一種胞二磷膽鹼的製備方法
2023-12-08 08:12:11
專利名稱：：一種胞二磷膽鹼的製備方法
技術領域：
：本發明屬於生物製藥
技術領域：
，具體涉及一種胞二磷膽鹼的製備方法。技術背景胞二磷膽鹼，又稱胞磷膽鹼鈉，是腦代謝激活劑，可促進神經細胞膜卵磷脂的合成，具有修復腦損傷，抗缺氧，改善記憶，增強智力的作用，臨床應用較廣。所以，胞二磷膽鹼的合成技術是人們比較關心的研究課題。與CMP可廉價地製造和供應相比，雖然報導胞二磷膽鹼有化學合成法、酶法和微生物轉化合成等方法，但是前兩種方法成本太高，現在已不再採用。目前常用的方法是微生物轉化法，利用微生物的細胞酶系合成，但是由於工藝原因，轉化率普遍偏低，發酵周期太長，致使轉化率、產品濃度較低。目前，全世界使用微生物細胞作酶源進行酶催化反應來生產胞二磷膽鹼。由於細胞具有維持其生命活動的完整的多酶系統，各種酶又保持著原有生活細胞所處的狀態和特定位置，因此能夠迅速有效地完成多步酶催化反應。1970年，Tochikura等人(JFermentTechnol.1970，48:769—773)採用風乾麵包酵母(Sflcc/wfrawycescarMerge朋&)作酶源，在磷酸緩衝液中，以葡萄糖酵解提供能量，CMP和磷酸膽鹼作底物，合成了胞二磷膽鹼。其後他們還研究了43株菌株產胞二磷膽鹼的能力，獲得了兩株菌株(SacctoromycesIAM4309和Sacctoromyce;yraww7IFO0495)，轉化率可達80%。我國從1975年開始陸續報導，利用啤酒生產中的下腳料溼酵母等為原料，催化CMP與磷酸膽鹼或氯化膽鹼轉化生產胞二磷膽鹼，轉化率在80%左右。1992年邱蔚然等首次報導了採用K-卡拉膠固定化酵母生物合成胞二磷膽鹼，轉化率為40%-60%。徐仁華等(徐仁華，蘇州天馬醫藥集團天吉生物製藥有限公司，中國，C12P19/30，CN1944661A，2007)利用啤酒酵母合成胞二磷膽鹼，轉化率達到65%,產品濃度最高只有4g/L。張劍(張劍，CN101130797A，2008)利用啤酒廠廢酵母將CMP和磷酸膽鹼合成胞二磷膽鹼，轉化率達到80%，產品濃度未提及。這種工藝採用的磷酸膽鹼需要由氯化膽鹼與無水磷酸在高溫下縮合形成，工藝更複雜，汙染與副產物更多，設備成本和操作成本也很高。鑑於胞二磷膽鹼的製備過程中，需要消耗大量的能量(ATP),因此在胞二磷膽鹼的製備過程中需要兩個酶系即ATP的再生體系和胞二磷膽鹼合成酶系。ATP的再生體系以廉價的葡萄糖為底物，通過糖酵解途徑(EMP)來實現，該途徑是能量再生的最經濟的途徑之一；胞二磷膽鹼合成酶系由核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、膽鹼激酶和磷酸膽鹼胞苷轉移酶構成，供體ATP在胞二磷膽鹼合成過程中作為磷酸供體和能量而存在，該酶系在釀酒酵母和麵包酵母中比較發達，胞二磷膽鹼的產品濃度主要取決於能量原位再生的效率，胞二磷膽鹼合成酶系的效率以及兩者原位耦聯的效率。目前國內外胞二磷膽鹼轉化率、產品濃度普遍不高的一個重要原因就在於效率低下的ATP再生體系與高效的胞二磷膽鹼合成酶系之間的不匹配。因此胞二磷膽鹼合成的關鍵就在於如何提高ATP再生的速率即提高EMP途徑的通量，而在現有技術中，葡萄糖通過EMP途徑生成ATP的效率很低，只能維持酵母細胞一般的生命代謝，要打破原有的平衡，加大EMP途徑的通量，超量表達底物磷酸化水平，只有通過基因工程技術或採用小分子化學效應物質(鎂離子和鉀離子的組合)改變代謝流量的方法來實現，其中採用後者更方便快捷，易於實現。經小分子化學效應物調節後，可使EMP途徑的代謝流量發生明顯改變，對於底物的利用效率和利用速率(葡萄糖、磷酸鹽)明顯上升，ATP再生的速率也得到了很大的提高。當其速率與胞二磷膽鹼合成體系的速率相匹配時，能量的利用效率和胞二磷膽鹼的轉化率、產品濃度才能達到較高的水平，從而實現胞二磷膽鹼的超量生產。另一方面，由於膽鹼激酶在常規反應條件下活性較低，不能有效地合成磷酸膽鹼，這樣減緩了胞二磷膽鹼合成的速率。所以現有工藝通常使用磷酸膽鹼。磷酸膽鹼是通過氯化膽鹼與無水磷酸在高溫條件下脫水縮合而成，這樣使得設備增多，流程變得複雜，操作強度也大大增加，成本也隨之提高。而利用小分子效應物(甘露醇、半胱氨酸或精胺)調節並提高膽鹼激酶的活性使直接利用氯化膽鹼作為轉化原料成為可能。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種胞二磷膽鹼的廉價高效的製備方法。為解決上述技術問題，本發明的思路是通過以氯化膽鹼、磷酸根離子和胞苷一磷酸(CMP)或其前體物質為底物，採用酵母細胞全細胞催化法製備胞二磷膽鹼，合理的運用全細胞催化和代謝工程的原理，通過建立代謝網絡模型和代謝流量分析、採用小分子化學效應物質調控代謝流量從而提高能量自耦聯及膽鹼磷酸化效率的方法，利用有透性的酵母細胞來高效製備胞二磷膽鹼，從而使產率大幅提高，底物(如葡萄糖等)的利用率也有所提高。發明的關鍵在於1)本發明直接利用了微生物體內的酶系EMP途徑酶系(己糖激酶、磷酸葡萄糖異構酶、磷酸果糖激酶、醛縮酶、磷酸丙糖異構酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶)和胞二磷膽鹼合成酶系(核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、膽鹼激酶和磷酸膽鹼胞苷轉移酶)進行催化反應，由於細胞具有維持其生命活動的完整的多酶系統，各種酶又保持著原有生活細胞所處的狀態和特定位置，反應所需要的能量和輔酶因子不需要外界供給，直接由細胞產生，因此能夠迅速有效地完成多步酶催化反應，在大規模生產方面，有轉化效率高、成本低，以及汙染小的優點。2)本發明是建立在全細胞催化的基礎上的，其特點在於克服了其它方法底物轉化率不高、難於實現能量和輔酶再生的種間耦合，不易改變細胞膜的通透性等缺陷。特別是與酶催化相比，由於使用的是全細胞，胞內的酶受細胞壁、細胞膜的保護，酶穩定性更好，半衰期更長，更易實現能量和輔酶的再生；胞內多種酶系的存在以實現酶的級聯反應可以彌補酶法催化中級聯催化不易實現的不足，同時省去酶的純化過程，製備簡單，成本低廉。3)本發明主要涉及葡萄糖的底物水平磷酸化。在現有技術中，葡萄糖通過EMP途徑生成ATP的效率很低，只能維持酵母一般生命代謝。而在本發明利用代謝工程及全細胞催化技術，加入鉀離子，鎂離子等無機離子，使得FDP的累積速率明顯加快，刺激丙酮酸激酶活性，加速了磷酸烯醇式丙酮酸的分解，產生更多的ATP，使葡萄糖的磷酸化速率加快；另一方面是由於磷酸烯醇式丙酮酸的分解，使得原來由甘油磷酸脫氫酶催化磷酸二羥丙酮引起的NAD的再生，仍由乙醇脫氫酶擔當，系統內的代謝途徑流量發生明顯改變，流向甘油的代謝流量大幅減小，使得每分子葡萄糖產生的ATP的利用率因此得到了很大的提升。ATP的再生速率的加快，有利於更快更多的生成CTP和磷酸膽鹼。這樣使得低成本、高轉化率地由CMP及其前體物質和氯化膽鹼一次轉化生產胞二磷膽鹼成為可能，開闢了胞二磷膽鹼生產的新的、可行途徑。一般情況下，產生的ATP供給酵母的生命代謝，ATP無法有效積累，但在有大量的無機磷酸鹽和Mg^存在的情況下，一方面由於大量Mg^的存在，刺激了己糖激酶的活性；另一方面由於大量無機磷酸鹽的存在，可部分解除由ATP引起的抑制，使EMP通量明顯增大，從而導致能量ATP合成速率增大，高效地耦聯了消耗ATP的CTP合成與磷酸膽鹼的合成。4)通過大量的研究工作發現細胞膜的結構特性決定了細胞膜一般不允許極性分子通過，而胞二磷膽鹼帶有約一個極性負電荷，因此欲使胞二磷膽鹼通過細胞膜積累於反應液中，必須改變細胞膜的透性。細胞膜通透性的改變是胞二磷膽鹼積累於胞外的前提條件。對微生物用表面活性劑進行預處理，改善了微生物細胞壁的通透性，加速反應組分向微生物細胞的擴散、滲透，促進底物和酶系的接觸，可使最大轉化率以及最大產品濃度出現的時間在一定限度內縮短。5)代謝通量經調節因子鎂離子和鉀離子調節後，代謝途徑流量分配發生了重大改變，EMP的支路途徑被強烈抑制，使得EMP主途徑得以加強。從而提高了對能量的利用率，能量的實際利用率從54.2%提高到62%左右，而胞二磷膽鹼的積累正需要ATP供給能量與磷酸根，胞二磷膽鹼進而得以大量積累。6)膽鹼激酶的活性經調節因子(甘露醇、半胱氨酸或精胺)調節提高後，磷酸膽鹼的合成速率大大提高，而CTP積累所導致的對膽鹼激酶的抑制也有效地被解除，從而胞二磷膽鹼合成的兩個底物的合成速率也得到匹配，胞二磷膽鹼得到快速而大量的積累。本發明的具體技術方案如下一種胞二磷膽鹼的製備方法，以氯化膽鹼、磷酸根離子和胞苷一磷酸或其前體為底物，以葡萄糖、果糖、蔗糖或麥芽糖為能量供體，加入小分子化學效應物質，利用有透性的酵母細胞全細胞催化製備胞二磷膽鹼。其中，胞二磷膽鹼，即CDP-choline，其結構式如下其中，所述的胞苷一磷酸前體為乳清酸或胞苷。其中，磷酸離子可選自正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸等多磷酸，磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等無機磷酸鹽。底物中，胞苷一磷酸或其前體的起始反應濃度為2050mM;氯化膽鹼的起始反應濃度為40150mM;磷酸根離子的起始反應濃度為0.012M，優選0.020.5M。能量供體可選擇葡萄糖、果糖、蔗糖或麥芽糖中的任意一種，起始反應濃度為0.10———0—If—0—CH2CH2N+(CH3):其中，胞苷一磷酸即CMP，其結構式如下:61M。其中，所述的小分子化學效應物質為鎂離子、鉀離子、甘露醇、半胱氨酸和精胺中的任意一種或幾種的組合物；Mg^可選自硫酸鎂、硝酸鎂、氯化鎂等無機鹽，其起始反應濃度為1200mM，優選250mM;K+起始反應濃度為lmM2M，優選0.11M;甘露醇起始反應濃度為120mM，優選510mM;半胱氨酸起始反應濃度為110mM，優選38mM;精胺起始反應濃度為120mM，優選210mM。其中，所述的酵母細胞是指從酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、球擬酵母屬、德巴利酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬和酒香酵母屬中任意一種能夠利用胞苷一磷酸或胞苷前體合成胞二磷膽鹼的酵母；優選的例子可舉，屬於酵母屬的微生物釀酒酵母，麵包酵母等；屬於假絲酵母屬的微生物近平滑假絲酵母；屬於畢赤酵母屬的奧默列氏畢赤酵母；屬於球擬酵母屬的微生物白色球擬酵母；屬於德巴利酵母屬的類球形德巴利酵母；屬於接合酵母屬的魯氏接合酵母；屬於克魯維酵母屬的馬克斯克魯維酵母；屬於漢遜酵母屬的傑丁漢遜酵母；屬於酒香酵母屬的異酒香酵母等。酵母的使用量為按溼菌體100800g/L，優選200600g/L。其中，所述的有透性的酵母細胞是指通過化學、物理或生物方法處理過的細胞膜的通透性改變過的酵母細胞，具體方法包括表面活性劑法、有機溶劑法、凍融法、超聲波處理法、風乾法、冷凍乾燥法或溶菌酶法。表面活性劑法中使用的表面活性劑為非離子型表面活性劑聚環氧乙烷胺或曲拉通X—100、陽離子型表面活性劑十六烷基三甲胺'溴化物，或者陰離子表面活性劑月桂醯-肌氨酸鹽，使用量為0.150g/L，優選l20g/L，即表面活性劑法處理酵母細胞時，將表面活性劑直接加入反應液，對於總體積為1L的反應液，加入0.150g，優選加入l~20g。有機溶劑法中使用的有機溶劑為二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，使用量為0.150mL/L，優選l20mL/L，即有機溶劑法處理生產菌株時，將有機溶劑直接加入反應液，對於總體積為1L的反應液，加入0.150mL，優選加入l20mL。上述酵母的利用形式可以是酵母細胞的乾燥物、經過發酵培養分離離心得到的細胞、細胞的凍乾物、市售酵母粉、風乾酵母或廢酵母泥。胞二磷膽鹼的生成反應在水溶液中進行，在pH510,2050'C條件下反應220小時。優選反應條件是pH68，溫度為2540°C。本發明的製備胞二磷膽鹼的主要代謝途徑如圖1所示。本發明的有益效果為本發明者們研究了通過以氯化膽鹼、磷酸根離子和CMP或其前體物質為底物的酵母全細胞催化製備胞二磷膽鹼的方法，合理的運用全細胞催化和代謝工程的原理，通過建立代謝網絡模型和代謝流量分析、採用小分子化學效應物質調控代謝流量從而提高能量自耦聯及膽鹼磷酸化效率的方法，利用有透性的酵母細胞來高效製備高能磷酸化合物，轉化率和產品濃度大幅提高，底物及其他原料(如葡萄糖等)的利用率也有所提高，並且採用氯化膽鹼為反應原料，避免了額外設備投入，降低了生產成本。利用本發明的方法生產胞二磷膽鹼的反應結果見表1。表l本發明方法與現有方法產量對比tableseeoriginaldocumentpage8*文獻是指顧復昌，楊亮懿.胞二磷膽鹼的生產.發酵科技通訊(2007)圖1是本發明中胞二磷膽鹼的合成途徑。具體實施例方式實施例1:酵母培養基(g/L):葡萄糖40，尿素2.0，磷酸二氫鉀1.5，七水合硫酸鎂0.5，七水合硫酸鋅4.0xl(T3，七水合硫酸亞鐵3.0xl0—3，四水合氯化錳0.3xl(T3，無水氯化鈣l.Oxl(T3，生物素0.05xl(T3。釀酒酵母接種量10%，於30。C下120rpm搖床培養24小時,離心4000rpm，20分鐘。取酵母泥，一7'C保藏備用。實施例2:以CMP和氯化膽鹼為底物，葡萄糖為能量供體，製備胞二磷膽鹼在容量為15L的反應槽中，調製由60mM氯化膽鹼、0.20M磷酸二氫鈉、30mMCMP、0.3M葡萄糖、50mM硫酸鎂、lmM氯化鉀、2mM半胱氨酸、利用實施例1所述的方法培養的2800克釀酒酵母泥、十六垸基三甲胺.溴化銨10克和水組成的反應液IOL，用氫氧化鈉調pH至6.8，於37'C條件下低速攪拌反應10h，反應結束後，離心沉澱，對上清液進行胞二磷膽鹼定量分析，轉化液中含胞二磷膽鹼14.9克/升，胞二磷膽鹼的轉化率達到97.4%(mol計)。實施例3:以胞苷和氯化膽鹼為底物，葡萄糖為能量供體，製備胞二磷膽鹼在容量為15L的反應槽中，調製由150mM氯化膽鹼、0.5M磷酸二氫鉀、50mM胞苷、0.5M葡萄糖、2mM硫酸鎂、5mM甘露醇、利用實施例1所述的方法培養的2700g麵包酵母泥、10g曲拉通X—100和水組成的反應液12L，用氫氧化鈉調pH至6.0，於32'C條件下低速攪拌反應15h，反應結束後，離心沉澱，對上清液進行胞二磷膽鹼定量分析，轉化液中含胞二磷膽鹼22.95克/升，胞二磷膽鹼的轉化率達到90%(mol計)。實施例4:以CMP和氯化膽鹼為底物，葡萄糖為能量供體，製備胞二磷膽鹼在容量為1500升的反應槽中，調製由60mM氯化膽鹼、2M磷酸二氫鉀、20mMCMP、1M葡萄糖、200mM硫酸鎂，10mM半胱氨酸、利用實施例1所述的方法培養的250kg奧默列氏畢赤酵母泥、500mL二甲苯和水組成的反應液1000升，用氫氧化鈉調pH至8，於40'C條件下低速攪拌反應20h，反應結束後，離心沉澱，對上清液進行胞二磷膽鹼定量分析，轉化液中含胞二磷膽鹼10.12克/升，胞二磷膽鹼的轉化率達到99.2%(mol計)。實施例5:以乳清酸和氯化膽鹼為底物，麥芽糖為能量供體，製備胞二磷膽鹼在容量為15升的反應槽中，調製由50mM氯化膽鹼、0.01M磷酸二氫鉀、20mM乳清酸、0.1M麥芽糖、20mM硫酸鎂、lmM精胺、利用實施例1所述的方法培養的2000g經風千的白色球擬酵母和水組成的反應液10升，用氫氧化鈉調pH至10，於25'C條件下低速攪拌反應18h，反應結束後，離心沉澱，對上清液進行胞二磷膽鹼定量分析，轉化液中含胞二磷膽鹼9.18克/升，胞二磷膽鹼的轉化率達到90%(mol計)。實施例6:以CMP和氯化膽鹼為底物，果糖為能量供體，製備胞二磷膽鹼在容量為15升的反應槽中，調製由100mM氯化膽鹼、0.02M磷酸二氫鉀、40mMCMP、0.2M果糖、lOmM精胺、利用實施例1所述的方法培養的1000g經凍融處理的近平滑假絲酵母和水組成的反應液10升，用氫氧化鈉調pH至5，於2(TC條件下低速攪拌反應10h，反應結束後，離心沉澱，對上清液進行胞二磷膽鹼定量分析，轉化液中含胞二磷膽鹼19.18克/升，胞二磷膽鹼的轉化率達到94%(mol計)。實施例7:以CMP和氯化膽鹼為底物，蔗糖為能量供體，製備胞二磷膽鹼在容量為15升的反應槽中，調製由80mM氯化膽鹼、0.1M磷酸二氫鉀、40mMCMP、0.2M蔗糖、lmM硫酸鎂、20mM精胺、利用實施例1所述的方法培養的6000g經超聲波處理的類球形德巴利酵母和水組成的反應液10升，用氫氧化鈉調pH至7，於50'C條件下低速攪拌反應2h，反應結束後，離心沉澱，對上清液進行胞二磷膽鹼定量分析，轉化液中含胞二磷膽鹼19.38克/升，胞二磷膽鹼的轉化率達到95%(mol計)。實施例8:以CMP和氯化膽鹼為底物，蔗糖為能量供體，製備胞二磷膽鹼在容量為15升的反應槽中，調製由60mM氯化膽鹼、1M磷酸二氫鉀、30mMCMP、0.5M蔗糖、20mM甘露醇、lmM半胱氨酸、利用實施例1所述的方法培養的80000g傑丁漢遜酵母、500mL丙酮和水組成的反應液10升，用氫氧化鈉調pH至7，於35°C條件下低速攪拌反應15h，反應結束後，離心沉澱，對上清液進行胞二磷膽鹼定量分析,轉化液中含胞二磷膽鹼14.54克/升，胞二磷膽鹼的轉化率達到95%(mol計)。實施例9:以胞苷和氯化膽鹼為底物，葡萄糖為能量供體，製備胞二磷膽鹼在容量為15升的反應槽中，調製由80mM氯化膽鹼、0.5M焦磷酸、35mM胞苷、0.8M葡萄糖、O.OIM氯化鉀、lmM甘露醇、3mM半胱氨酸、利用實施例1所述的方法培養的4000g異酒香酵母、lmL乙酸乙酯和水組成的反應液10升，用氫氧化鈉調pH至7，於38。C條件下低速攪拌反應5h，反應結束後，離心沉澱，對上清液進行胞二磷膽鹼定量分析，轉化液中含胞二磷膽鹼16.07克/升，胞二磷膽鹼的轉化率達到90%(mol計)。實施例10:以胞苷和氯化膽鹼為底物，葡萄糖為能量供體，製備胞二磷膽鹼在容量為15升的反應槽中，調製由40mM氯化膽鹼、0.2M焦磷酸、20mM胞苷、0.5M葡萄糖、5mM硫酸鎂、lOmM甘露醇、8mM半胱氨酸、2mM精胺、利用實施例1所述的方法培養的2000g釀酒酵母、500g月桂醯'肌氨酸鹽和水組成的反應液10升，用氫氧化鈉調pH至8，於38'C條件下低速攪拌反應8h，反應結束後，離心沉澱，對上清液進行胞二磷膽鹼定量分析，轉化液中含胞二磷膽鹼9.8克/升，胞二磷膽鹼的轉化率達到96%(mol計)。權利要求1、一種胞二磷膽鹼的製備方法，其特徵是以氯化膽鹼、磷酸根離子和胞苷一磷酸或其前體為底物，以葡萄糖、果糖、蔗糖或麥芽糖為能量供體，加入小分子化學效應物質，利用有透性的酵母細胞全細胞催化製備胞二磷膽鹼。2、根據權利要求1所述的胞二磷膽鹼的製備方法，其特徵是所述的胞苷一磷酸前體為乳清酸或胞苷。3、根據權利要求1所述的胞二磷膽鹼的製備方法，其特徵是底物中，胞苷一磷酸或其前體的起始反應濃度為2050mM;氯化膽鹼的起始反應濃度為40150mM;磷酸根離子的起始反應濃度為0.012M;。4、根據權利要求1所述的胞二磷膽鹼的製備方法，其特徵是能量供體的起始反應濃度為0.11M。5、根據權利要求1所述的胞二磷膽鹼的製備方法，其特徵是所述的小分子化學效應物質為鎂離子、鉀離子、甘露醇、半胱氨酸和精胺中的任意一種或幾種的組合物；Mg^起始反應濃度為1200mM，K+起始反應濃度為lmM2M，甘露醇起始反應濃度為120mM，半胱氨酸起始反應濃度為110mM，精胺起始反應濃度為120mM。6、根據權利要求1所述的胞二磷膽鹼的製備方法，其特徵是所述的酵母細胞是指從酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、球擬酵母屬、德巴利酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬和酒香酵母屬中任意一種能夠利用胞苷一磷酸或胞苷前體合成胞二磷膽鹼的酵母，酵母的使用量為按溼菌體100800g/L。7、根據權利要求1所述的胞二磷膽鹼的製備方法，其特徵是所述的有透性的酵母細胞是指通過化學、物理或生物方法處理過的細胞膜的通透性改變過的酵母細胞，具體方法包括表面活性劑法、有機溶劑法、凍融法、超聲波處理法、風乾法、冷凍乾燥法或溶菌酶法。8、根據權利要求7所述的胞二磷膽鹼的製備方法，其特徵是表面活性劑法中使用的表面活性劑為非離子型表面活性劑聚環氧乙烷胺或曲拉通X—IOO、陽離子型表面活性劑十六垸基三甲胺-溴化物，或者陰離子表面活性劑月桂醯-肌氨酸鹽，使用量為0.150g/L。9、根據權利要求7所述的胞二磷膽鹼的製備方法，其特徵是有機溶劑法中使用的有機溶劑為二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，使用量為0.150mL/L。10、根據權利要求l、6、7、8或9所述的胞二磷膽鹼的製備方法，其特徵是酵母的利用形式可以是酵母細胞的乾燥物、經過發酵培養分離離心得到的細胞、細胞的凍乾物、市售酵母粉、風乾酵母或廢酵母泥。11、根據權利要求1~9中任意一項所述的胞二磷膽鹼的製備方法，其特徵是胞二磷膽鹼的生成反應在水溶液中進行，在pH510，2050'C條件下反應220小時。全文摘要本發明公開了一種胞二磷膽鹼的製備方法，以氯化膽鹼、磷酸根離子和胞苷一磷酸或其前體為底物，以葡萄糖、果糖、蔗糖或麥芽糖為能量供體，加入小分子化學效應物質，利用有透性的酵母細胞全細胞催化製備胞二磷膽鹼。本發明通過建立代謝網絡模型和代謝流量分析、採用小分子化學效應物質調控代謝流量從而提高能量自耦聯及膽鹼磷酸化效率的方法，利用有透性的酵母細胞來高效製備胞二磷膽鹼，產品濃度大幅提高，底物的利用率也有提高。文檔編號C12P19/00GK101538598SQ20081001985公開日2009年9月23日申請日期2008年3月19日優先權日2008年3月19日發明者應漢傑,磊張,李振江,柏建新,歐陽平凱,湯佳鵬,健熊申請人:南京工業大學