乙醯普魯蘭多糖葉酸偶聯物的純化及其納米粒子的製備方法

2023-05-31 16:40:26

專利名稱：：乙醯普魯蘭多糖葉酸偶聯物的純化及其納米粒子的製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種乙醯普魯蘭多糖葉酸偶聯物(Folate-conjugatedpullulanacetate,FPA)的純化及其納米粒子(Folate-conjugatedpullulanacetatenanoparticles,FPAN)的製備方法。
背景技術：
：納米藥物載體是指能改變藥物進入人體的方式和在體內的分布，控制藥物的釋放速度並將藥物輸送到靶向器官的納米級別的體系，理想的藥物輸送載體具有以下特徵(WimHDeJong,etal.，IntJNanomedicine.2008,3(2)133-149；S.M.Moghimi,etal.，FASEBJ.2005,19(3)311-330；KarinaR,etal.，AdvDrugDelivRev.2008,60(8):929_938)能對藥物進行包封和很好地釋放、結構穩定、生物相容性好、低毒性和具有生物分布和靶向能力以及作用，另外，還需要輸送藥物後很好的生物降解性。靶向的藥物載體研究成為近年來研究的熱點，腫瘤分子靶向治療是指在腫瘤分子細胞生物學的基礎上，利用腫瘤組織或細胞所具有的特異性(或相對特異的)結構分子作為靶點，使用某些能與這些靶分子特異結合的抗體、配體等達到直接治療或導向治療目的的一類療法。這種治療方法具有較低的不良反應和良好療效，能明顯提高患者的生活質量，是現在腫瘤治療領域的突破性和革命性的發展，代表了腫瘤生物治療目前的最新的發展方向。葉酸是一種小分子量的維生索，其受體是一種糖蛋白，在人類癌症，包括卵巢、大腦、腎、乳房、脊髓細胞和肺等的惡性腫瘤，葉酸受體高於正常水平；而在絕大多數正常組織中，幾乎不表達。利用葉酸對葉酸受體的高度親和性，可用於將藥物或載體材料與葉酸偶聯，將藥物靶向輸送至腫瘤。以葉酸(或其類似物)為配體，從小分子放射性顯像劑到大分子基因藥物都可與葉酸高效結合，並被轉運進入細胞，葉酸連接的載體材料對葉酸受體高表達的腫瘤細胞也具有明顯的靶向作用。製備納米藥物載體的材料可以分為合成材料和天然材料，其中，多糖廣泛存在於自然界，是比較容易得到的一類重要的天然材料，含有羥基(-0H)、羧基(-C00H)和氨基(-NH2)等親水性基團，可反應基團較多，很容易被修飾和改性，生成很多種衍生物，已經被廣泛用於納米藥物及納米藥物載體的研究(ZonghuaLiu,etal.，AdvDrugDelivRev.2008,60(15)1650-1662)。普魯蘭多糖(Pullulan)由於具有良好的耐酸鹼性，可塑性強，成膜性好，透氣性低，無吸溼性，水溶液粘度明顯低於其它多糖溶液，近年來，科研人員逐漸認識到普魯蘭多糖的無毒，無致突變作用，良好生物相容性以及可生物降解性，可以作為一種良好的生物材料運用在藥物、基因遞送和組織工程等領域(RRMetal.,TrendsBiomaterArtifOrgans,2007,20(2)116-121；LeathersTD,etal.,ApplMicrobiolBiotechnol.2003,62(5-6)468-473；ShingelKI,etal.，CarbohydrRes.2004，339(3)447-460)。早在1986年，Motozato(MotozatoY，etal.,JChromatogra.1986,55:434_437)發現水溶性普魯蘭多糖經乙醯化改性可生成疏水性的乙醯普魯蘭多糖，這種物質容易通過溶劑揮發法製成微球。2003年，Jung等(JungSff,etal.，IntJPharm,2003,254(2)109-121)發現改變醋酐和吡啶的投料量可製備出不同取代度的乙醯普魯蘭多糖，用透析方法可製備出不同粒徑的納米粒子，螢光探針法研究證明納米粒子是通過自組裝方法形成，臨界膠束濃度隨乙醯取代度增加而減小，此納米粒子包載疏水性藥物後可延緩藥物的釋放。將乙醯普魯蘭多糖與氨苯磺胺偶聯(PA/SDM)連接可形成pH敏感性納米凝膠顆粒(NaK，etal.，JControlRelease.2003，87(1-3):3_13)，另外，本試驗室還將乙醯普魯蘭多糖採用溶劑擴散法製備納米粒子，並將其作為抗腫瘤藥物載體進行了研究(ZhangH.Z,etal.，ColloidSurfB.2009,71(1)19-26)，體外採用MTT法考察了其對正常成纖維細胞和Hela癌細胞的毒性。乙醯普魯蘭多糖結構中殘存的羥基還可以與配體結合形成靶向性載體材料，如引入生物素製成生物素受體靶向納米載體(NaK，etal.，EurJPharmSci.2003，18(2):165-173)，對生物素受體高表達腫瘤細胞有特異靶向作用，細胞攝取納米粒子的量隨生物素取代度的增加而增加；我們的前期研究(Hui-zhuZhang,etal.,DrugDelivery,2010；17(1)48-57)也已經成功合成了葉酸乙醯普魯蘭多糖偶聯物，並應用溶劑擴散法製備了納米粒子，試驗結果表明連接葉酸後的載藥納米粒子進入細胞主要通過葉酸受體途徑，提示葉酸偶聯納米粒子通過葉酸受體途徑進入細胞，可增加對腫瘤組織的選擇性，增強抗腫瘤療效，因而是一個很有發展前途的抗腫瘤藥物載體，但是，這種材料的合成有兩個步驟，如何將反應產物進行分離純化至關重要，另外，當合成的材料乙醯基取代度較低、葉酸取代度較高時，採用溶劑擴散法製備納米粒子，注入分散液中的針頭會帶有少量絮狀物，所製備的納米溶液乳光不強，納米懸液中有可見懸浮顆粒，高速離心(20000轉/分鐘，4°C，15min)後，溶液仍有有較強黃色，所收集到的納米粒子很少，大部分材料採用這種方法均不能成納米粒子。CN200810052708.6公開了葉酸受體介導靶向乙醯普魯蘭多糖納米粒子的製備。本發明在前期研究基礎上將產物應用常規試劑無水乙醇進行沉澱，碳酸鈉緩衝液進行透析來進行分離和純化，另外，通過透析法將這種材料製備納米粒子作為藥物載體，以上研究均未見任何文獻或專利報導。
發明內容本發明的目的是提供一種乙醯普魯蘭多糖葉酸偶聯物的純化方法及其納米粒子的製備方法。採用無水乙醇為沉澱試劑，和沉澱試劑甲醇比較，毒副作用明顯減小。對於葉酸取代度較高的乙醯普魯蘭多糖葉酸偶聯物而言，採用用透析法製備納米粒子顯著提高納米粒子的產率，形態規則，粒徑均勻，納米粒子表面所帶電荷低，穩定性好。步驟少，操作簡單，無需加入穩定劑、乳化劑等試劑。該材料具有良好的生物相容性、可降解性和無免疫原性。本發明提供的一種乙醯普魯蘭多糖葉酸偶聯物的純化及其納米粒子的製備方法包括的步驟1)將葉酸與乙醯普魯蘭多糖溶液在催化劑4-二甲氨基吡啶(DMAP)和碳化二亞胺(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)類脫水劑作用下反應，反應溫度為2528°C，反應時間為57天(根據需要合成產物的取代度選擇)，使縮合成葉酸_乙醯普魯蘭多糖偶聯物；所述的普魯蘭多糖分子量範圍為4，000200，OOODa02)將反應中生成的1，3-二環己基脲(D⑶)沉澱過濾除掉，濾液滴加入過量無水乙醇(體積比為150150)中沉澱，離心(速度為30008000轉/分鐘，時間為520分鐘和4°C)收集沉澱；3)用碳酸鈉緩衝液透析2448h以除盡游離葉酸，去離子水透析24_48h除去其他的小分子。所述透析袋為截留分子量為8000-14000的透析袋。4)真空乾燥或凍幹，得黃色粉末。所述的乙醯普魯蘭多糖溶液為溶解於二甲基亞碸(DMSO)中的溶液。所述的乙醯普魯蘭多糖葉酸DCCDMAP=10.350.361.50.170.6(摩爾比)。本發明提供的一種葉酸受體介導靶向乙醯普魯蘭多糖納米粒子製備方法乙醯普魯蘭多糖葉酸偶聯物完全溶解於與水混溶的有機溶劑中(有機相)，將溶解液轉移至透析袋中進行透析。有機溶劑為二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基亞颯(DMSO)或者其他有機溶劑以及有機溶劑和水按照一定比例稀釋的溶劑。所述透析時間為2448h，開始間隔12h換1次水，換4次後間隔46h換一次水。透析2448h後，可直接得到納米粒子懸液。本發明提供的一種葉酸受體介導靶向乙醯普魯蘭多糖包載藥物納米粒子(EpirubicinloadedFPAN,EPI-FPAN)製備方法是以乙醯普魯蘭多糖葉酸偶聯物為載體，包埋抗腫瘤藥物，粒徑為250500nm。所述的包載藥物納米粒子的製備方法是將藥物和材料分別溶解於有機溶劑中，藥物和材料按照一定的比例進行混合，充分混勻後轉移至透析袋中進行透析。所述的抗癌藥物與葉酸偶聯乙醯普魯蘭多糖納米粒子的質量比為11050。所述的有機溶劑為二甲基甲醯胺(DMF)或二甲基亞颯(DMSO)或者其他有機溶劑以及有機溶劑和水按照一定比例稀釋的溶劑。所述透析袋為截留分子量為8000-14000Da的透析袋。所用透析液為去離子水或者重蒸水。所述透析時間為2448h，開始間隔12h換1次水，換4次後間隔46h換一次水。所述的包載藥物為表阿黴素、阿黴素、柔紅黴素、全反式維甲酸、紫杉醇、甲氨蝶呤、喜樹鹼等。本發明所述的葉酸偶聯乙醯普魯蘭多糖納米粒子形態呈球形，粒徑分布範圍小，電位絕對值小，納米粒子和載藥納米粒子結構比較穩定，納米粒子靜脈注射給予動物後體內未見明顯無毒副作用。該材料具有良好的生物相容性、可降解性和無免疫原性，而且各種原料廉價易得，製備工藝簡單，製備條件可控，是一種較好的具有腫瘤靶向的載體材料。圖1為FPAN粒徑分布圖。圖2為FPAN的Zeta電位測定圖。圖3為EPI-FPAN粒徑分布圖。圖4為EPI-FPAN的Zeta電位測定圖。圖5為FPAN透射電鏡照片。圖6為EPI-FPAN透射電鏡照片。圖7為小鼠主要臟器的HE染色病理組織切片照片。具體實施例方式實施例1葉酸乙醯普魯蘭多糖偶聯物的沉澱和純化方法將Ig(2.27mmol)葉酸用15ml二甲基亞碸(DMSO)溶解，滴加5滴三乙胺，攪拌使完全溶解，加入0.9g(4.4mmol)N,N，-二環己基碳二亞胺(DCC)，0.25g(2.05mmol)4-二甲氨基吡啶(DMAP)，攪拌反應Ih後加入溶解於6.15mlDMSO中的0.615g乙醯普魯蘭多糖，電磁攪拌下避光反應5天。過濾除去D⑶沉澱，濾液滴加入250ml無水乙醇溶液中，離心(8000轉/分鐘，4°C，離心15min)收集黃色沉澱，碳酸鈉緩衝液中透析24h，去離子水中透析48h，凍幹或者真空乾燥，得黃色粉末，即為葉酸偶聯乙醯普魯蘭多糖衍生物。所得葉酸偶聯乙醯普魯蘭多糖衍生物的氫核磁光譜(1H-NMR)和本實驗室前期合成產物基本一致(CN200810052708.6)。在FPA1H-NMR中δ6.75-8.77ppm處出現葉酸的特徵峰，說明葉酸與乙醯普魯蘭多糖通過化學鍵相聯(圖略)。實施例2=FPA納米粒子的製備準確稱取48mg乙醯普魯蘭多糖葉酸偶聯物溶解於4.8ml二甲基亞碸中，濃度為10mg/ml，將溶解液轉移至透析袋進行透析，透析袋截留分子量為14000Da，透析液為去離子水，開始間隔12h換1次水，換4次後間隔46h換一次水，總共透析48h。最終溶液為帶黃色乳光的溶液，轉移至帶刻度的離心管中，IOOW超聲3分鐘後即為最終納米粒子懸液，最終濃度為所加入的材料(48mg)和最終納米粒子溶液的體積(12ml)比，為4mg/ml。可根據實驗需要用水或者其他溶液進行稀釋至目的濃度，或者高速離心(18000轉/分鐘，4°C，離心15min)收集納米粒子，加入水或者其他溶液進行重新分散至目的濃度。實施例3包載表阿黴素的FPA納米粒子的製備準確稱取乙醯普魯蘭多糖葉酸偶聯物40mg，溶解於3.2ml二甲基亞碸中，使濃度為12.5mg/ml。表阿黴素IOmg溶解於2ml二甲基亞碸中，濃度為5mg/ml，加入4.9μ1三乙胺(2倍摩爾量)，室溫條件下避光攪拌12h使表阿黴素脫鹽酸。將藥物/材料溶液按41體積比混合，將溶解液轉移至透析袋進行透析，透析袋截留分子量為lOOOODa，透析液為去離子水，開始間隔12h換1次水，換4次後間隔46h換一次水，總共透析48h。最終溶液為帶橘紅色乳光的溶液，轉移至帶刻度的離心管中，100W超聲3分鐘後即為最終納米粒子懸液，最終濃度為所加入的材料(40mg)和最終納米粒子溶液的體積(7ml)比，為5.7mg/ml。可根據實驗需要用水或者其他溶液進行稀釋至目的濃度，或者高速離心(18000轉/分鐘，4°C，離心15min)收集納米粒子，加入水或者其他溶液進行重新分散至目的濃度。實施例4納米粒子粒徑分布、Zeta電位和形貌觀察採用雷射粒度分析儀測定納米粒子粒徑分布及Zeta電位。將納米懸液稀釋成適當濃度(lmg/ml)放入比色杯中，將比色杯放入粒度儀樣品池中進行測試，每個樣品測試3次。將納米懸液滴在碳支持膜上，自然乾燥後用2%的磷鎢酸(pH6.0)負染，乾燥後在透射電鏡下進行觀察。將納米粒子懸液滴在矽片上，自然乾燥後進行不連續噴金3分鐘，在掃描電鏡下進行觀察。實施例5=FPAN和EPI-FPAN穩定性的考察將納米粒子溶液避光保存在2_8°C，每間隔一段時間採用雷射粒度分析儀測定納米粒子粒徑分布及Zeta電位。結果見表1和表2。表IFPAN納米粒子的粒徑分布和Zeta電位(；±s,η=3)tableseeoriginaldocumentpage7表2EPI-FPAN納米粒子的粒徑分布和Zeta電位η=3)tableseeoriginaldocumentpage7實施例6=FPAN體內毒性考察將ICR小鼠20隻，4-6周齡，體重17_22g，分為兩組，每組10隻，雌雄各半，分別尾靜脈注射FPA納米溶液125mg/kg和0.9%氯化鈉注射液，給藥後觀察動物的一般生理指標，食量和體重，連續觀察14天，實驗結束將動物進行剖檢，若有肉眼可見病變做病理檢查。結果見表3和表4。表3FPAN單次靜脈注射125mg/kg對小鼠體重的影響([切，g)tableseeoriginaldocumentpage7表4FPAN單次靜脈注射125mg/kg對小鼠食量的影響，g)tableseeoriginaldocumentpage7權利要求一種乙醯普魯蘭多糖葉酸偶聯物的純化及其納米粒子的製備方法，其特徵在於它包括的步驟1)將葉酸與乙醯普魯蘭多糖溶液在催化劑4-二甲氨基吡啶(DMAP)和碳化二亞胺脫水劑作用下反應，反應溫度為25～28℃，反應時間為5～7天，使縮合成葉酸-乙醯普魯蘭多糖偶聯物；2)將反應中生成的1，3-二環己基脲(DCU)沉澱過濾除掉，濾液滴加入體積比為1∶50～150的無水乙醇中沉澱，4℃下，3000～8000轉/分鐘離心，時間為5～20min，收集沉澱；3)用碳酸鈉緩衝液透析24～48h以除盡游離葉酸，去離子水透析24-48h除去其他的小分子。4)真空乾燥或凍幹，得黃色粉末。2.根據權利要求1所述的製備和純化方法，其特徵在於所述的乙醯普魯蘭多糖葉酸DCCDMAP的摩爾比=10.350.361.50.170.6。3.根據權利要求1所述的製備和純化方法，其特徵在於所述的乙醯普魯蘭多糖溶液為溶解於二甲基亞碸中的溶液。4.根據權利要求1所述的製備和純化方法，其特徵在於所述的普魯蘭多糖分子量範圍為4，000200，000。5.根據權利要求1所述的製備和純化方法，其特徵在於所述透析袋為截留分子量為8000-14000Da的透析袋。全文摘要本發明涉及乙醯普魯蘭多糖葉酸偶聯物的純化及其納米粒子的製備方法。25～28℃下，葉酸、乙醯普魯蘭多糖溶液、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和碳化二亞胺類脫水劑混合反應5～7天，把濾液滴加入過量無水乙醇沉澱，離心，收集沉澱，用碳酸鈉緩衝液透析24～48h，在去離子水中透析24-48h，凍幹或真空乾燥後得到材料。將材料溶解於二甲基亞碸(DMSO)或其他有機溶劑中，採用透析法製備納米粒子。本發明步驟少，操作簡單，重複性較好，不需添加其他穩定劑和乳化劑，納米粒子呈球形，粒徑均勻，電位絕對值低，穩定性好，單次靜脈注射給予小鼠未見明顯毒性。文檔編號C08B37/00GK101831000SQ201010179030公開日2010年9月15日申請日期2010年5月21日優先權日2010年5月21日發明者劉玲蓉,周志敏,唐紅波,張其清,張彤,李學敏,李磊,白永剛申請人:中國醫學科學院生物醫學工程研究所