoxic T-1ymphocyte cells,細胞毒性T淋巴細胞),其表現出更強的殺傷能力與更廣的殺瘤譜。⑶3+CD56+細胞在正常人外周血中含量極低，僅1% — 5%。因此，在體外培養中，提高其絕對數量對提高臨床治療效果至關重要。目前的經典製備方法為:採集人體外周血，分離得到單個核細胞，將單個核細胞置於培養液中，加入多種細胞因子誘導其分化(如抗CD3單克隆抗體、IL-2和IFN- Y等)培養至第21天，收穫得到⑶3+⑶56+細胞。但這種方法獲得的CD3+CD56+細胞的培養周期過長且細胞毒活性不夠理想。以下是現有技術的一種方案:1、採集自體外周血，存放於密閉容器中，以枸櫞酸鈉抗凝。2、將採集的血液經離心分離，得到外周血單個核細胞。3、調節細胞濃度I X 106/mL,並加入細胞因子IFN- Y至其終濃度為1000U/mL，於37 0C，5%C02培養箱中孵育24h。4、24h後加入IL-2、抗CD3單克隆抗體及IL-1，至IL-2終濃度為300 500U/mL，抗⑶3單克隆抗體終濃度為50ng/mL及IL-1終濃度為100U/mL。之後每隔3天半量換液，全量補充IL-2。5、第21天收穫細胞。此方案的缺點是:1、現有技術採用病人自體外周血，受病人個體差異的影響較大，不利於產業化製備，給臨床推廣帶來了難度。2、外周血屬於發育成熟的機體組織，細胞增殖潛力較小，受病毒感染的風險高，且年齡越大細胞活性越低。3、枸櫞酸鈉抗凝劑本身對細胞有一定的毒性，並且其用量較大，鹼性強，對血液成分的影響較大。
4、現有技術所製備的免疫細胞，其對腫瘤細胞的殺傷性還有待提高。有鑑於此，如何設計一種⑶3+⑶56+細胞的製備方法，以解決現有技術製備周期較長及細胞的增值潛力較小的現象，是業內人士亟需解決的問題。

發明內容
針對現有技術中，血液成分的穩定性不佳、採集過程缺乏安全性，並且細胞的製備周期較長，增殖潛力較小等缺陷，本發明提供了一種來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的⑶3+⑶56+細胞的製備方法。根據本發明，提供了一種來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的⑶3+⑶56+細胞的製備方法，其中，從圍產期胎盤血中分離單個核細胞以誘導分化形成CD3+CD56+細胞。優選地，包括以下步驟:a.採集所述圍產期胎盤血於密閉容器內；b.從所述圍產期胎盤血中分離單個核細胞；以及c.誘導分化所述單個核細胞。優選地，所述步驟a中，所述圍產期胎盤血以含肝素鈉抗凝劑抗凝。優選地，用含肝素鈉抗凝劑的採血袋進行採血，搖勻後，將所述採血袋和生物冰袋一起放入保溫箱， 保持溫度為4 25°C，溫差不超過±5°C，在6小時內運送所述採血袋至實驗室，且運輸途中避免血液經X線照射並遠離輻射源。優選地,所述步驟b包括:bl.向第一離心管中加入淋巴細胞分離液，將所述圍產期胎盤血以等體積D-Hank’s液稀釋混勻，並將稀釋後的所述圍產期胎盤血緩慢疊加於所述淋巴細胞分離液之上，保持液層分界清晰；稀釋後的所述圍產期胎盤血體積與所述淋巴細胞分離液體積比為2:1 ；b2.將所述第一離心管進行離心，其中，以800 1200g的離心力在10 25°C下離心25 30min ；b3.吸取所述第一離心管內的上層血漿，密封並冷藏，冷藏溫度為-20°C，吸取所述第一離心管內的單個核細胞層液體，移入第二離心管內；b4.向所述第二離心管內加入D-Hank’s液以稀釋所述單個核細胞層液體，所述D-Hank’s液與所述單個核細胞層液體的體積比為5:1，離心洗滌所述第二離心管，去除上清；以及b5.用含體積濃度為10%胎牛血清的RPM1-1640培養液重懸所述單個核細胞，調節所述單個核細胞密度為I 3X 106/mL。優選地,所述步驟b4中，以300 500g的離心力在4°C下離心5 lOmin。 優選地,所述步驟c包括:Cl.將所述步驟b5中的所述含單個核細胞的培養液移入培養瓶，加入IFN- y至所述IFN-Y終濃度為500 1600U/mL，將所述培養瓶置於37°C，CO2的體積濃度為5%的培養箱中孵育24h ；c2.繼續向所述培養瓶內加入IL-2、抗⑶3單克隆抗體、SCF及IL-1至所述IL_2終濃度為500 1000U/mL，所述抗⑶3單克隆抗體終濃度為50 100ng/mL，所述SCF終濃度為40 80ng/mL及所述IL-1終濃度為100 300U/mL，然後每隔1 3天半量換液，全量補充IL-2、抗⑶3單克隆抗體、IL-1、SCF，保證細胞密度處於1 3X 106/mL ;以及c3.至第14 17天收穫經分化的所述單個核細胞，離心並用所述培養液重懸，檢測所述單個核細胞中CD3+CD56+細胞含量。優選地，所述步驟Cl中，所述IFN- Y的終濃度為1000U/mL。優選地，所述步驟c2中，所述IL-2的終濃度為750U/mL。優選地，所述步驟c2中，所述抗⑶3單克隆抗體的濃度為75ng/mL，所述SCF的濃度為55ng/mL,所述IL-1的濃度為150U/mL。本發明的優點是:1、重新選擇抗凝劑，設計新型採血裝置，保證血液成分的穩定性以及採集過程的方便安全。2、採集圍產期胎盤血以從中分離單個核細胞，其增殖潛力比外周血單個核細胞更高，受病毒感染的風險更低。3、重新調整細胞因子的使用，進一步提高細胞增殖數量。4、縮短了製備周期，便於產業化實施。


為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖1示出了依據本發明的來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的⑶3+⑶56+細胞的製備方法中，離心第一離心管後的液體分層狀態示意圖。圖2A 2F示出了在100倍顯微鏡下觀察到的依據本發明收穫的單個核細胞在不同培養時間下的細胞狀態。圖3A 3F示出了不同時期細胞群體中⑶3+CD56+細胞含量流式檢測圖。圖4A與4B示出了 1號圍產期胎盤血通過本發明最終達到的細胞群體中⑶3+⑶56+細胞含量流式檢測圖譜。圖5A與5B示出了 2號圍產期胎盤血通過本發明最終達到的細胞群體中⑶3+⑶56+細胞含量流式檢測圖譜。圖6A與6B示出了 3號圍產期胎盤血通過本發明最終達到的細胞群體中⑶3+⑶56+細胞含量流式檢測圖譜。圖7A與7B示出了 4號圍產期胎盤血通過本發明最終達到的細胞群體中⑶3+⑶56+細胞含量流式檢測圖譜。圖8A與8B示出了 5號圍產期胎盤血通過本發明最終達到的細胞群體中⑶3+⑶56+細胞含量流式檢測圖譜。圖9A 9F示出了對K562細胞殺傷性實驗結果圖。圖10示出了本方案與對照方案獲取的效應細胞對K562細胞的殺傷效果對照圖。圖1lA 1lC示出了對Hela細胞殺傷性實驗結果圖。圖12示出了本方案與對照方案獲取的效應細胞對Hela細胞的殺傷效果對照圖。圖13A 13C示出了對A549細胞殺傷性實驗結果圖。圖14示出了本方案與對照方案獲取的效應細胞對A549細胞的殺傷效果對照圖。
具體實施例方式下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。 本發明的來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的⑶3+CD56+細胞的製備方法包括以下步驟:a.採集圍產期胎盤血於密閉容器內。首先，在新生兒娩出後10秒鐘內，在距新生兒臍部5 8cm處用兩把止血鉗夾住，在兩鉗間結紮兩處，從中間剪斷該新生兒的臍帶，抱走新生兒正常處理。從遠離臍帶一端的臍靜脈充盈處用紗布仔細擦拭、消毒，將該圍產期胎盤血採集於密閉容器內，並用含肝素鈉抗凝劑進行抗凝。例如，可以用特製的含肝素鈉抗凝劑的採血袋進行採血。具體操作是將採血袋針頭刺入消毒部位的臍靜脈，通過臍靜脈抽取胎盤血。採集結束封閉採血袋管。將採集的血液迅速與袋內抗凝劑搖勻，避免發生凝血。將採血袋和生物冰袋一起放入特製的保溫箱，保持溫度為4 25°C，其中，溫差不超過±5°C，並且在6小時內要將採血袋運送至實驗室，且運輸途中應該避免血液經X線照射並遠離輻射源。b.從圍產期胎盤血中分離單個核細胞。接著，取第一離心管，向其中加入淋巴細胞分離液，然後用D-Hank’s液稀釋圍產期胎盤血，D-Hank’s液與圍產期胎盤血的體積相等，並且使得D-Hank’s液與圍產期胎盤血混合均勻，將稀釋後的圍產期胎盤血緩慢疊加於第一離心管內的淋巴細胞分離液之上，保持液層分界清晰，稀釋後的圍產期胎盤血體積與淋巴細胞分離液體積之比為2:1。將第一離心管內的混合液進行離心，其中，以800 1200g的離心力在10 25°C下離心25 30min，例如離心力可以為900g，溫度可以為20V,離心時間可以為25min。圖1示出了依據本發明的來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3+CD56+細胞的製備方法中，離心第一離心管後的液體分層狀態示意圖。參照圖1，第一離心管10內的混合液經過離心後分層，其中，上層液體101為血漿層，底層液體102為紅細胞、粒細胞層，而中間上層液體103為單個核細胞層，中間下層液體104為淋巴細胞分離液層，吸取血漿層液體並將其密封冷藏，冷藏溫度為_20°C，吸取單個核細胞層液體，移入第二離心管內。向第二離心管內加入D-Hank’s液以稀釋第二離心管內的單個核細胞層液體，其中，D-Hank’s液與單個核細胞層液體的體積比為5:1，以300 500g的離心力，在4°C下離心第二離心管內的D-Hank’s液與單個核細胞層液體混合液5 lOmin，例如，離心力可以為400g，溫度可以為4°C，離心時間可以為8min，並對其進行洗滌，然後去除上清，並再重複離心洗滌I次。接下來，用體積濃度為10%的胎牛血清的RPM1-1640培養液重懸單個核細胞，並調節單個核細胞的密度為I 3X 106/mL。c.誘導分化單個核細胞。將上述含單個核細胞的培養液移入培養瓶，加入IFN- y至其終濃度為500 1600U/mL，培養瓶可以為T75培養瓶，然後將培養瓶置於37°C，CO2的體積濃度為5%的培養箱中孵育24h後，繼續向培養瓶內加入IL-2、抗CD3單克隆抗體、SCF及IL-1至IL-2終濃度為500 1000U/mL，抗⑶3單克隆抗體終濃度為50 100ng/mL，SCF終濃度為40 80ng/mL及IL-1終濃度為100 300U/mL，具體地，至IFN- y的終濃度為1000U/mL，IL-2的終濃度為750U/mL，抗CD3單克隆抗體的濃度為75ng/mL，SCF的濃度為60ng/mL，IL-1的濃度為200U/mL。然後每隔I 3天半量換液，全量補充IL-2、抗⑶3單克隆抗體、IL-1、SCF，保證細胞密度處於I 3X 106/mL。等到第14 17天收穫經分化的單個核細胞，離心並用培養液重懸，檢測單個核細胞中CD3+CD56+細胞含量。實施例1首先，新生兒娩出後10秒鐘的時間內，在距新生兒臍部6cm處用兩把止血鉗夾住，在兩鉗間結紮兩處，從中間剪斷該新生兒的臍帶，抱走新生兒正常處理。從遠離臍帶一端的臍靜脈充盈處用紗布仔細擦拭，以進行消毒。消毒後用特製的含肝素鈉抗凝劑的採血袋來採集圍產期胎盤血。具體操作是將針頭刺入經過消毒部位的臍靜脈，通過臍靜脈抽取圍產期胎盤血。採集結束後封閉採血袋管，並將採集的血液迅速與袋內抗凝劑搖勻，避免發生凝血。接著將採血袋和生物冰袋一起放入特製的保溫箱，保溫箱中保持溫度為14°C，並且在6小時內將採血袋運送至實驗室，且運輸途中避免血液照射到X線並遠離輻射源，以保證圍產期胎盤血的質量。接著，取第一離心管，向其中加入淋巴細胞分離液，用D-Hank』 s液與圍產期胎盤血混合均勻以對圍產期胎盤血進行稀釋，D-Hank’s液與圍產期胎盤血的體積相等，將稀釋後的圍產期胎盤血緩慢疊加於第一離心管內的淋巴細胞分離液之上，保持液層分界清晰。稀釋後的圍產期胎盤血體積與淋巴細胞分離液體積之比為2:1。將第一離心管內的混合液進行離心，離心力為900g，溫度為20°C，離心時間為25min。參照圖1，第一離心管10內的混合液經過離心後分層，其中，上層液體101為血漿層，底層液體102為紅細胞、粒細胞層，而中間上層液體103為單個核細胞層，中間下層液體104為淋巴細胞分離液層，吸取血漿層液體並將其密封冷藏，冷藏溫度為-20°C，吸取單個核細胞層液體，移入第二離心管內。向第二離心管內加入D-Hank’s液以稀釋第二離`心管內的單個核細胞層液體，其中，D-Hank’s液與單個核細胞層液體的體積比為5:1，以400g的離心力，在4°C下離心第二離心管內的D-Hank’s液與單個核細胞層液體混合液5min，並對其進行洗滌，而且可以重複離心洗滌一次，然後去除上清。接下來，用含10%的體積濃度的胎牛血清的RPM1-1640培養液重懸單個核細胞，並調節單個核細胞的密度為2X 106/mL。最後，將上述含單個核細胞的培養液移入T75培養瓶，加入IFN- Y至其終濃度為1000U/mL,置於37°C，CO2的體積濃度為5%的培養箱中孵育24h後，繼續向T75培養瓶內加入IL-2、抗⑶3單克隆抗體、SCF及IL-1至IL-2終濃度為1000U/mL，抗⑶3單克隆抗體終濃度為50ng/mL，SCF終濃度為40ng/mL及IL-1終濃度為100U/mL，然後每隔2天半量換液，全量補充IL-2、抗⑶3單克隆抗體、IL-1、SCF，保證細胞密度處於2X106/mL。等到第14 17天收穫經分化的單個核細胞，離心並用培養液重懸，檢測單個核細胞中CD3+CD56+細胞含量。檢測上述收穫的單個核細胞中的⑶3+CD56+細胞含量。圖2A 2F示出了在100倍顯微鏡下觀察到的依據本發明收穫的單個核細胞在不同培養時間下的細胞狀態，其中，圖2A為剛接種的單個核細胞，圖2B為第4天的單個核細胞，圖2C為第7天的單個核細胞，圖2D為第10天的單個核細胞，圖2E為第13天的單個核細胞，圖2F為第14天的單個核細胞。由圖2A 2F可見，隨著時間的延長，細胞形態逐步發生改變，從圓形拉長變成蝌蚪狀，最後變成不規則形狀。從開始增殖至第14天，統計每次換液前後細胞數量，計算得出總增殖倍數平均可達100倍以上。圖3A 3F示出了不同時期細胞群體中CD3+CD56+細胞含量流式檢測圖，其中，圖3A與圖3B為未分化的單個核細胞中，且圖3B為圖3A中圈出區域的流式檢測圖；圖3C與圖3D為第7天的單個核細胞，且圖3D為圖3C中圈出區域的流式檢測圖；圖3￡與圖3F為第13天的單個核細胞，且圖3F為圖3E中圈出區域的流式檢測圖。由圖3A 3F可見，象限UR中即CD3+CD56+細胞，其比例隨著培養時間的延長不斷升高。具體數據見表I。表I不同培養時期流式檢測結果
權利要求
1.一種來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的⑶3+⑶56+細胞的製備方法，其特徵在於，從圍產期胎盤血中分離單個核細胞以誘導分化形成CD3+CD56+細胞。
2.如權利要求1所述的來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3+CD56+細胞的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: a.採集所述圍產期胎盤血於密閉容器內； b.從所述圍產期胎盤血中分離單個核細胞；以及 c.誘導分化所述單個核細胞。
3.如權利要求1所述的來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3+CD56+細胞的製備方法，其特徵在於，所述步驟a中，所述圍產期胎盤血以含肝素鈉抗凝劑抗凝。
4.如權利要求3所述的來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3+CD56+細胞的製備方法，其特徵在於，用含肝素鈉抗凝劑的採血袋進行採血，搖勻後，將所述採血袋和生物冰袋一起放入保溫箱，保持溫度為4 25°C，溫差不超過±5°C，在6小時內運送所述採血袋至實驗室，且運輸途中避免血液經X線照射並遠離輻射源。
5.如權利要求1所述的來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3+CD56+細胞的製備方法，其特徵在於，所述步驟b包括: bl.向第一離心管中加入淋巴細胞分離液，將所述圍產期胎盤血以等體積D-Hank』 s液稀釋混勻，並將稀釋後的所述圍產期胎盤血緩慢疊加於所述淋巴細胞分離液之上，保持液層分界清晰；稀釋後的所 述圍產期胎盤血體積與所述淋巴細胞分離液體積比為2:1 ; b2.將所述第一離心管進行離心，其中，以800 1200g的離心力在10 25°C下離心25 30min ； b3.吸取所述第一離心管內的上層血漿，密封並冷藏，冷藏溫度為-20°C，吸取所述第一離心管內的單個核細胞層液體，移入第二離心管內； b4.向所述第二離心管內加入D-Hank’s液以稀釋所述單個核細胞層液體，所述D-Hank’s液與所述單個核細胞層液體的體積比為5:1，離心洗滌所述第二離心管，去除上清；以及 b5.用含體積濃度為10%胎牛血清的RPM1-1640培養液重懸所述單個核細胞，調節所述單個核細胞密度為I 3X 106/mL。
6.如權利要求5所述的來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3+CD56+細胞的製備方法，其特徵在於，所述步驟b4中，以300 500g的離心力在4°C下離心5 lOmin。
7.如權利要求1至6任一項所述的來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的⑶3+⑶56+細胞的製備方法，其特徵在於，所述步驟c包括: Cl.將所述步驟b5中的所述含單個核細胞的培養液移入培養瓶，加入IFN-Y至所述IFN- y終濃度為500 1600U/mL，將所述培養瓶置於37°C，CO2的體積濃度為5%的培養箱中孵育24h ； c2.繼續向所述培養瓶內加入IL -2、抗⑶3單克隆抗體、SCF及IL-1至所述IL-2終濃度為500 1000U/mL，所述抗⑶3單克隆抗體終濃度為50 100ng/mL，所述SCF終濃度為40 80ng/mL及所述IL-1終濃度為100 300U/mL，然後每隔I 3天半量換液，全量補充IL-2、抗⑶3單克隆抗體、IL-1、SCF，保證細胞密度處於I 3 X 106/mL ;以及 c3.至第14 17天收穫經分化的所述單個核細胞，離心並用所述培養液重懸，檢測所述單個核細胞中CD3+CD56+細胞含量。
8.如權利要求7所述的來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3+CD56+細胞的製備方法，其特徵在於，所述步驟Cl中，所述IFN-Y的終濃度為1000U/mL。
9.如權利要求7所述的來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3+CD56+細胞的製備方法，其特徵在於，所述步驟c2中，所述IL-2的終濃度為750U/mL。
10.如權利要求7所述的來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的⑶3+⑶56+細胞的製備方法，其特徵在於，所述步驟c2中，所述抗CD3單克隆抗體的濃度為75ng/mL，所述SCF的濃度為55ng/mL,所述IL-1的濃度為150U/mL。
全文摘要
本發明提出了一種來源於圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3+CD56+細胞的製備方法，從圍產期胎盤血中分離單個核細胞以誘導分化形成CD3+CD56+細胞。採用本發明可以縮短細胞的製備周期，同時提高細胞的增殖能力。
文檔編號C12N5/0783GK103173409SQ201310014428
公開日2013年6月26日 申請日期2013年1月15日 優先權日2013年1月15日
發明者劉樂鋒, 王溢文, 魏昌盛, 林強, 劉洋 申請人:江蘇和澤生物科技有限公司