一種定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子的方法及應用的製作方法

2023-05-23 22:29:01

專利名稱：一種定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子的方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種定量檢測土壤中馬鈴薯晚疫病病菌活體遊動孢子的方法及應用， 該方法可以定量、特異檢測土壤中馬鈴薯晚疫病病菌活體遊動孢子，從而可有效預報和跟蹤馬鈴薯生長過程中晚疫病的發生，屬農業生物技術領域。
背景技術：
馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯的一種毀滅性病害，己列為世界糧食作物第一大病害。晚疫病在馬鈴薯種植區普遍發生，田間產量損失達20 % 50 %，窖藏損失可達5 % 30 %，甚至會造成絕收。近年來，晚疫病的流行頻率和流行程度逐漸加重，成為馬鈴薯生產的一個重要障礙。馬鈴薯是世界第四大糧食作物(Reader，2009)，世界馬鈴薯晚疫病造成的損失已達 67億美元(Haverkort et al. , 2008)。中國已是世界上馬鈴薯生產的第一大國，中國每年因晚疫病損失高達10億美元。馬鈴薯晚疫病，主要由致病疫黴菌溈ora ia/^)引起。在適宜的環境條件下，晚疫病菌產生孢子囊隨氣流傳播侵染周圍的植株。因而土壤只要含有一定數量病菌或種下極少數的帶菌種薯，可能會導致整片地晚疫病的發生，目前檢測土壤和種薯晚疫病菌帶菌量的主要方法和技術有①田間檢測方法，主要通過觀察馬鈴薯晚疫病引起的主要組織症狀作為檢測鑑定證據，準確性較差，耗時費力(GB7331-2003中5. 1. 1. 2) 』② 實驗室檢測方法，該法利用馬鈴薯主要致病菌的生理生化特點，通過顯微鏡、病原菌復甦培養及生化等手段來檢測，較田間檢測方法準確性高，但檢測周期長，對晚疫病的預防檢測滯後(GB6682)。③分子生物學方法(Judelson and Tooley, 2000; Niepold and Schober -Butin, 1995; Tooley. , 1997; Trout et al.，1997)，這些方法都是利用 A ifl/esiafls 基因組DNA序列設計特異性引物，來檢測馬鈴薯葉片、塊莖等中的A infestans的數量， Ni印old等設計的引物能檢測侵染馬鈴薯組織的晚疫病菌，但靈敏度較低(Niepold and Schober - Butin, 1995) ；Trout 等(Trout et al.，1997)利用引物 ITS5 和 PINF 來檢測薯塊中的晚疫病菌，靈敏度較高，但特異性較差。Judelson和Tooley設計引物，擴增A infestans ^ ITS( Internal Transcribed Spaces)序列，特異性高(Judel son and Tooley, 2000)，但沒有實現對種薯及葉馬鈴薯晚疫病菌的檢測。徐安傳等設計引物，靈敏性和特異性也比較高(徐安傳等，2004)，但同樣沒能實現對馬鈴薯種植區土壤的檢測，不能為晚疫病的傳播做出預測。其它方法還有用馬鈴薯晚疫病菌的特異引物(I N F 1和I N F 2 )，可擴增檢測晚疫病菌純DNA、帶菌植株和薯塊(申請號/專利號200910111735)。由於土壤中馬鈴薯晚疫病菌DNA分子也包含死菌體的DNA，所以以上方法技術即使能夠進行檢測，如果不能有效區分死活菌體的DNA分子，就會產生和實際致病情況完全不同的結果，也不能為馬鈴薯生產中晚疫病的檢測提供準確的量化指標。遊動孢子則是病原菌蟄伏和傳播的一種主要形式(Andrivon，1995 ； Zwankhui ζ en et al., 1998)。因此對種植馬鈴薯土壤晚疫病菌活體遊動孢子進行快速定量、特異性檢測，對進行晚疫病發生與流行預測和防治尤為關鍵，也是有效預防馬鈴薯病晚疫病害發生
3的主要措施(ZwanWiuizen et al. , 1998)。但到目前為止，作為馬鈴薯晚疫病傳播和夏季蟄伏的主要狀態-活體遊動孢子的檢測尚未發現合適的方法，因而無法對土壤中馬鈴薯晚疫病活體遊動孢子進行定量檢測，因而無法有效跟蹤和預報馬鈴薯生長過程中晚疫病發生過程，並據此提出有效預防病害措施。EMA (溴化乙錠單疊氮溴 Ethidium Monoazide Bromide)結合 Real-Time PCR 的活體檢測技術被廣泛應用於食品、臨床領域(Wang and Levin, 2006; Soejima et al.， 2008 )，因為EMA能滲入細胞壁比較柔軟的死體細胞而共價結合在其DNA上，從而阻止了 PCR 擴增過程中引物與DNA的結合，最終導致死體細胞DNA不能被擴增量化檢測(Marx et al.， 1997 ；Nocker et al.，2006)。鑑於上述現有技術的缺陷，我們以EMA結合Real-Time PCR的活體檢測技術為基礎，發明出了一種快速、準確，高效、特異性地定量檢測土壤中馬鈴薯晚疫病病菌活體遊動孢子的方法，該方法可以快速、準確，高效、特異性地定量檢測土壤中馬鈴薯晚疫病活體遊動孢子，滿足人們防治馬鈴薯晚疫病的生產需要。
參考文獻
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發明內容
本發明提供了一種定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子的方法及應用。其特徵在於該方法將EMA (溴化乙錠單疊氮溴Ethidium Monoazide Bromide)與Real-Time PCR 技術組合起來，利用EMA和特異的引物，定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子。本發明的具體內容與過程如下
1、誘導馬鈴薯晚疫病菌遊動孢子，建立標準曲線。馬鈴薯晚疫病、P. infes tans ATCC )V8培養基上培養3天後，挑(5 X 2 X 5 mm)大菌餅，置15ml水中，室溫避光培養5天，誘導產生孢子囊。再置光下48小時，吸取培養懸浮液，光學顯微鏡下，觀察遊動孢子的活動，用Whatman濾紙過濾後，血球計數器計算遊動孢子的數量和濃度。將上述誘導產生遊動孢子用去離子無菌水稀釋至IX IO5/μ 1。再分別以 10倍梯度稀釋為5個不同濃度遊動孢子溶液。以沸水浴熱處理IOmin後的遊動孢子懸浮液1μ 1為擴增模板，再分別加入加入 SYBR-Green 螢光標記試劑混合物(SYBR green PCR Master Mix, Applied Biosystems) 10μ 1，特異性引物(正向引物 PIF: 5，- CGGCGGCTGCTGGCTTTAT _3，，反向引物 PIR: 5，-GCTCAGACCGAAGTCCAAACG -3，)，10 μ m，各1 μ，無菌去離子水補至總體積20 μ 1。每個反應設3個平行實驗。Real-TimePCR的設置程序為50°C - 5 min, 95°C - 10 min ；然後以 950C - 20s, 600C -lmin，循環；35次；最後在72°C保溫5min。整個循環完成後，樣品在
梯度下，0.03°C /s，從60°C增加到95°C。反應結束後，導出EXCEL表格，根據反應的溶解曲線判斷每個樣品的擴增效率，每組反應取平均值，捨棄Ct大於30的反應(thresholds cycles，Ct)，以DNA模板含量的log值為橫坐標，反應Ct為縱坐標作圖，並計算曲線的相關性，R2 ≥ 0. 98認為相關性好，擴增結果可信。2、確定EMA處理最適濃度
EMA用DMSO (二甲基亞碸)溶解至終濃度為5mg/ml，貯存於棕色試劑瓶中，-20°C保存； 按 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1，2，3，4，5，10 和 15 μ g/ml 的 EMA 終濃度加入到 36 個離心管中(含有0.5 ml 5X IO6 CFU，每個處理3次重複)；將離心管置黑暗中，4°C，15min， EMA滲入死細胞而結合在DNA上；打開離心管管蓋置碎冰上，650W滷素燈下照射15min，保持IOcm距離，以便激活和光解未結合的EMA，在此過程中要每隔5min更換一次碎冰，並轉換離心管方向，保證受光均勻，避免局部受熱過高。處理好的遊動孢子用Real-Time PCR檢測方法，同標準曲線的製備方法進行，以確定EMA處理最適濃度。3、確定EMA處理最適曝光時間
2ug EMA加入lml，含IXlO7個未處理遊動孢子懸浮液中，4°C，避光靜置15min，然後將試管置650W的滷素燈下，距離10cm，分別照射l-25min，對照管min時未加EMA，然後進行 Real-Time PCR檢測，以確定EMA處理最適曝光時間。4、EMA結合Real-Time PCR檢測三種土壤中活體遊動孢子
1) EMA用DMSO溶解至終濃度為5mg/ml。待檢測土壤分別在80°C烘烤5小時，確保土壤中含有的DNA分子完全降解；按4 μ g/0. 5g 土壤加入EMA儲液，再加入遊動孢子懸浮液 (IXlO7 CFU/ml) anl，儘可能使檢測土壤和EMA溶液混勻，然後置4°C，黑暗中15min，再置碎冰上，650W滷素燈下，保持15cm距離，每5min更換碎冰一次，避免離心管局部受熱過高。 同時，不斷轉換離心管方向，輕微震蕩離心管，保證管中土樣受光均勻。然後加土壤DNA提取液(100 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L EDTA，100 mmol/L 磷酸鈉，1. 5mol/L NaCl, 2% CTAB, pH8. 0)]，提取上述土壤中的DNA，通過紫外分光光度法測定提取DNA的質量，標準為 0D260/280為1. 8左右，作為下幾步的DNA模板。2)在擴增管中加入加1 μ 1稀釋不同倍數DNA(分別用10倍梯度進行稀釋至低濃度 101^/111)，另加入10\111^8-!1(1緩衝液(？!18.3，5001111 KCl, 15mM MgCl2)3y 1 ；dNTP(2. 5mM) 2μ 1 ；特異引物(PIF/PIR, 10 μ Μ)各 1 μ 1 ;Taq 酶(5U/μ 1) 0· 2 μ 1 以及 2% Blotto (10% 脫脂奶粉和0. 2% NaN3),加入無菌去離子水至總體積20 μ 1。3) Real-Time PCR 的設置程序為50°C - 5 min, 95°C - 10 min ；然後以 95°C-20s, 60°C -lmin，循環35次；最後在72°C保溫5min。整個循環完成後，樣品在35°C梯度下，0.03°C /s，從60°C增加到95°C。反應結束後，導出EXCEL表格，根據反應的溶解曲線 (81 士0.5°C)判斷每個樣品的擴增效率，每組反應取平均值。4)依據標準曲線，通過Ct=-2. 5371og[DNA]+32. 644 (R2=O. 987)計算得到三種不同土樣中馬鈴薯晚疫病菌活體遊動孢子的含量。由於土壤樣品馬鈴薯晚疫病菌活體遊動孢子的DNA含量與土壤中晚疫病菌帶菌量成正比，所以可以通過土壤樣品馬鈴薯晚疫病菌活體遊動孢子DNA含量的高低間接定量土壤樣品馬鈴薯晚疫病菌活體遊動孢子數量的高低， 從而達到定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子的目的。5、根據本發明提供的方法，可用於快速、靈敏、準確地定量檢測土壤中蟄伏的晚疫病活體遊動孢子。6、根據本發明提供的方法，所有試劑包括本發明CTAB法所用試劑所篩選的引物，各種PCR反應中所需用的酶或試劑，實現本發明所必需的其它酶或試劑或材料以及EMA，可以液體形式或凍乾粉劑裝入一個或多個可以接受的容器內製備成試劑盒，用於定量檢測土壤中馬鈴薯馬鈴薯晚疫病菌活體遊動孢子。
具體實施例方式
實施例1誘導馬鈴薯晚疫病菌遊動孢子，建立標準曲線
馬鈴薯晚疫病0°. ifl/Mia/^ ATCC)V8培養基上培養3天後，挑(5X2X5 mm)大菌餅， 置15ml水中，室溫避光培養5天，誘導產生孢子囊。再置光下48小時，吸取培養懸浮液，光學顯微鏡下，觀察遊動孢子的活動，用Whatman濾紙過濾後，血球計數器計算遊動孢子的數量和濃度。將上述誘導產生遊動孢子用去離子無菌水稀釋至IX IO5/μ 1。再分別以10倍梯度稀釋為5個不同濃度遊動孢子溶液。以沸水浴熱處理IOmin後的遊動孢子懸浮液1μ 1為擴增模板，再分別加入加入 SYBR-Green 螢光標記試劑混合物(SYBR green PCR Master Mix, Applied Biosystems) 10μ 1，特異性引物(正向引物 PIF: 5，- CGGCGGCTGCTGGCTTTAT _3，，反向引物 PIR: 5，-GCTCAGACCGAAGTCCAAACG -3，)，10 μ m，各1 μ，無菌去離子水補至總體積20 μ 1。每個反應設3個平行實驗。Real-TimePCR的設置程序為50°C - 5 min, 95°C - 10 min ；然後以 950C - 20s, 600C -lmin，循環；35次；最後在72°C保溫5min。整個循環完成後，樣品在
梯度下，0.03°C /s，從60°C增加到95°C。反應結束後，導出EXCEL表格，根據反應的溶解曲線判斷每個樣品的擴增效率，每組反應取平均值，捨棄Ct大於30的反應(thresholds cycles，Ct)，以DNA模板含量的log值為橫坐標，反應Ct為縱坐標作圖，並計算曲線的相關性，R2 ^ 0. 98認為相關性好，擴增結果可信。實施例2確定EMA處理最適濃度
EMA用DMSO (二甲基亞碸)溶解至終濃度為5mg/ml，貯存於棕色試劑瓶中，-20°C保存； 按 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1，2，3，4，5，10 和 15 μ g/ml 的 EMA 終濃度加入到 36 個離心管中(含有0.5 ml 5X IO6 CFU，每個處理3次重複)；將離心管置黑暗中，4°C，15min， EMA滲入死細胞而結合在DNA上；打開離心管管蓋置碎冰上，650W滷素燈下照射15min，保持IOcm距離，以便激活和光解未結合的EMA，在此過程中要每隔5min更換一次碎冰，並轉換離心管方向，保證受光均勻，避免局部受熱過高。處理好的遊動孢子用Real-Time PCR檢測方法，同標準曲線的製備方法進行，以確定EMA處理最適濃度。當EMA濃度為2ug/ml以下，曝光時間為15min時，很少或沒有抑制活體遊動孢子中目的DNA在Real-Time PCR檢測中被擴增；而當EMA濃度大於2ul/ml時，則明顯抑制了目的DNA的擴增檢測(P<0. 05)。所以，用EMA-Iinking結合Real-Time PCR技術檢測活體遊動孢子，EMA最適濃度為2ug/ml。
實施例3確定EMA處理最適曝光時間
2ug EMA加入lml，含IXlO7個未處理遊動孢子懸浮液中，4°C，避光靜置15min，然後將試管置650W的滷素燈下，距離10cm，分別照射l-25min，對照管min時未加EMA，然後進行 Real-Time PCR檢測，以確定EMA處理最適曝光時間。2ug EMA加入lml，含IX IO7個未處理遊動孢子懸浮液中，4°C，避光靜置15min，然後將試管置650W的滷素燈下，距離10cm，分別照射l-25min，對照管min時未加EMA，然後進行Real-Time PCR檢測。未加EMA的對照，擴增Ct值為22. 3，加EMA後，曝光處理15min時為22. 53。當曝光時間小於15min時，溶液中未裂解的EMA，隨著活體遊動孢子在PCR反應中裂解而結合在其DNA上，抑制其被PCR擴增，最終導致Ct值升高(P<0. 05)。反之，當曝光時間大於15min時，溶液中沒有結合DNA的EMA完全被光解，Ct值沒有顯著增加。所以， 用EMA-Iinking結合Real-Time PCR技術檢測活體遊動孢子，最佳曝光時間為15min。這和檢測食品微生物結果一致(Wang and Levin，2006)。實施例4 EMA結合Real-Time PCR檢測三種土壤中活體遊動孢子
1 )EMA用DMSO溶解至終濃度為5mg/ml。取待檢測的三種馬鈴薯種植土壤(沙土 Sandy、 粘土 Clay和腐殖土 Muck)各0. 5g，分別在80°C烘烤5小時，確保土壤中含有的DNA分子完全降解；按4 μ g/0. 5g 土壤加入EMA儲液，再加入2ml遊動孢子懸浮液(1 X IO7 CFU/ml) anl，儘可能使檢測土壤和EMA溶液混勻，然後置4°C，黑暗中靜置15min，再置碎冰上，650W 滷素燈下，保持15cm距離，每5min更換碎冰一次，避免離心管局部受熱過高。同時，不斷轉換離心管方向，輕微震蕩離心管，保證管中土樣受光均勻。然後加土壤DNA提取液(100 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L EDTA，100 mmol/L 磷酸鈉，1. 5mol/L NaCl, 2% CTAB, pH8. 0) 0. 8ml，提取上述土壤中的DNA，通過紫外分光光度法測定提取DNA的質量，標準為 0D260/280為1. 8左右，作為下幾步的DNA模板。2)在各個擴增管中加入加1 μ 1稀釋不同倍數DNA (分別用10倍梯度進行稀釋至低濃度 10ng/ul)，另各加入 IOXTris-HCl 緩衝液(pH8. 3，500mM KCl,15mM MgCl2) 3 μ 1 ； dNTP (2. 5mM) 2μ 1 ；特異引物(PIF/PIR, 10 μ Μ)各 1 μ 1 ；Taq 酶(5U/μ 1) 0. 2μ 1 以及 2% Blotto (10%脫脂奶粉和0. 2% NaN3),再分別加入加入STOR-Green螢光標記試劑混合物 (SYBR green PCR Master Mix, Applied Biosystems) 10 μ 1，特異性引物(正向引物 PIF: 5，- CGGCGGCTGCTGGCTTTAT _3，，反向引物PIR: 5，- GCTCAGACCGMGTCCAAACG -3'), IOym, 各ι μ ι及無菌去離子水補至總體積20 μ 1。3) Real-Time PCR 的設置程序為50°C - 5 min, 95°C - 10 min ；然後以 95°C-20s, 60°C -lmin，循環35次；最後在72°C保溫5min。整個循環完成後，樣品在35°C梯度下，0.03°C /s，從60°C增加到95°C。反應結束後，導出EXCEL表格，根據反應的溶解曲線 (81 士0.5°C)判斷每個樣品的擴增效率，每組反應取平均值。4)依據標準曲線，通過Ct=-2. 5371og[DNA]+32. 644 (R2=O. 987)計算得到三種不同土樣中馬鈴薯晚疫病菌活體遊動孢子的DNA含量。(如下表)。 由於土壤樣品馬鈴薯晚疫病菌活體遊動孢子的DNA含量與土壤中晚疫病菌帶菌量成正比，所以可以通過土壤樣品馬鈴薯晚疫病菌活體遊動孢子DNA含量的高低間接定量土壤樣品馬鈴薯晚疫病菌活體遊動孢子數量的高低。
權利要求
1.一種定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子的方法及應用，其特徵在於該方法將 EMA (溴化乙錠單疊氮溴Ethidium Monoazide Bromide)與Real-Time PCR技術組合起來， 用於定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子。
2.根據權利要求1所述的一種定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子的方法及應用， 其特徵在於該方法所含有的特異引物為下述引物對，這些引物的兩端可以添加不定數的保護鹼基，酶切位點或接頭正向引物(PIF) 5，- CGGCGGCTGCTGGCTTTAT -3，反向引物(PIR) 5，- GCTCAGACCGAAGTCCAAACG -3，。
3.根據權利要求2所述的一種定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子的方法及應用， 其特徵在於該方法所採用的引物可以在合成時使引物帶上螢光標記或是同位素標記。
4.根據權利要求1所述的一種定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子的方法及應用， 其特徵在於應用EMA的最適濃度為2 μ g/ml。
5.根據權利要求4所述的一種定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子的方法及應用， 其特徵在於EMA使用時的最適曝光時間為15min。
6.一種定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子的試劑盒，其特徵在於該試劑盒中含有下述引物對，這些引物的兩端可以添加不定數的保護鹼基，酶切位點或接頭正向引物(PIF) 5，- CGGCGGCTGCTGGCTTTAT -3，反向引物(PIR) 5，- GCTCAGACCGAAGTCCAAACG -3，。
7.根據權利要求6所述的一種定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子的試劑盒，其特徵在於該試劑盒中所含有的引物可以在合成時使引物帶上螢光標記或是同位素標記。
8.根據權利要求6所述的一種定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子的試劑盒，其特徵在於EMA使用時的最適濃度為2 μ g/ml。
9.根據權利要求6所述的一種定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子的試劑盒，其特徵在於EMA使用時的最適曝光時間為15min。
全文摘要
本發明提供了一種定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子方法，主要應用了EMA(溴化乙錠單疊氮溴EthidiumMonoazideBromide)結合Real-TimePCR的活體檢測技術來定量檢測土壤中晚疫病菌活體遊動孢子，按本發明所提供的方法，可快速、靈敏、準確地定量檢測土壤中晚疫病活體遊動孢子的數量。有效預報和跟蹤馬鈴薯生長過程中晚疫病發生過程，並據此提出有效預防病害措施，滿足人們防治馬鈴薯晚疫病的生產需要。
文檔編號C12Q1/68GK102559842SQ20101058977
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月16日 優先權日2010年12月16日
發明者萬東石, 孟雪琴, 張旭, 李永泉, 王愛蘭, 邵旭平 申請人:蘭州大學