硫酸化低聚糖的製備方法和用途的製作方法

2023-05-04 18:32:41

專利名稱：硫酸化低聚糖的製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及硫酸化低聚糖，其製備方法及其作為抗血管生成、抗轉移和/或抗炎症藥劑的用途。
背景技術：
硫酸乙醯肝素屬於多糖中的葡糖胺聚糖類。它們存在於大多數多細胞動物中並且分布很普遍，位於細胞的表面和大多數組織的細胞外載體(ECM)中(1，2)。硫酸乙醯肝素通常以蛋白多糖的形式存在，在測序和克隆所說分子的核心肽方面具有相當多的進展。比如，至今已經證實在細胞表面至少有八種不同的硫酸乙醯肝素蛋白多糖(HSPG)核心多肽(3)。
起初認為HSPG對於細胞表面和ECM的結構起著十分重要的作用。然而，硫酸乙醯肝素鏈之間存在著顯著的結構差異(2，4)，這說明它們對許多生物過程能提供重要的標誌信息。因此，雖然乙醯肝素鏈硫酸酯起初以簡單改變由β1→4和α1→4鍵連接的葡糖苷醛基和N-乙醯葡糖胺基殘基的重複被合成，但存在許多後續修飾。將多糖進行N-脫乙醯化和N-位硫酸化，接著進行葡糖苷醛基單元到艾杜糖醛基單元的C5位的立體異構化，以及尿基和葡糖胺基殘基的各種O-硫酸化。這些修飾的可變化性導致了約三十種不同的二糖序列的存在，當二糖序列沿著硫酸乙醯肝素鏈按不同順序排列時，理論上可形成很多種硫酸乙醯肝素結構。根據這種觀點，僅僅存在於柱狀細胞中的抗凝血劑多糖肝素代表硫酸乙醯肝素的一種極端形式，其立體異構化和硫酸化已經達到最大化。大多數硫酸乙醯肝素包含由相對較長骨架的非硫酸化單元連接較短骨架的高度硫酸化殘基。
目前已經清楚地證實硫酸乙醯肝素在很大範圍的生物過程中起著關鍵性的作用(2-4)。尤其是它們能作為參與細胞-細胞間相互作用的粘附分子的配體(5，6)，參與細胞-ECM間相互作用(5，6)以及作為諸如鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)(7，8)和血管內皮生長因子(VEGF)(9)之類的生長因子的必不可少的細胞表面受體。HSPG也是代表細胞遷移的主要屏降的基膜的一種關鍵組分(10)。只有當細胞解聚為一定範圍的可降解的酶(包括一種稱為肝素酶的裂解硫酸乙醯肝素鏈的內糖苷酶)時，基膜屏障才被破壞(11)。
已經知道許多硫酸乙醯肝素參與的生物過程涉及到對獨特的硫酸乙醯肝素的結構的識別，其中最重要的是這些硫酸基團在多糖鏈中的位置(3)。比如，已經證明所限定的硫酸乙醯肝素序列是由酸性的和鹼性的FGF(14-16)識別並由肝素酶裂解。基於這些觀察，本發明發明人的一個目的是合成能阻止硫酸乙醯肝素被生長因子識別並能抑制硫酸乙醯肝素被肝素酶裂解的硫酸化低聚糖。在阻斷生長因子的情況下，曾經認為硫酸乙醯肝素的低分子量模擬物應當特別有效，因為目前認為細胞表面的硫酸乙醯肝素介導生長因子與它們的受體交聯(17)。並且，通過充當肝素酶不能裂解的底物，硫酸化低聚糖應當是有效的肝素酶抑制劑。
具有生長因子抑制活性的硫酸化低聚糖有許多的臨床用途。結合生長因子(比如bFGF和VEGF)的肝素/硫酸乙醯肝素是血管生成的有效的誘導物(18)。在成年人中血管生成的出現是相當少的，除非是傷病治癒。然而在成年人中存在著大量的「血管生成依賴性疾病」，這些疾病中血管生成至關重要(18-20)。最重要的是與實體腫瘤生長有關的血管生成、增生性視網膜病和類風溼性關節炎。具有阻斷諸如bFGF和VEGF之類的關鍵血管生成生長因子作用的硫酸化低聚糖尤其可用來治療這些血管生成依賴性疾病。
類似地，抑制肝素酶作用的硫酸化低聚糖具有許多臨床用途。內下皮基膜代表內皮細胞，腫瘤細胞和白血球穿過血管壁的主要的生理屏障。肝素酶與一定範圍的解蛋白酶(比如血纖維蛋白溶酶，基質金屬蛋白酶)組合，通過入侵細胞，在基膜降解過程中起著不可缺少的作用(11-13，21)。因此，通過防止基膜降解，具有肝素抑制活性的硫酸化低聚糖應該具有抗轉移和抗炎活性，此外，還可以抑制早期的血管生成。在許多臨床場合下，比如高度轉移的實體腫瘤和類風溼關節炎的治療，優選地是使用能同時抑制血管生成生長因子作用和肝素酶的硫酸化低聚糖。
以前的國際專利申請PCT/AU88/00017(公開號WO 88/05301)中公開了在對動物或人類患者進行抗轉移或抗炎症治療中使用諸如肝素和修飾的肝素，巖藻多糖，戊聚糖硫酸，葡聚糖硫酸和角叉膠λ之類的阻斷或抑制肝素酶活性的硫酸化的多糖。
在導致本發明的工作中，本發明發明人採用天然存在的低聚糖或全合成的含己糖均聚物的低聚糖製備了硫酸化低聚糖。這些化合物中有些已經被證明是人體血管生成、腫瘤轉移和炎症的有效的抑制劑。所獲得的數據與硫酸化低聚糖所具有的抑制血管生成生長因子作用和/或肝素酶功能的生物效應相一致，並且製備出了某些對血管生成和肝素酶活性都是強有力的抑制劑的硫酸化低聚糖。
發明概要本發明一方面提供了硫酸化低聚糖，其中所說的低聚糖具有結構通式IR1-(Rx)n-R2(I)其中R1和R2以及每個Rx代表一個單糖單元，所有的單糖單元可以相同也可以不同，相鄰的單糖單元由1→2，1→3，1→4和/或1→6糖苷鍵連接；且n是1-6之間的整數。
本發明中的硫酸化低聚糖基於單糖單元的聚合物，其可以由1→2，1→3，1→4和/或1→6糖苷鍵連接且可以由3-8個單糖單元組成；優選地，所述低聚糖由3-6個單糖單元(即n為1-4)組成，更優選地由5-6個單糖單元(n為3-4)組成。這些聚合物可以包括只含有一種類型的單糖單元的均聚物或含兩種或多種類型的單糖單元的雜聚物。
被連在一起以構成低聚糖的單糖單元優選地是己糖，可以是諸如果糖之類的呋喃糖，或諸如葡萄糖、甘露糖、阿卓糖、阿洛糖、塔羅糖、半乳糖、艾杜糖或古洛糖之類的吡喃糖。己糖既可以是D-型也可以是L-型構型。
另一方面，本方面提供了具有通式II的新型合成低聚糖Ry-(Ry)n-Ry(II)其中每一個Ry基團相同且每個代表一個單糖單元，相鄰的單糖單元由1→3，1→4和/或1→6糖苷鍵連接；且n是1-6之間的整數。
在這一特殊方面中，本發明也提供了硫酸化低聚糖，其中所說的低聚糖具有以上的結構通式II。
優選地，在結構式II中的均聚低聚糖中，單糖單元是一種諸如葡萄糖、甘露糖、阿卓糖、阿洛糖、塔羅糖、半乳糖、艾杜糖或古洛糖之類的己糖。在這些低聚糖中n優選地是1-4，更優選地是3-4。
具有結構通式I和II的低聚糖也包括那些其中所說的單糖單元是衍生化的(尤其單糖單元是單糖的磷酸酯、乙醯化或其它酯衍生物)的化合物。
通常，本發明中的硫酸化低聚糖可通過採用現有技術中已經公開的方法將低聚糖硫酸化製得其相應的O-硫酸衍生物來製備。適宜的硫酸化方法例舉如下。待進行硫酸化的低聚糖可以是天然存在的產物，包括諸如棉子糖和水蘇糖之類的天然存在的低聚糖，以及由天然存在的多糖通過酶促降解或化學降解而製備的低聚糖(如麥芽四糖，麥芽五糖和麥芽六糖；葡萄三糖，葡萄四糖和葡萄五糖；軟骨素四、六和八糖；以及來源於酵母Pichiaholstii的甘露五糖磷酸酯)。
如前所述，屬於本發明範圍中的硫酸化低聚糖具有肝素酶抑制和/或生長因子抑制活性；並且另一方面，本發明還將以上所描述的硫酸化低聚糖開發為一種在對溫血動物(包括人)患者進行治療的抗血管生成、抗轉移和/或抗炎症藥劑。
因此，本發明開發一種對需要進行治療的人或其它溫血動物患者進行抗血管生成、抗轉移和/或抗炎症治療的方法，該方法包括向患者施用有效量的至少一種以上所描述的硫酸化低聚糖。
活性組分按治療有效量來施用。治療有效量指的是至少部分達到所希望的效果，或推遲將要治療的特殊病症的開始，抑制它的發展，或同時防止它的開始或發展所需要的施用量。自然，這種施用量取決於將要進行治療的特殊病症，病症的嚴重性以及各個患者的參數(包括年齡，身體狀況，大小，體重)和同時進行的治療。這些因素對於本領域普通技術人員來說是已知的，可以不需要進行進一步的解釋。通常優選地是施用最大劑量，即符合醫學最高安全要求的劑量。然而，本領域普通技術人員將知道，基於藥物原因、身體原因或任何其它原因，可施用較低的劑量或可忍受的劑量。
本發明進一步將以上所描述的至少一種硫酸化低聚糖用於人或其它溫血動物患者的抗血管生成、抗轉移和/或抗炎症治療藥物的製造中。
另外，本發明也提供了一種用於抗血管生成、抗轉移和/或抗炎症治療的藥物或獸藥組合物，該組合物包含至少一種以上所描述的硫酸化低聚糖以及藥理上或獸醫學上可接受的載體/和或稀釋劑。
這種治療組合物的配製對於本領域技術人員來說是熟知的。適宜的藥學上或獸醫學上可接受的載體/和或稀釋劑包括任何和所有的普通溶劑、分散介質、填料、固體載體、水溶液、包衣、抗菌和殺真菌劑、等滲和吸收延遲劑等等。在現有技術中將這些介質和試劑用於藥物和獸藥活性物質是眾所周知的，比如在Remingtons藥物科學，18版，Mack出版公司，Pensyvania，USA中對其進行過描述。除非是任何普通介質或試劑與活性組分不相容的情況，將它們用於藥物和獸藥組合物是本發明所期望的。也可以向所述組合物中加入輔助活性組分。
按劑量單位形式來配製組合物是特別有益的，因為這樣易於施用且劑量一致。這裡所用的劑量單位形式指的是適宜於作為待治療的人類或動物的單元劑量的物理上的不連續單位；每一單位中含有預定量的估計與所要求的藥物或獸藥載體和/或稀釋劑配合使用可產生所希望的治療效果的活性組分。本發明中的新的劑量單位形式的規格受制於或取決於(a)活性組分的特性和所要取得的特殊治療效果，及(b)為了進行特殊治療而使這種活性組分進行化合的技術中固有的限制。
本發明中的硫酸化低聚糖可用來治療血管生成依賴性疾病，包括與實體腫瘤生長相關的血管生成，增生性視網膜病和類風溫性關節炎，以及用來治療炎症性疾病和那些其中硫酸化低聚糖的肝素酶抑制活性對抑制白血球滲透特別有用的病症，包括諸如類風溼性關節炎、多部位硬化、胰島素依賴性糖尿病之類的白血球滲透是關鍵因素的慢性炎症性疾病；諸如潰瘍性結腸炎和Chron病之類的腸道炎症性疾病；異體移植排斥和慢性哮喘病。
除非上下文中另有要求，本說明書中的「含有」一詞或變化詞「包含」應理解為意指包括所述的整體或整體組，但不排出任何其它的整體或整體組。發明詳述如以上所廣泛描述的，本發明涉及硫酸化低聚糖以及其作為抗血管生成、抗轉移和/或抗炎症藥劑的用途。
一些低聚糖可由天然資源進行進一步硫酸化來獲得，然而，更希望的是採用一種合成所限定的鏈長和立體化學的低聚糖的簡單方法。本發明提供了一種從簡單起始原料合成和分離己糖低聚物的高收率的改進方法，其中低聚物中的糖單體由1→3，1→4和/或1→6鍵連接。這種製備己糖低聚物的方法與以前的高收率的製備這種糖低聚物的方法極為不同，其聚合度容易控制並且從這種方法所衍生而來的產品是均一的線形低聚物，很容易用簡單的色譜技術分離和提純。
在科學和專利文獻中可發現許多描述製備糖聚合物和低聚物的方法的例子。比如，在一種普遍採用的方法中，可將一種未經改性的糖單體(要麼是單獨的，要麼在溶劑中)在催化劑的存在下加熱，以便得到各種各樣的有時難以限定的帶支鏈的和線形的聚合產物(22，23)。另一種方法中在陽離子交換樹脂的存在下將糖融化也得到高分子量高支鏈化的聚合物(24)。在這兩個例子中，聚合物是伴隨形成一個聚合鍵失去一分子水而形成的。另一個已公開的分步聚合的方法的例子涉及到利用Koenings-Knorr反應，其中使具有1位上的非羥基基團(比如溴或氯原子)和其它糖羥基上的保護基團(比如醯基)的糖在1位與其它糖上的羥基反應(24)。在這些方法中，在聚合鍵生成期間失去一個非水分子，比如HBr。這種製備低聚糖的方法很使人厭煩，需要製備複雜的起始材料，並且總收率低(25)。
在一種已經公開的類似的方法中，將一種在碳6原子上含一個伯醇基，在2，3和4位上有O-保護基團(比如乙醯基)且1位上有一個象Br一樣的離去基團的己糖進行自縮合，尤其在諸如氧化銀一樣的催化劑的存在下，得到1，6相連的聚合物；採用這種方法由1-Br-2，3，4-三-O-乙醯基-α-D-葡萄糖製備出一系列的龍膽糊精。然而，由於由分子內縮合衍生而來的1，6-無水-β-D-葡萄糖的形成，低聚糖的收率很低；二聚物(14％)和三聚物(22％)的收率不好，四聚物和五聚物的收率很差(≤5％)，並且六聚物僅以1％的收率分離出(26)。
更新的公開物中描述了1，6-鍵合的β-吡喃基單元(27)和D-葡聚糖(28)的聚合物的化學合成，其通過無水糖衍生物的開環聚合反應來製備。這種方法受需要費很大的努力才能製備出無水糖起始材料的困擾，並且儘管反應在比如-60℃下進行也不能證明用這種方法來製備低聚糖容易。另一種方法用1，2，3，4-四-O-乙醯基-β-D-葡萄糖酸催化熔融聚合來製備1，6-鍵合的低聚糖乙酸酯的混合物，經脫乙醯基並進行色譜檢測，表明基本上含單糖和二糖，即葡萄糖(15％)，左旋葡聚糖(4％)和龍膽二糖(16％)，而低聚糖收率不能接受地低，尤其龍膽三糖(4％)及龍膽四糖(06％)(29)。這種方法被進一步地進行了更詳細的描述(30)，雖然聚合物產物的產率得到稍微的改進，但所期望的低聚物的收率仍然低因此，從文獻中很明顯地發現，雖然早已經存在幾種製備低聚糖的方法，但至今沒有一種合成均勻低聚糖方法能取得好的收率並描述過使用廉價的起始材料。
在導致本發明的工作中，發明人發現了一種高收率的採用易於得到的廉價的起始材料來合成特定的六吡喃-低聚糖的方法。本發明一個方面提供了一種製備六吡喃-低聚糖的方法，該方法包括在減壓並有路易斯酸或其它催化劑存在的條件下，在一種惰性溶劑中加熱一種己糖的乙醯或其它酯類衍生物。
按照這種方法，可以用一種可控制的方法來進行衍生化的己糖(包括但不局限於葡萄糖、甘露糖、阿卓糖、阿洛糖、塔羅糖、半乳糖、艾杜糖或古洛糖的1，2，3，4-四-O-乙醯基衍生物)的聚合，以便製備O-乙醯化的低聚糖。在這種方法中，通過控制聚合反應的溫度和改變反應的時間，很容易控制聚合度(鏈長)。進行聚合反應後，可將粗產物混合物進行進一步的乙醯化，以便將低聚糖中剩餘的游離羥基乙醯化。然後通過吸附色譜很容易將乙醯化的低聚糖分離出來。乙醯化基團有紫外光吸收，當它們從色譜柱中洗脫出來時容易用光譜鑑定乙醯化的低聚糖。也可以將乙醯保護基團從低聚糖混合物中脫除，通過凝膠過濾(篩析)色譜按分子大小分離出低聚糖產物。
在這裡所描述的實例中，將硫酸化低聚糖分離並以其相應的鈉鹽形式使用。應當意識到可以將其它藥理上可接受的鹽(比如鈣鹽或藥理上可接受的銨鹽)分離並以正確的方法來使用。此外，這裡提到的「硫酸化低聚糖」應理解為包括例如硫酸化低聚糖的鈉鹽或其它藥理上可接受的鹽。
在下面的實施例中將對本發明的其它特點進行全面的描述。然而，應該知道，這種詳細的描述其目的只是為了對本發明進行舉例說明而決不應該被認為是對以上所提出的本發明的廣泛的描述的限制。
實施例1，2和3通過所公開的新方法對合成低聚糖的製備進行了舉例說明，實施例4，5和6對低聚糖的硫酸化的方法進行了舉例說明，實施例7舉例說明了硫酸化低聚糖作為抗血管生成、抗轉移和/或抗炎症藥劑的用途。實施例1和2中，「ND」表示「沒有測定」。
在附圖中

圖1表明了硫酸麥芽六糖對體外人體血管生成的影響。上面的圖是進行14天培養後對照血管生成的圖象。下面的圖描述了在20μg/ml硫酸麥芽六糖存在下的血管生成。
圖2表明了不同的硫酸麥芽糖(□)，硫酸麥芽四糖(○)和硫酸麥芽六糖
濃度對體外人體血管生成的影響。數據由經14天培養後血管生成的數據圖象獲得。各自是平均值±標準偏差(n＝4)。
圖3表明了不同濃度(μg/ml)的從Pichia holstii得到的甘露五糖磷酸酯對體外人體血管生成的影響。數據由經19天培養後血管生成的數據圖象獲得。各自是平均值±標準偏差(n＝4)。
圖4表明了不同鏈長的硫酸化的麥芽糖低聚糖對小鼠乳腺癌13762 MAT轉移的影響。對照動物在無低聚糖存在下接受13762MAT細胞。在A組中，當注射腫瘤細胞時將處理動物由靜脈注入每種化合物2毫克。在B組中，當注射腫瘤細胞時將處理動物由皮下注入每種化合物4毫克。垂直條代表平均值的標準偏差。
圖5是對不同鏈長的硫酸化麥芽糖低聚糖抑制BALB/c 3T3細胞上的細胞表面硫酸乙醯肝素結合到固定化的aFGF上的能力的評估。結合的3T3細胞通過Rose Bengal染色並測定540nm處的染色體吸收來進行定量。不同的麥芽糖低聚物的硫酸化程度列於表2中。
圖6顯示硫酸麥芽糖的硫酸化程度對其抑制小鼠乳腺癌13762MAT轉移能力的影響。X軸數值是指硫酸基團與麥芽六糖分子的比值。當注射腫瘤細胞時將低聚糖以2毫克/小鼠的劑量靜脈注射施用。垂直條代表平均值的標準偏差。
圖7顯示含不同數量的硫酸基團/分子的麥芽六糖比值對體外人體血管生成的影響。低聚糖按200μg/ml加入，且試驗在無血清的介質中進行。不管試驗是在含血清(20％FCS)或無血清(無FCS)的介質中進行，在這種試驗中都可觀察到類似的血管生成響應。具有20硫酸/分子的麥芽六糖代表最大硫酸化的分子。數據為四次測定的平均值±標準偏差。
圖8代表含硫酸化低聚糖的不同的甘露糖對體外人體血管生成的影響。括號中的值代表低聚糖硫酸化％。低聚糖按200μg/ml加入，且試驗在無血清的介質中進行。數據為四次測定的平均值±標準偏差。
圖9代表不同鏈長的硫酸化的甘露糖低聚糖對小鼠乳腺癌13762MAT轉移的影響。括號中的值代表低聚糖的硫酸化％。對照動物在無低聚糖存在下接受13762MAT細胞。靜脈注射腫瘤細胞後立即將處理動物由皮下注入每種化合物2毫克(A)或4毫克(B)。垂直條代表平均值的標準偏差。
圖10代表不同鏈長的硫酸化的半乳糖和葡萄糖低聚糖對小鼠乳腺癌13762MAT轉移的影響。括號中的值代表低聚糖的硫酸化％。對照動物在無低聚糖存在下接受13762MAT細胞。靜脈注射腫瘤細胞後立即將處理動物由皮下注入每種化合物2毫克。垂直條代表平均值的標準偏差。
實施例1採用以下的方法製備甘露糖的低聚糖將1，2，3，4-四-O-乙醯甘露糖(31)(15.0g，43mmol)和氯化鋅(1.5g)於四氫噻吩(7ml)中充分混合，減壓攪拌下將這種混合物於110℃加熱6小時；此時反應物已經硬化並且停止蒸汽(乙酸)產生。整個反應期間將一鹼石灰試管置於反應容器和真空源之間。將反應混合物冷卻且將產品混合物的一部分(11.0g)溶於幹的吡啶(20ml)中，並將乙酸酐(2ml)加入這種溶液中，將混合物與空氣隔絕並在攪拌下於50℃加熱2小時。冷卻後，加入乙醇(10ml)並將混合物放置2小時。減壓下蒸出吡啶、乙醇和形成的乙酸乙酯，然後用水反覆衝洗殘基以便除去氯化鋅、四氫噻吩和吡啶。將殘餘物溶於二氯甲烷中，用水衝洗，用無水硫酸鈉乾燥有機層。讓二氯甲烷溶液流過一矽膠60(130g)短色譜柱(4×40cm)，先用氯仿然後用丙酮洗脫，將衍生化的低聚糖分成兩份。隨氯仿洗脫的洗脫液為完全乙醯化的單糖和含3-5個甘露糖單元的低聚糖的混合物(混合物A)。隨後隨丙酮洗脫的洗脫液為完全O-乙醯化的每分子含6-12個甘露糖單元的低聚糖的混合物(混合物B)。
將混合物A(4g)施用於裝有t1c級矽膠(H)的柱色譜子(3.3×135cm)中。將色譜柱用起始比例為1∶5的丙酮/輕汽油(沸點60→80℃)並逐漸增加丙酮的百分數直到最後比例為1∶1的梯度溶液洗脫。流速≤0.5ml/min。通過收集和合併需要的組分(由矽凝膠tlc分析測定)並在減壓下脫除溶劑，所製備的全O-乙醯化的甘露糖低聚糖1a-1d如下(n＝甘露糖殘基的數量，產率，分子旋光(c＝2，CHCl3))1a，(3；0.7g，4.2％，[α]27D＝+ND)；1b，(4；4.1g，8.4％，[α]27D＝+50)；1c，(5；1.2g，7.9％，[α]27D＝+47.3)；1d，(6；0.8g，5.2％，[α]27D＝+36.0)。將混合物B用類似於混合物A的方法進行色譜分離，只是洗脫液梯度開始是4∶5的丙酮/輕汽油(沸點60→80℃)，逐漸增加丙酮的百分數直到100％。在這種方法中，所製備的全O-乙醯化的甘露糖低聚糖1d-1j如下(n＝甘露糖殘基的數量，產率，分子旋光(c＝1，CHCl3))1d，(6；1.6g，10.4％，[α]27D＝+ND)；1e，(7；3.2g，21.2％，[α]27D＝+50)；1f，(8；0.5g，3.4％，[α]27D＝+47.0)；1g，(9；0.7g，4.7％，[α]27D＝+59)；1h，(10；0.9g，5.7％，[α]27D＝+54)；1i，(11；0.02g，0.1％，[α]27D＝+ND)；1j，(12；0.03g，0.2％，[α]27D＝+ND)。
將化合物1a(1.55g)溶於幹乙醇(40ml)中並於室溫攪拌下加入1M甲醇鈉甲醇鹽(8.6ml)。將所得沉澱過濾，用甲醇洗脫並乾燥。經元素分析(CHN值為計算值的±0.4％)，電噴霧質譜(M+504)和核磁共振譜鑑定產物(2a，0.61g，70％，[α]27D＝+72°)為甘露三糖。對低聚物1b-1j進行類似的處理得到以下的甘露糖低聚糖(n＝甘露糖殘基的數量，從乙醯化衍生物得到的產率％，分子旋光(c＝1，H2O))2b，(4；75％，[α]27D＝+78°)；2c，(5；85％，[α]27D＝+80°)；2d，(6；98％，[α]27D＝+84°)；2e，(7；98％，[α]27D＝+86.3°)；2f，(8；99％，[α]27D+98°)；2g，(9；99％，[α]27D＝+106°)；2h，(10；99％，[α]27D＝+100°)；2i，(11；98％，[α]27D＝+ND)；2j，(12；98％，[α]27D＝+ND)。
另外，這些甘露糖低聚糖也可用凝膠過濾(篩析)色譜進行分離。因此，如上所述，通過將充分攪拌的1，2，3，4-四-O-乙醯甘露糖(15.0g，43mmol)和氯化鋅(1.5g)在四氫噻吩(7ml)中的混合物減壓下於110℃加熱6小時。將反應混合物冷卻，加入水(50ml)並將反應混合物於室溫下攪拌5分鐘且去掉水層。反覆進行這種洗脫程序，然後將所得物質溶解於氯仿中，用水洗滌並用硫酸鈉乾燥。過濾後，減壓下脫除氯仿得到粗乙醯化低聚糖混合物(11.3g)。將混合物溶於異丙醇(20ml)和丙醇(60ml)中，然後加入1M的甲醇鈉甲醇溶液(8ml)，將混合物於室溫下放置1小時。將所得的沉澱過濾並用甲醇(30ml)洗滌兩次。乾燥後，將這種產品混合物(6.5g)從一細粉級P2凝膠(BioRad)凝膠過濾色譜柱(包裹的，5×90cm)的頂部加入，所述色譜柱已經用水在60℃下穩定了兩天(流速0.5ml/min)。先用水洗脫色譜柱，流速為0.5ml/min。根據差示折光譜的譜峰來鑑定從色譜柱中洗脫下來的產物，然後收集組分。採用這種方法收集相當於11個分離峰以下的面積的組分。在同一P2凝膠色譜柱上於60℃溫度下將這些組分中的每種重新進行色譜分離，並用水以0.5ml/min的速度洗脫。因此，比方說，將第一次從凝膠過濾中洗脫出來的經鑑定符合甘露五糖(0.9g)的組分重新進行色譜分離以便得到一個其每一邊有一個肩峰的中心主峰。通過減壓下脫除水份分離出中心峰處的洗脫產物，得到0.5g物質，60℃下再將其在同一P2凝膠色譜柱上以0.3ml/min的流速重新進行色譜分離。採用這種方法得到符合以上的2c的甘露五糖。實測值C 38.4；H，6.7，C30H52O26.6H2O計算值C38.5；H 6，8％。實測和計算的N值都是0％。
HPLC鑑定發現該化合物具有很高的純度。鑑定是在一個具有以下構成的Dionex HPLC系統中進行的色譜柱 Code-CPMA1#1291(+guard#1172).一種季銨離子交換色譜柱。
檢測器 電化學檢測器(ED40IAMP)。
流速1ml/min。
溶劑溶液A0.1M氫氧化鈉溶液B1M乙酸鹽於0.1M氫氧化鈉中梯度 時間(min) ％A％B 操作095 5 洗脫20 90 10 洗脫25 0 100洗脫/洗滌30 0 100洗脫/洗滌電噴霧質譜表明該化合物有一個M+828的質量峰，與甘露五糖的分子量相同。採用類似的方法分離出符合以上2a，2b，2d和2e的甘露四糖，甘露六糖和甘露七糖。
實施例2本實施例說明在比實施例1的反應溫度低的溫度下進行聚合反應的效果。在這種情況下，除了聚合反應是在90℃下進行8小時外，採用與以上的實施例1中所提供的製備甘露糖低聚糖相同的方法由1，2，3，4-四-O-乙醯葡萄糖的聚合來製備葡萄糖的低聚糖。按實施例1中的方法將反應混合物進行處理，產物由柱色譜分離，其中色譜柱(7cm×155cm)用tlc級矽膠(H)裝填。採用與實施例1中所描述的類似的洗脫方法所製得的完全O-乙醯化的葡萄糖低聚糖3a-3e如下(n＝葡萄糖殘基的數量，產率，分子旋光(c＝2，CHCl3))3a，(3；4.14g，24.9％，[α]27D＝+37.5°)；3b，(4；2.92g，18.4％，[α]27D＝+44°)；3c，(5；2.99g，19.1％，[α]27D＝+37.5°)；3d，(6；1.37g，8.9％，[α]27D＝+36°)；3e，(7；0.18g，1.2％，[α]27D＝+39°)。
將化合物3a(1.0g)溶於幹乙醇(30ml)中並於室溫攪拌下加入1M甲醇鈉甲醇鹽(5.5ml)。將所得沉澱過濾，用甲醇洗滌並乾燥。經元素分析，電噴霧質譜(M+504)和核磁共振譜鑑定產物(4a，[α]27D＝+68.5°)為葡萄三糖。對低聚物4b-4e進行類似的處理得到以下的葡萄糖低聚糖(n＝葡萄糖殘基的數量，％產率，分子旋先(c＝2，H2O))4b，(4；85％，[α]27D＝+83°)；4c，(5；90％，[α]27D＝+84°)；4d，(6；90％，[α]27D＝+86°)；4e，(7；89％，[α]27D＝+92.5°)。
另外，這些葡萄糖低聚糖可用凝膠過濾(篩析)色譜進行分離。因此，如上所述，通過將充分攪拌的1，2，3，4-四-O-乙醯基葡萄糖(15.0g，43mmol)和氯化鋅(1.5g)在四氫噻吩(7ml)中的混合物減壓下於110℃加熱6小時，製得一種乙醯化的葡萄糖低聚糖混合物。將所得物質溶解於二氯甲烷中，用水洗滌並用硫酸鈉乾燥。減壓下脫除二氯甲烷，將產物稱重並溶於異丙醇(20ml)和丙醇(60ml)中，然後加入1M的甲醇鈉甲醇溶液(9ml)，將混合物於室溫下放置1小時。將所得的沉澱過濾並用甲醇(30ml)洗滌兩次。將該混合物的一部分(7.6g)溶於水(10ml)中並施於一5×90cm水夾套的用細粉級P2篩析凝膠(BioRad)裝填的凝膠過濾色譜柱中。該色譜柱使用前已經在60℃下裝填，預熱和運行了兩天。隨著葡萄糖低聚糖混合物的加入，將色譜柱保持在60℃並用水洗脫色譜柱(流速為1ml/min)。根據差示折光譜的譜峰來鑑定從色譜柱中洗脫下來的產物並收集組分。在這種方法中收集相當於10個分離峰以下的面積的組分。在同一P2凝膠色譜柱上於60℃溫度下將這些組分中的每種重新進行色譜分離，並用水以0.5ml/min的流速洗脫。因此，比方說，將經鑑定符合於葡萄五糖(0.59g)的組分重新進行色譜分離以便得到一個其每一邊有一個肩峰的中心主峰。通過減壓下脫除水份分離出中心峰處的洗脫產物，得到0.3g物質，60℃下再將其在同一P2凝膠色譜柱上以0.3ml/min的流速重新進行色譜分離。採用這種方法得到符合以上4c的葡萄五糖。用類似的方法分離出符合以上4a，4b，4d和4e的葡萄三糖，葡萄四糖葡萄六糖和葡萄七糖。
實施例3其它包括半乳糖、阿卓糖、塔羅糖、古洛糖、艾杜糖和阿洛糖的己糖的低聚糖可採用實施例1和2中所公開的方法來製備。
比如，採用以下的方法來製備半乳糖的低聚糖將1，2，3，4-四-O-乙醯半乳糖(21.0g)和氯化鋅(2.1g)與四氫噻吩(10ml)充分混合，將這種混合物減壓攪拌下於90℃加熱17小時；此時反應物已經硬化並且停止蒸汽(乙酸)產生。整個反應期間將一鹼石灰試管置於反應容器和真空源之間。將反應混合物冷卻，然後將反應物溶於二氯甲烷中，用水洗滌並用硫酸鈉乾燥。減壓下脫除二氯甲烷，將產物稱重並溶於異丙醇(30ml)和甲醇(70ml)中，然後加入1M的甲醇鈉甲醇溶液(10ml)，將混合物於室溫下放置1小時。將所得的沉澱過濾並用甲醇(30ml)洗滌兩次。採用如以上實施例1和2中所描述的製備甘露糖和葡萄糖的凝膠過濾色譜法將這種混合物進行分離。根據差示折光譜的譜峰來鑑定從色譜柱中洗脫下來的產物並收集組分。用這種方法收集8種組分。在同一P2凝膠色譜柱上於60℃溫度下將這些組分中的七種重新進行兩次色譜分離，並且在第一次用水以0.5ml/min的流速及第二次以0.3ml/min的流速洗脫。採用這種方法得到以下的半乳糖低聚糖半乳三糖，1.03g，5.3％；半乳四糖，1.15g，6.0％；半乳五糖，1.21g，6.3％；半乳六糖，4.26g，22.1％；半乳七糖，2.11g，11％；半乳八糖，1.91g，9.9％和半乳九糖，0.08g，0.4％。
實施例480℃下向一種三氧化硫-吡啶絡合物(0.8g)(Aldrich)於新蒸餾的DMF(1ml)的溶液中滴加甘露五糖(2c)(0.1g)的幹吡啶(3ml)溶液，再在80℃下加熱90分鐘。趁溫將上面的液體傾出，用甲醇洗滌粘稠的殘餘物三次。傾出殘餘的甲醇後，劇烈攪拌下將產物溶於水(5ml)中並用乙酸鋇中和(至PH約6)(約0.4g於2ml水中)。離心後(3,000xg)，傾出上面的液體並保留，用水(3×10ml)洗滌沉澱的硫酸鋇。將保留的上面的液體和洗滌液合併在一起並注入一DOWEX-X8-400交換樹脂(H+型)色譜柱(1.0×14cm)中。用水洗滌色譜柱直到洗脫液為中性。將洗脫液(約50ml)攪拌並用乙酸鈉(0.7g)中和(至PH約7)。將溶液用丙酮(200ml)稀釋並離心(1,750xg)分離出產物。通過在甲醇中擠壓將小丸壓碎，再在甲醇中攪拌然後過濾。用甲醇洗滌固體數次製得純(無無機鹽)化合物(0.2g；66％)。產物無鋇離子(通過顯微分析和火焰離子分析)也無氮(顯微分析)汙染。
發現產物硫酸化的甘露五糖中可能17個位置中有11個以上被硫酸化。實測值C 14.2；H，3.0；S 14.1；Na 7.3。C30H60O59S11Na8.36H2O計算值C 14.1；H，5.2；S 13.8；Na 7.2％。實測和計算都無氮和鋇。
實施例5於幹的氮氣氛下向一種三氧化硫-吡啶絡合物(Aldrich化學公司)(4g)與幹DMF(5ml)的混合物中加入幹吡啶(10ml)。將混合物升溫至50℃並快速攪拌，將由以上實施例2中所描述的方法分離出來的葡萄六糖(4d)(0.5g)在單個加入步驟中加入。再加入吡啶(5ml)，然後將混合物保持在4℃的溫度過夜。將液體從反應容器中傾出，加入甲醇(3ml)並將半固體物質破碎，與甲醇混合。傾出甲醇後，重複操作。向殘餘的固體中加入水(5ml)並將所得到的溶液放置在一50ml的測試試管中。用水洗滌反應容器，將洗滌液與第一種溶液合併。用40％的氫氧化鈉溶液調節所得溶液的PH值7-8，然後加入甲醇(40ml)。將所得的不清亮的溶液離心(3,000xg)25分鐘，將清亮的溶液從沉澱中傾出。將殘餘的固體再次溶於水(10ml)，加入甲醇(40ml)，再如前面一樣進行離心。傾出上面的清液後，將固體溶於水(10ml)中並通過一P2凝膠脫鹽色譜柱(2.5×250cm；細粉級P2凝膠BioRad)。製得所期望的1，6-葡萄六糖的硫酸化衍生物的鈉鹽。
實施例6雖然實施例1，2和3中描述了己糖均聚物的合成，然而通常合成大多數低聚糖結構是十分困難的。因此，一種比較簡單的途徑是從天然資源中硫酸化所限定結構的低聚糖。在本實施例中使用的天然低聚糖產物有兩類。第一類中所含的低聚糖不需要進一步的降解和分級分離。這種類型的實例有麥芽糖、棉子糖和水蘇糖。第二種類型包括由天然存在的多糖通過部分酶促降解或化學降解以及大小分級分離獲得的低聚糖。這種類型的實例有來源於酵母Pichia holstii的直鏈澱粉、軟骨素和葡聚糖衍生的低聚糖以及甘露五糖磷酸酯。
麥芽糖、棉子糖和水蘇糖購自St Louis，MO的S西格瑪化學公司。麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖和麥芽七糖購自Seikagau，東京，日本，代表從α1-4連接的葡萄糖均聚物直鏈澱粉的限制性的澱粉酶消化液中提純出的低聚糖。如前所述，軟骨素四、六和八低聚糖是通過凝膠過濾分級分離由軟骨素-6-硫酸的牛睪丸透明質酸酶消化液提純而得(32)的。環六、七和八-直鏈澱粉購自西格瑪。這些低聚糖可如實施例5中所描述的那樣進行硫酸化。
比方說，採用以下的方法來製備硫酸化的麥芽六糖80℃下向一種三氧化硫-吡啶絡合物(4.0g)(Aldrich)的新蒸餾的DMF(5ml)溶液中滴加麥芽六糖(0.5g)的幹吡啶(15ml)溶液，再在80℃下加熱90分鐘。趁溫將上面的液體傾出，用甲醇(10ml)洗滌粘稠的殘餘物三次。傾出殘餘的甲醇後，劇烈攪拌下將產物溶於水(15ml)中並用乙酸鋇(約0.4g於2ml水中)中和(至PH約6)。離心後(3,000xg)，傾出上面的液體並保留，用水(3×10ml)洗滌沉澱的硫酸鋇。將保留的上面的液體和洗滌液合併在一起並注入一DOWEX-X8-400交換樹脂(H+型)色譜柱(2.5×14cm)中。用水洗脫色譜柱直到洗脫液為中性。攪拌洗脫液(→250ml)並用乙酸鈉(3.5g)中和(至PH7)。將溶液用丙酮(1L)稀釋並離心(1750xg)分離出產物。通過在甲醇中擠壓將小丸壓碎，再在甲醇中攪拌，然後過濾。用甲醇洗滌固體數次製得純(無無機鹽)化合物(0.88g；55％)。產物無鋇離子(通過顯微分析和火焰離子分析)也無氮(顯微分析)汙染。
發現這一產物中可能20個位置有14個以上被硫酸化。實測值C13.9；H，2.2；S 14.3；Na 6.7。C36H60O71S73Na14.45H2O計算值C 13.8；H，5.1；S 14.3；Na 6.6％。實測和計算都無氮和鋇。
以上製得的麥芽六糖的1H核磁共振數據(300MHZ-Gemini 300；以比TMS低2.25ppm的丙酮為參比)表明可能20個位置中的14個被硫酸化。該結論是根據化學位移約4.15ppm的H的積分為20H而化學位移約4.4ppm的H的積分為16H得出來的。可以猜測所有主要的羥基，比如在6位的羥基，由於空間位阻最小而被硫酸化。還可猜測在糖結構的內部僅僅一個另外的位置被硫酸化。除了位置6外，糖的端部各有兩個被硫酸化其它位置。
採用由二倍體酵母Pichia holstii(菌株NRRL Y-2448以前為Hansenula holstii)製備的外聚糖來製備甘露五糖磷酸酯。P.holstii的生長和甘露五糖磷酸酯的分離基於以前所描述的方法(33，34)。簡單地說，通過乙醇沉澱將粗外聚糖從有氧生長的酵母培養上清液中分離出來。然後採用酸解將甘露五糖磷酸酯從磷酸甘露糖單酯核(PPME)中釋放出來。然後通過示差乙醇沉澱以及凝膠過濾將PPME和甘露五糖磷酸酯以鋇鹽分離出來。低聚糖的結構為P-6-Man-α-(1→3)-Man-α-(1→3)-Man-α-(1→3)-Man-α-(1→2)Man(34)。
從酵母的外聚糖分離出來的酵母甘露五糖磷酸酯(33，34)的硫酸通過以下的方法來製備。將一種酵母麥芽五糖磷酸酯(0.09g)於幹吡啶(2ml)中的懸浮液中加入三氧化硫-吡啶絡合物(0.8g)(Aldrich)的新蒸餾的DMF(1ml)溶液中。將混合物於80℃下加熱2小時。趁溫將上面的液體傾出，用甲醇(2ml)洗滌粘稠的殘餘物三次。傾出殘餘的甲醇後，劇烈攪拌下將產物溶於水(5ml)中並用乙酸鋇(約0.7g於5ml水中)中和(至PH6)。離心後(3,000xg)，傾出上清液，用水(3×10ml)洗滌沉澱的硫酸鋇。將上清液和洗滌液合併在一起並注入一DOWEX 50W-X8-400交換樹脂(H+型)色譜柱(2.5×14cm)中。用水洗脫色譜柱直到洗脫液為中性。攪拌洗脫液(→50ml)並用乙酸鈉(0.4g)中和(至PH7)。將溶液用丙酮(150ml)稀釋並離心(1,750xg)分離出產物。通過在甲醇中擠壓將小丸壓碎，再在甲醇中攪拌，然後過濾。用甲醇洗滌固體數次製得硫酸化的酵母麥芽五糖磷酸酯(0.18g)。產物無鋇離子(通過顯微分析和火焰離子分離)也無氮(顯微分析)汙染。
發現產物中可能16個位置中的10個以上硫酸化。實測值C 15.35；H，2.7；P 1.2；S 13.7；Na 8.5。C30H41O59PS10Na9.25H2O計算值C 15.3；H，3.5；P 1.3；S 13.6；Na 8.8％。氮和鋇實測分別為0.16和0％，二者計算值都為％。
1，6-α-葡萄糖低聚物通過葡聚糖(平均分子量71,000；西格瑪化學公司)的酸解來製備。因此，將葡聚糖(5g)溶於蒸餾水(100ml)中，並用1M的HCl將該溶液的PH值調至1.8。100℃下回流48小時。將混合物在減壓下乾燥並用蒸餾水配至100ml，在減壓下進行第二次乾燥。將無水乙醇(100ml)加入殘餘物中並在減壓下蒸發掉。將殘餘物用蒸餾水配至4ml，並施用一5×90cm水夾套的用細粉級P2篩析凝膠(BioRad)裝填的凝膠過濾色譜柱中。該色譜柱使用前已經在60℃下裝填、預熱和運行了兩天。隨著1，6-α-葡萄糖低聚糖混合物的加入，將色譜柱保持在60℃並用水洗脫色譜柱(流速為1ml/min)。根據差示折光譜的譜峰來鑑定從色譜柱中洗脫下來的產物並收集組分。在這種方法中收集相當於分離峰以下面積的組分。在同一P2凝膠色譜柱上於60℃溫度下將這些組分中的每種重新進行色譜分離，並用水以0.5ml/min的流速洗脫。因此，比方說，將經鑑定符合1，6-α-葡萄六糖(0.19g)的組分重新進行色譜分離以便得到一個其每一邊有一個肩峰的中心主峰。通過減壓下脫除水份分離出中心峰處的洗脫產物，得到0.16g物質，60℃下再將其在同一P2凝膠色譜柱上以0.3ml/min的流速重新進行色譜分離。採用這種方法得到葡萄六糖(0.14g)(電噴霧M+＝990)。用類似的方法分離出1，6-α-葡萄三糖、1，6-α-葡萄四糖(0.21g)和1，6-α-葡萄五糖(0.17g)。
實施例7A.材料和方法硫酸化低聚糖的抗凝活性通過以前所描述的方法使用凝血酶時間和活化的部分凝血致活酶時間方法對每種硫酸化低聚糖的抗凝血活性進行評估(35)。將每種製備物的活性與一個肝素對照比較，抗凝血活性用肝素活性的百分數來表示。人體抗血管生成試驗所使用的試驗方法在國際專利申請號PCT/AU95/00105中進行了描述，本文一併參考。直徑約1-2mm長2-5cm的血管取自分娩時間不超過6小時的人體胎盤表面。將血管放置在一含2.5mg/ml兩性酶素的Hanks BSS中且用細解剖鑷子和虹膜切除剪將其切成1-2mm長的碎片。使用前將血管碎片去掉殘餘的凝塊並浸泡在Hanks BSS中。藉助於放大器燈(Maggylamp，Newbond，Balmain，NSW，Australia)將血管進行解剖和切開。從靜脈和動脈源血管獲得類似的血管生成響應，但每一個試驗只使用一根血管的碎片。
血管生成試驗在24或48孔培養平板中進行(Costa，Cambridge，MA)。在24孔培養平板中，往每一孔中加入30μl牛凝固因子II(0.15M的NaCL中50NIH單位/ml；西格瑪化學公司，聖路易斯，MO)，接著加入1.0ml在介質199中的濃度為3mg/ml的牛纖維蛋白源酶(西格瑪)。將凝固因子II和纖維蛋白源酶迅速混合，並在形成凝塊前立即將一塊血管碎片放在培養孔的中心。通常30秒內形成纖維蛋白凝膠並且血管碎片懸浮在凝膠中。在形成凝膠後往每個孔中加入1.0ml含20％胎兒腓腸血清(FCS)、0.2mgε-氨基己酸、L-穀氨醯胺和抗菌素(慶大酶素和兩性酶素)的介質199。在48孔培養板中，所有試劑的體積減半。將血管在一種潮溼的環境中於37℃的溫度下培養14-21天，培養過程中每兩周更換一次介質。由一臺安裝在翻轉式顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)上的Dycam數字式照相機獲取培養物的數字圖象，採用NIH圖象軟體通過計算機進行圖象分析來對血管生成進行定量。肝素酶試驗肝素酶試驗基於血清蛋白、富組氨酸糖蛋白(HRG)結合到硫酸乙醯肝素鏈上並掩蔽肝素酶裂解部位的觀察。基於發現被肝素酶裂解的硫酸乙醯肝素不能結合到HGR上，已經開發出一種肝素酶試驗法，該試驗涉及到用肝素酶消化用3H標記的硫酸乙醯肝素鏈，將消化的硫酸乙醯肝素結合到HRG偶合的小珠上並測量未結合的3H標記。未結合到HRG顆粒的3H標記的數量隨著消化的底物的增加而增加。因此，這種方法代表了一種用不同化合物來測量肝素酶組織浸膏活性和評估肝素酶抑制性的簡單而快速的方法。
首先，通過在水合肼中加熱將牛腸硫酸乙醯肝素(Mr av 32kDa)部分脫N-乙醯化(36)並用含3H的乙醯酐重新乙醯化。按照製造商的說明將ChickenHRG(採用Rylatt等提出的方法進行提純(1981)(37))與經CNBr活化的瓊脂糖4B(藥物)偶合。
通過將純化的人體血小板肝素酶(其已顯示出具有對硫酸乙醯肝素的與存在於高度轉移性人體癌HCT116、乳腺癌13762MAT和小鼠黑瘤中的肝素酶活性相同的活性)與60pmol3H放射性際記的牛腸硫酸乙醯肝素一起溫育(37℃，30分鐘)來測定人體血小板肝素酶活性。讓溫育混合物(100μl)通過HRG-瓊脂糖小柱(裝填200μl顆粒)，該柱中保留比較大的未裂解和部分裂解的基質，根據比較小的(大概5kDa)未被結合的硫酸乙醯肝素碎片的產生速度來測定活性。
在肝素酶抑制試驗中，在加入經放射性標記的基質前將不同濃度的抑制劑加入酶中，整個溫育期間將抑制劑保留在反應混合物中。轉移試驗採用高度轉移的大鼠乳腺癌13762MAT來評估不同的硫酸化低聚糖的抗轉移活性(35)。如以往所描述的那樣，將腫瘤細胞體外保持(35)。由靜脈向雌Fisher344大鼠中注入0.6ml含2×10513762MAT細胞的含10％FCS的RPMI介質。在動物注入腫瘤細胞的同時，也注入2mg硫酸化低聚糖，低聚糖由靜脈、動脈或皮下注射，可獲得類似的結果。將肺從注入腫瘤細胞13天後的大鼠體中取出，放置在Bouin溶液中至少24小時並在解剖顯微鏡下評估肺轉移。將經硫酸化低聚糖處理過的大鼠的肺轉移的數量與在對照動物中所觀察到的進行比較，每一組中最少包括四隻動物。硫酸化低聚糖對FGF-肝素/硫酸乙醯肝素之間的作用的影響採用一種在其它文獻中(38)已經詳細描述過的結合試驗來測量aFGF和bFGF對肝素的結合併評估不同硫酸化低聚糖對這種作用的抑制能力。簡單地說，就是將FGF固定在96孔PVC平板的孔中並評估經放射性標記的肝素對固定的FGF的結合。在抑制試驗中對一系列的硫酸化低聚糖稀溶液抑制FGF-肝素之間作用的能力進行檢測。採用抑制20％或50％的肝素結合到固定化的FGF上時所需要的硫酸化低聚糖的濃度來代表抑制結果。在所有的抑制結合試驗中，用未經標記的肝素作為對照。
如早期報導的那樣(39)，通過測定BALB/c 3T3纖維細胞對PVC固定化的FGF的結合，由粘附細胞的Rose Bengal染色所檢測到的細胞結合來評估FGF-硫酸乙醯肝素相互作用。檢測硫酸化低聚糖抑制這種細胞粘附過程的能力，這種能力總的來說取決於BALB/c 3T3細胞表面的硫酸乙醯肝素的結構(39)。數據用抑制50％(IC50)的細胞粘附所需的硫酸化低聚糖的濃度來表示。氣囊炎模式本試驗是基於一種以前報導過的方法(40)。於第一天在一隻麻醉的小鼠的肩胛骨之間的一塊剃光的區域的皮下注射5ml消毒的空氣，從而在小鼠的背上形成皮下氣囊。於第三天通過注射2.5ml空氣使氣囊重新發炎。於第六天通過將1.0ml含56mg的巰基乙酸酯或1.0ml鹽水直接注入氣囊來引起發炎，以作為對照。大概在注射巰基乙酸酯17→20小時後通過革除頸部將動物殺死並通過注射2.5ml經冰冷卻的PBS/5％FCS重新獲得囊的細胞含量。施用巰基乙酸酯後，在一個獨立的部位立即通過皮下注射(50μl在PBS中)來測試硫酸化低聚糖抑制發炎反應的能力。將氫化潑泥松作為對照抗炎症藥從皮下注入25mg/kg。用Coulter Counter測定每個囊的細胞含量並用免疫螢光流動細胞儀來評估白血球(亞群)。小鼠哮喘模式一種以前報導過的小鼠哮喘模式(41)被用來測試硫酸化低聚糖抑制由嗜酸性細胞浸入肺內所誘發的氣源性致敏原(卵清蛋白，OVA)的能力。通過在開始和第12天腹內注射含50mg Alhydrogel(CSL，Ltd，Parkville，Austrlia)的0.9％的消毒鹽水使小鼠(C57BL/6，6→10周)致敏。在第24天，讓老鼠在一種OVA(10mg/ml)的0.9％鹽水中的煙霧劑中暴露30分鐘三次(每次隔1小時)，然後在第26天和第28天進行類似的激發暴露。煙霧劑由噴霧器以6升/分鐘的速度產生，其在一個800cm3的封閉孔中產生平均直徑39μm的顆粒。在第29天將小鼠通過解剖離位而殺死。在導管中插入插管並在37℃溫度下用4×1ml含BSA(0.1％wt/vol)的0.9％的鹽水洗滌導管腔。每次洗滌大概回收0.8ml滴注液。將從一個動物中所獲得的支氣管肺泡的灌洗液(BALF)裝好並用標準的血細胞測定儀測定細胞數目。也將BALF細胞進行細胞離心並用May-Grunwald-Giemsa溶液進行微染色，採用形態學標準方法鑑別。數據以嗜酸性細胞/mlBALF數量來計算。硫酸化低聚糖要麼通過系統地在腹內插入Alzet微型浸透泵要麼通過肺部以煙霧劑的形式對動物施用。微型浸透泵在進行OVA激發前的第23，24天插入且連續地注入藥物直到動物在第29天死亡。在注入煙霧劑的情況中，在第23，25和27天將小鼠於含硫酸化低聚糖的0.9％鹽水煙霧劑中暴露30分鐘三次(每次隔1小時)。試驗性自體免預腦脊髓炎(EAE)模式如以前所描述的那樣(43)製備脾細胞用來進行EAE的轉移。簡單地說，就是使Lewis大鼠對髓磷脂鹼性蛋白敏感，在試管中用ConA體外活化免疫脾細胞並將30×106個ConA活化的EAE效應細胞靜脈轉移至各接受者。在細胞轉移時將含硫酸化低聚糖的微型浸透泵(Alzet)插入皮下並以70mg/kg/天的劑量輸注14天。根據下面的規格將臨床的EAE分級0，無症狀；1，尾部末端柔軟；2，總個尾部柔軟；3，運動失調，扶直困難；4，後肢虛弱；以及5，後肢癱瘓。炎性腸道疾病模式通過將在飲用水中補充TdB Consultancy，Uppsala，Sweden所提供的5％(w/v)葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘發小鼠炎性腸道疾病。將這種溶液的PH值調到8.0並用0.45μ的介質膜過濾。每天收集DSS溶液，重新過濾並用新鮮DSS原料調節體積。根據體重對6-7周的雄性BALB/c小鼠進行篩選並將20-23gm之間的小鼠分組按5隻/籠裝入籠中。
從開始到第10天將小鼠注射硫酸化的甘露五糖磷酸酯(20mg/kg/天)或消毒水，每8小時注射一次。注射體積標準化為100μl，並且在頸項處通過皮下注入。
每天對所有小鼠進行DSS消耗速度，體重和症狀的評分。腹瀉和直腸出血症狀每次用輕微或嚴重來評估，且依次給出1和4之間的數值。也注意到有粘液出現並認為是一種輕微的腹瀉。然後將那天那一組中腹瀉和直腸出血評分的和除以存活的動物個數。總的評分是腹瀉和直腸出血評分的和。B.結果硫酸化的天然存在的低聚糖的抗血管生成和抗轉移活性一旦合成一定範圍的硫酸化的天然存在的低聚糖，就在一定的生物試驗範圍內對其進行檢驗。表1總結了由12種硫酸化的天然存在的低聚糖所獲得的結果。作為比較，表1中也包括了蘇拉明(一種具有適當的抗血管生成和肝素酶抑制活性的化合物)(42)和肝素的生物活性。
首先可以看到所有被測試的硫酸化低聚糖的抗凝血活性都可忽略，都低於肝素活性均2％(表1)。這是一種重要的性質，因為肝素(一種有效的抗轉移化合物)由於其強有力的抗凝血活性而限制了它的臨床使用。
有三種硫酸化的天然存在的低聚糖是十分有效的人體血管生成抑制劑，它們是硫酸化的甘露五糖磷酸酯(由P.holstii衍生而來)，硫酸麥芽四糖和硫酸麥芽六糖。甘露五糖磷酸酯和麥芽六糖是這些化合物中最有效的，其50％抑制濃度為2μl/ml，而麥芽四糖的50％抑制濃度為20μl/ml。圖1中描述了一個顯著的由20μl/ml麥芽六糖所導致的血管生成抑制的例子。有趣的是注意到肝素幾乎沒有抗血管生成活性。因此，明顯地是很可能相對短鏈長的硫酸化低聚糖對這類活性是所需的。圖2和圖3中分別描述了由麥芽糖系列和硫酸化的甘露糖磷酸酯所引起的血管生成抑制的一個更完全的滴定結果。可以看到，對於麥芽糖系列，硫酸麥芽糖具有很小的抑制活性，而麥芽四糖和麥芽六糖是非常有效的抑制劑(圖2)。
表1中所提供的所有血管生成試驗都是在血管生成試驗的開始時往溫育介質中加入低聚糖。然而，初步研究(沒有給出數據)表明，在血管生成響應開始後加入硫酸麥芽六糖也能進一步抑制血管自然發展，雖然大多數有效的抑制是發生在當溫育開始時加入化合物的情況。
各種硫酸化低聚糖的肝素酶抑制活性也存在顯著的差別，最有效的抑制劑是硫酸化的甘露五糖磷酸酯和硫酸麥芽六糖，這兩種化合物的活性與肝素類似(表1)。有趣的是，這兩種化合物也是有效的抗血管生成化合物。然而血管生成抑制與許多化合物的肝素酶抑制活性沒有關係。比如，硫酸化的環直鏈澱粉是十分有效的肝素酶抑制劑，但卻是不好的血管生成抑制劑。麥芽糖系列的鏈長和肝素酶抑制也是非常重要的資料。表3提供了從二糖(麥芽糖)到七糖(麥芽七糖)整個麥芽糖系列的肝素酶抑制活性。麥芽糖沒有活性，麥芽三糖抑制活性很弱，麥芽四糖具有適當的抑制活性，而麥芽五，六和七糖具有很高的抑制活性。因此，優化的肝素酶抑制需要硫酸化的五糖或更高的糖。
對許多硫酸化的糖也進行了抗轉移活性的測試(表1)。通常，在肝素酶抑制和抗轉移活性之間存在一個很好的關係。因此，硫酸化的甘露五糖磷酸酯和硫酸麥芽六糖這兩種肝素酶抑制活性最高的化合物具有最大的抗轉移活性，事實上，它們防止轉移的能力與肝素並沒有顯著的不同(表1)。兩種其它化合物，硫酸環辛直鏈澱粉和硫酸水蘇糖也具有十分有效的抗轉移性，這與它們一定的肝素酶抑制活性是一致的。這些數據集中起來表明硫酸化的甘露五糖磷酸酯和麥芽六糖磷酸酯同時擁有相當強的抗血管生成、抗轉移和肝素酶抑制活性。
圖4中更詳細地提供了硫酸化低聚糖中麥芽糖系列的抗轉移活性。隨著鏈長的增加低聚糖的抗轉移活性穩定地增強，五、六和七糖的活性最高。當以2mg/大鼠的劑量靜脈施用時，硫酸麥芽糖對轉移沒有作用(圖4A)，但當按4mg/大鼠皮下施用時，可觀察到顯著的轉移抑制(圖4B)。隨後的實驗表明，不管注射的方式如何(比如靜脈，皮下或腹膜內)，硫酸化低聚糖都顯示出可比較的抗轉移活性(沒有給出數據)。事實上，只有當對動物高劑量施用時才能觀察到硫酸麥芽糖的抗轉移活性。既然硫酸麥芽糖是一種很差的肝素酶抑制劑，這表明肝素酶抑制不可能是硫酸化低聚糖抑制腫瘤轉移的唯一途徑，特別是當以高劑量施用時。
環直鏈澱粉被硫酸化且包括在本研究中，因為它們代表非線形低聚糖。有趣的是注意到這些化合物只有適當的活性(表1)，表明對於優化的活性來說需要線形低聚糖。而且，活性最高的硫酸化低聚糖是比蘇拉明(一種目前作為一種抗血管生成化合物而正在進行臨床試驗的藥物)(表1)有效得多的血管生成、轉移和肝素酶活性的抑制劑。
既然這些化合物的抗血管生成活性並不總是直接與其肝素酶抑制活性有關，有可能硫酸化低聚糖可通過一些其它的機理來抑制血管生成。如上所述，很有可能一些硫酸化低聚糖能通過破壞生長因子-硫酸乙醯肝素之間的相互作用來幹擾血管生成生長因子的作用。以前的分析(見國際專利申請號PCT/AU95/00105)表明本實例中使用的人體血管生成試驗主要取決於內源性bFGF，而很少取決於aFGF和VEGF的作用。因此，對不同的硫酸化低聚糖作為bFGF，aFGF和VEGF與肝素或硫酸乙醯肝素相互作用的競爭者的能力進行了檢測。
發現，隨著鏈長的增大，硫酸化低聚糖中的麥芽糖系列成為bFGF，aFGF和VEGF與細胞表面硫酸乙醯肝素相互作用的更有效的抑制劑(表2)，比如，麥芽糖的抑制性很弱，而五、六和七糖的活性最高。硫酸化的甘露五糖磷酸酯在這種系統中也顯示出很高的抑制活性(表2)。其它的研究表明硫酸麥芽六糖也是一種有效的對放射標記的肝素結合到bFGF和aFGF上的抑制劑(沒有給出數據)。
既然硫酸麥芽六糖是一種活性最高的抗血管生成和抗轉移化合物，詳細地檢測了硫酸化程度對其生物活性的影響。首先注意到，儘管檢測到大多數高硫酸化的麥芽六糖有一些抗凝血活性，但與肝素相比，這種活性是十分低的(表2)。然而，隨著硫酸化程度的增加，麥芽六糖抑制肝素酶活性和FGF結合至硫酸乙醯肝素上的能力穩定增長(表2)。然而，當硫酸化達85％或更高時抑制活性趨於平穩。
轉移抑制研究也表明(圖6)隨著硫酸化的程度增加，硫酸麥芽六糖變成更有效的抗轉移藥物。相反，非常高的硫酸化的麥芽六糖(90-100％硫酸化)卻是一種不十分有效的血管生成抑制劑(圖7)。這些數據表明對抑制血管生成和轉移所需的優化的硫酸化低聚糖中存在細微的差別。不管怎樣，已經證明幾種由天然存在的低聚糖衍生而來的硫酸化低聚糖同時顯示出有效的抗轉移和抗血管生成活性。這些化合物是來源於P.holstii的硫酸化的甘露五糖磷酸酯和硫酸麥芽五糖、六糖和七糖的。硫酸化的合成低聚糖的抗血管生成和抗轉移活性也對實施例1-5中所描述的硫酸化的合成低聚糖的生物活性進行了測試。表3總結了含甘露糖、半乳糖或葡萄糖的硫酸化的合成低聚糖抑制凝血，肝素酶作用和生長因子-硫酸乙醯肝素結合的能力。所有被測試的硫酸化低聚糖都顯示可忽略的抗凝血活性。然而，除了甘露糖和葡萄糖的三糖外，所有其它的硫酸化低聚糖都是肝素酶活性和生長因子-硫酸乙醯肝素結合的很有效的抑制劑。事實上，總的結論是在這些試驗中含4-6個己糖單元(比如D-甘露糖、D-半乳糖或D-葡萄糖)的硫酸化的合成低聚糖都具有很高的活性。一種例外是半乳三糖，其具有與半乳糖系列中其它的成員一樣的活性。
當在人體血管生成試驗中測試時，硫酸化的甘露糖低聚物是抑制性的，雖然五和六糖比四糖的活性高(圖8)，其效力類似於硫酸化的甘露五糖磷酸酯。類似地，作為抗轉移藥物，硫酸化的甘露四，五和六糖與硫酸化的甘露五糖磷酸酯一樣有效(圖9)。含半乳糖的硫酸化低聚糖和葡萄六糖硫酸也抑制轉移(圖10)，雖然它們傾向於比含甘露糖的化合物的活性稍微低一些。硫酸化低聚糖的抗炎症活性如前所述，阻止白血球進入炎症位點的關鍵屏障物是內皮下膜基膜。為了通過這層膜，白血球必須應用一套降解酶(11)。特別相關的是內糖苷酶，肝素酶，其將與硫酸乙醯肝素鏈締和的基膜裂解並且對於白血球外浸是必不可少的(12，13)。事實上，如轉移研究一樣(35)，抑制肝素酶活性的硫酸化的多糖對於炎症也是有效的抑制劑(43，44)。基於這些觀察，這也是熟悉本技術領域的人所期望的，有效的抗血管生成和抗轉移劑將是有效的抗炎症化合物。其中特別重要的是硫酸麥芽六糖和甘露五糖硫酸。並且，既然血管生成是伴隨諸如風溼性關節炎(18)之類的慢性炎症疾病而引起的，因此這些化合物的抗血管生成活性在炎症的治療中將是很有價值的。
在幾個動物的炎症模式中獲得了支持這種預言的證據。首先，硫酸麥芽六糖、甘露五糖硫酸和硫酸化的甘露五糖磷酸酯可顯著地抑制由巰基乙酸酯所誘發的氣囊炎(表4)。事實上，在一個實驗中簡單地注射甘露五糖硫酸在抑制白血球浸透中與潑泥松一樣有效，其主要是天然的中性白細胞，而硫酸麥芽六糖的效力稍差一些。當在6小時外注射兩等劑量的硫酸化低聚糖時，甚至觀察到比較大的炎症抑制。
其次，對硫酸化低聚糖進行了抑制小鼠慢性哮喘病模式的能力。這種模式的特徵在於是由氣源性致敏原激發所引起的大量的嗜酸性細胞移入老鼠的肺內(41)。這種炎症的響應在人體中的特徵是慢性哮喘病。當通過微型浸透泵部施用硫酸麥芽六糖和甘露五糖硫酸時，顯著抑制了嗜酸性細胞在老鼠肺部的積累(表5)。當硫酸麥芽六糖以一種煙霧劑(40mg/ml溶液)的形式施用時，也具有一定的抗炎症活性。
第三，甘露五糖硫酸和硫酸化的甘露五糖硫酸在一個老鼠疾病模式中都顯著地抑制EAE(表6)。事實上，一些經硫酸化低聚糖處理過的動物不出現病症。這些數據與早期研究中所表明的抑制肝素酶活性的硫酸化的多糖能減輕EAE的嚴重性的結果是一致的(43)。
最後，檢測了甘露五糖磷酸酯抑制小鼠腸道炎症疾病模式的能力。這種模式(其被飲用水中的葡聚糖硫酸誘發)引起一種類似於潰瘍性結腸炎的結腸炎和輕微的Chron病。發現20mg/kg/天的硫酸化的甘露五糖磷酸酯引起了劇烈結腸炎的顯著減弱，也阻止了由這種病產生的體重損失(表7)。這個實驗中的對照接受了硫酸化低聚糖注射但不是在飲用水中加入葡聚糖硫酸。
表1不同天然存在的低聚糖的硫酸化形式對人體血管生成、肝素酶活性和轉移性的抑制作用化合物 糖單元數 抗凝血活性a50％抑制濃度(μl/ml) 轉移性(％) 血管生成 肝素酶 (％對照)b肝素酶大約60 100 ＞2000 120±3硫酸化的甘露五糖磷酸酯c5 0.2 2 231±3硫酸化的棉子糖 3 1.6 20050 48±9硫酸化的水蘇糖 4 3.2 2000 12 36±4硫酸化的麥芽糖 2 0 2000 ＞1000 99±9硫酸化的麥芽四糖 4 0.8 20 10 72±9硫酸化的麥芽六糖 6 1.6 2 1.5 24±7硫酸化的環六直鏈澱粉 6 0.4 2008107±7硫酸化的環七直鏈澱粉 7 0.8 200781±14硫酸化的環八直鏈澱粉 8 1.6 200536±6硫酸化的軟骨素四糖 4 0 2000 ＞30 ND硫酸化的軟骨素六糖 6 0.2 2000 45 ND硫酸化的軟骨素八糖 8 ND 1000 ND ND蘇拉明-0.150874±8a抗凝血活性以肝素活性為100％b大鼠肺(其由靜脈注射接受13762MAT細胞且在細胞注射的同時接受2mg/大鼠的低聚糖)的百分對照轉移性±平均值的標準偏差(n＝4)。下劃線值表示具有最大的抗轉移作用的化合物。c從酵母Pichia holstii分離的甘露五糖磷酸酯。ND沒有測定。
表2硫酸化低聚糖中的硫酸化的甘露五糖磷酸酯和麥芽糖系列對肝素酶活性和生長因子結合到硫酸乙醯肝素上的抑制作用硫酸化低聚糖 硫酸化a％硫酸化 抗凝血活性(％)bIC50(μl/ml)c肝素酶bFGF aFGF麥芽糖 6/8 75 0.2 ＞100 ＞200134麥芽三糖 10/1191 0.8 100 145 58.7麥芽四糖 11/1479 1.6 2565 31.5麥芽五糖 15/1788 3.2 4 37.5 27麥芽六糖 18/2090 2 5 31.3 27麥芽七糖 18/2378 3.9 3 10 27甘露五糖磷酸酯d10/1663 0.2 5 25 22麥芽六糖 3/20 15 0 ＞100 187＞200麥芽六糖 9/20 45 0.8 5045.6 79麥芽六糖 14/2070 0.4 2012.5 12.5麥芽六糖 17/2085 0.7 6 5.4 10.4麥芽六糖 18/2090 2 6 5.4 18.8麥芽六糖 20/20100 33 5 5.4 19.7a實際連接的硫酸基團數目/理論上每個分子可連接的硫酸基團的最大數目b抗凝血活性以肝素活性為100％c抑制50％人體血小板肝素酶活性或小鼠3T3細胞結合至固定化的aFGF/bFGF上所需的化合物的濃度。在肝素酶試驗中，IC50對肝素是2μg/ml。d從酵母Pichia holstii分離的甘露五糖磷酸酯。ND沒有測定。
表3不同合成硫酸化低聚糖的硫酸化形式對肝素酶活性、生長因子結合到硫酸乙醯肝素上的抑制作用硫酸化低聚糖 硫酸化a％硫酸化 抗凝血活性(％)bIC50(μl/ml)c肝素酶 bFGF aFGF甘露三糖 7/11 64 0.325 ND5甘露四糖 10/14 71 0.46205甘露五糖 12/17 71 0.44155甘露六糖 11/20 55 0.8311ND半乳三糖 6.6/11 60 0.7425ND半乳四糖 8.3/14 59 1.03.5 9 ND半乳六糖 14.5/1772.5 0.73.5 11ND葡萄三糖 ND ND 0.130 47ND葡萄六糖 13.4/2067 0.43.5 15NDa實際連接的硫酸基團數目/理論上每個分子可連接的硫酸基團的最大數目b抗凝血活性以肝素活性為100％c抑制50％人體血小板肝素酶活性或小鼠3T3細胞結合到固定化的aFGF/bFGF上所需的化合物的濃度。在肝素酶試驗中，IC50對肝素是2gμ/l。d從酵母Pichia holstii分離的甘露五糖磷酸酯。ND沒有測定。
表4硫酸化低聚糖對氣囊炎的作用a處理劑量白血球浸入氣囊(％時照)b實驗1 實驗2硫酸化的麥芽六糖 50mg/kg76±7 44±12硫酸化的甘露五糖 50mg/kg57±7 16±2硫酸化的甘露五糖磷酸酯50mg/kgND51±9(P.holstii)潑泥松25mg/kg56±1444±3a氣囊炎由巰基乙酸酯所誘發且在白血球浸入17小時後評估。對實驗1，藥物與巰基乙酸酯同時由皮下注射。在實驗2中，硫酸化低聚糖在巰基乙酸酯注射0小時和7小時後由皮下注射。b數據以氣囊中浸入的百分對照白血球數±平均值的標準偏差給出。對照注射巰基乙酸酯但不接受藥物處理，只注射鹽水。在只注射鹽水的氣囊中的背景白血球浸入是跟著注射巰基乙酸酯所觀察的9±2％。ND沒有測定。
表5硫酸化低聚糖對由嗜酸性細胞在小鼠肺部積累所誘發的卵清蛋白(OVA)的作用a硫酸化低聚糖準則 劑量嗜酸性細胞/mlBALF(％對照)b麥芽六糖泵，腹膜注射 50mg/kg/天5742麥芽六糖泵，腹膜注射 115mg/kg/天 9±7麥芽六糖煙霧劑10mg/mlc98±24麥芽六糖煙霧劑40mg/mlc63±23甘露五糖泵，腹膜注射 50mg/kg/天63±12a使老鼠對OVA敏感，然後通過施用OVA煙霧劑引起肺部浸入嗜酸性細胞。硫酸化低聚糖要麼由微型浸透泵腹內注入要麼以煙霧劑通過肺部。b數據以支氣管肺泡灌洗液(BALF)中對照嗜酸性細胞數目百分數±標準偏差表示，對照是經OVA激發且以煙霧劑形式要麼通過微型浸透泵要麼通過肺部接受鹽水的動物。c煙霧劑溶液中硫酸化低聚糖的濃度。
表6硫酸化低聚糖對過繼轉移的實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)的作用a硫酸化低聚糖 EVA/總計 平均開始天數 疾病嚴重性(％對照)d對照6/6 5.5±0.2 100±11甘露五糖3/5 5.3±0.3 31.5±15.1甘露五糖磷酸酯 4/5 5.3±0.3 47.9±16.4(P.holstii)a EAE通過用30×106個ConA活化的EAE效應細胞在Lewis大鼠中誘發。b硫酸化低聚糖在細胞轉移時由微型浸透泵插入皮下來施用，接受的劑量為70mg/kg/天。c在發生疾病的動物中EAE開始的平均天數。d疾病嚴重性代表動物的累積臨床評分。
表7硫酸化的甘露五糖磷酸酯對小鼠腸道炎性疾病的作用a天數b未經處理的 經處理的平均疾病評分d體重(gm)d平均疾病評分d體重(gm)d0 0 23.1 0 22.11 0 23.2 0 22.12 0 23.6 0 22.63 0 23.5 0 22.54 0 23.3 0 21.95 0 23.4 0 21.96 0.47 23.3 0.07 22.47 1.40 22.7 0.40 22.48 2.47 22.1 0.40 22.39 2.87 21.4 0.67 22.210 2.00 20.7 0.93 22.1a通過在飲用水中施用葡聚糖硫酸所誘發的腸道炎疾病。b開始施用葡聚糖磷酸酯後的天數。c未經處理的動物每天接受三次鹽水注射而經處理的動物每天以20mg/kg/天接受三次硫酸化的甘露五糖磷酸酯注射。d平均疾病評分代表動物在每個時間點腹瀉和直腸出血的評分的和。
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權利要求
1.一種硫酸化低聚糖，該低聚糖具有結構通式IR1-(Rx)n-R2(I)其中R1和R2以及每個Rx代表一個單糖單元，所有的單糖單元可以相同也可以不同，相鄰的單糖單元由1→2，1→3，1→4和/或1→6糖苷鍵連接；且n是1-6之間的整數。
2.按照權利要求1的硫酸化低聚糖，其中n是1→4，優選地是3或4。
3.按照權利要求1或2的硫酸化低聚糖，其中所說的單糖單元是選自由果糖、葡萄糖、甘露糖、阿卓糖、阿洛糖、塔羅糖、半乳糖、艾杜糖和古洛糖組成的組的己糖。
4.按照權利要求1的硫酸化低聚糖，該低聚糖具有結構通式IIRy-(Ry)n-Ry(II)其中每一個Ry基團相同且每個代表一個單糖單元，相鄰的單糖單元由1→3，1→4和/或1→6糖苷鍵連接；且n是1-6之間的整數。
5.按照權利要求4的硫酸化低聚糖，其中n是1-4，優選地是3或4。
6.按照權利要求4或5的硫酸化低聚糖，其中Ry代表一個單糖單元，該單糖單元是選自由葡萄糖、甘露糖、阿卓糖、阿洛糖、塔羅糖、半乳糖、艾杜糖和古洛糖組成的組的己糖。
7.按照權利要求6的硫酸化低聚糖，其中Ry代表葡萄糖，甘露糖或半乳糖。
8.按照按照權利要求1的硫酸化低聚糖，其中所說的低聚糖是天然存在的低聚糖。
9.按照權利要求8的硫酸化低聚糖，其中所說的低聚糖選自棉子糖和水蘇糖。
10.按照權利要求1的硫酸化低聚糖，其中所說的低聚糖是通過天然存在的多糖的酶促降解或化學降解製備的。
11.按照權利要求10的硫酸化低聚糖，其中所說的低聚糖是一種由直鏈澱粉，軟骨素或葡聚糖衍生的低聚糖。
12.按照權利要求11的硫酸化低聚糖，其中所說的低聚糖選自麥芽四糖、麥芽五糖和麥芽六糖；葡萄三糖、葡萄四糖和葡萄五糖；以及軟骨素四、六和八糖。
13.按照權利要求10的硫酸化低聚糖，其中所說的低聚糖是來源於酵母Pichia holstii的甘露五糖磷酸酯。
14.一種用於對需要抗血管生成、抗轉移和/或抗炎症治療的人或其它溫血動物患者進行這種治療的方法，該方法包括對患者施用有效量的至少一種按照權利要求1-13之任一的硫酸化低聚糖。
15.按照權利要求1-13之任一的硫酸化低聚糖在溫血動物(包括人)患者的治療中作為抗血管生成、抗轉移和/或抗炎症藥劑的用途。
16.按照權利要求14或15的方法或用途，其中所說的治療包括血管生成依賴性疾病的治療，所述疾病包括與實體腫瘤生長有關的血管生成、增生性視網膜病和類風溼性關節炎。
17.按照權利要求14或15的方法或用途，其中所說的治療包括治療其中肝素酶抑制活性抑制白血球滲透的炎症性疾病和病態，包括諸如類風溼性關節炎、多部位硬化、胰島素依賴性糖尿病之類的慢性炎症性疾病；諸如潰瘍性結腸炎和克羅恩氏炎症性腸道疾病之類的疾病；同種異體移植排斥和慢性哮喘病。
18.一種用於抗血管生成、抗轉移和/或抗炎症治療的藥物或獸藥組合物，該組合物包含至少一種按照權利要求1-13之任一的硫酸化低聚糖以及藥學上和獸醫學上可接受的載體或稀釋劑。
19.按照權利要求1-13之任一的至少一種硫酸化低聚糖在製造用於人或其它溫血動物患者的抗血管生成、抗轉移和/或抗炎症治療之藥物上的用途。
20.一種低聚糖，該低聚糖具有結構通式IIRy-(Ry)n-Ry(II)其中每一個Ry基團相同且每一個代表一個單糖單元，相鄰的單糖單元由1→3，1→4和/或1→6糖苷鍵連接；且n是1-6之間的整數。
21.按照權利要求20的低聚糖，其中n是1-4，優選地是3或4。
22.按照權利要求20或21的低聚糖，其中Ry代表一個單糖單元，該單糖單元是選自由葡萄糖、甘露糖、阿卓糖、阿洛糖、塔羅糖、半乳糖、艾杜糖和古洛糖組成的組的己糖。
23.按照權利要求22的低聚糖，其中Ry代表葡萄糖、甘露糖或半乳糖。
24.按照權利要求20的低聚糖，其中Ry是一個全部O-乙醯化的單糖，或Ry是一個全部由不是乙醯基的醯基部分O-酯化的單糖。
全文摘要
硫酸化低聚糖及其作為抗血管生成、抗轉移和/或抗炎症藥劑的用途,其中所說的低聚糖具有結構通式Ⅰ:R
文檔編號A61K31/40GK1183043SQ96193563
公開日1998年5月27日 申請日期1996年4月24日 優先權日1995年4月28日
發明者C·R·帕裡施, W·B·科鄧 申請人:澳大利亞國立大學