檢測rna分子的方法、試劑盒及其相關用途的製作方法

2023-12-08 06:57:26 2

專利名稱：檢測rna分子的方法、試劑盒及其相關用途的製作方法
技術領域：
第一方面，本發明涉及檢測RNA分子的方法，所述方法包括以下步驟提供含有所 述RNA分子的樣品；將第一多核苷酸與所述RNA分子雜交；延伸所述第一多核苷酸以產生 第一鏈cDNA ；將第二多核苷酸與所述第一鏈cDNA雜交，其特徵在於所述第二多核苷酸是 3'-不可延伸的寡核苷酸；延伸所述第一鏈cDNA以產生延伸反應產物；通過聚合酶鏈式反 應擴增所述延伸反應產物；以及通過實時螢光讀出(real-time fluorescence readout)檢 測擴增產物。另一方面，本發明涉及試劑盒，所述試劑盒包含如本發明所定義的第一和第二 多核苷酸、一組dNTPs、逆轉錄酶和檢測部分。還另一方面，本發明涉及根據本發明的所述試 劑盒用於檢測RNA分子的用途。
背景技術：
RNA分子在多種生物的基因表達中發揮重要作用。最近，發現小RNAs是轉錄後基 因表達，特別是基因沉默的重要調節子，對活細胞中的生理和病理過程有影響。由小RNAs 引導的基因沉默過程首先於1993年在線蟲類(nematode)秀麗新杆線蟲(femorA^i/iiis We^ms)中發現。在其中，顯示基因的21-nts長的非編碼RNA轉錄物介導稱為 lin-41的靶基因的抑制。這種抑制顯示為依賴於短lin-4 RNA分子和源自Wz7-W基因的 mRNA轉錄物的3'-非翻譯區(UTR)之間的互補鹼基配對。從那時起，已發現短RNAs是植物、 動物和DNA病毒中一類豐富的基因調節子，已在從裂殖酵母到人類的多種生物中鑑定了不 同來源和功能的短RNAs。短調節RNAs的種類包含例如miRNA (微RNA)、siRNA (小幹擾RNA)、 piRNA (Piwi-相互作用RNA)以及rasiRNA (重複相關小幹擾RNA)。在它們之中，miRNAs 是植物和動物中最豐富類型的小調節RNAs。例如，大約3 %的人類基因編碼miRNAs，最多30 %的人類蛋白編碼基因被認為由miRNAs調節。迄今，通過克隆和測序已鑑定出大於10.000 種不同的 miRNAs (參見，例如，miRBase: the microRNA registry database at http:// www, mirbase. org/, Sanger Institute, UK) 。 一|5胃*，miRNAs 白勺牛寺 11 21-25
(nts)的長度並由長度大約為70個核苷酸的較長內源髮夾轉錄物(稱為前體-miRNAs或 pre-miRNAs)加工而來。對於lin_4 RNA的情況，已顯示miRNAs通過在miRNA和它的靶 mRNA之間形成互補鹼基對的機制來調節蛋白表達。該過程引起蛋白翻譯的抑制，並且，根 據miRNA與它的靶位點之間序列互補的程度，引起mRNA轉錄物的降解(綜述參見，例如， Bartel，2009)。改變的miRNA表達已顯示出導致人類疾病，特別是癌症，這是基於與正常組織相 比，惡性腫瘤和腫瘤細胞系顯示失調的miRNA表達概況的發現(綜述參見，例如，Sassen等 人，2008)。即，在人類癌症中已觀察到miRNA水平的總體降低，這表明小調節RNAs可能在 腫瘤抑制中具有內在功能。Lu等人000 通過在334種人類癌症、癌症細胞系和正常組 織中分析總計217種人類和小鼠miRNAs，首次顯示與相應正常組織相比，許多miRNAs的 表達水平在癌症中顯著降低。這些作者發現癌症伴隨顯著降低的總體miRNA表達，並且與 分化較高的腫瘤相比，分化較差的腫瘤顯示較低miRNA水平。另一項最近的研究檢測了 241種人類miRNAs在人類癌症細胞系的綜合組(comprehensive panel)、NCI-60組，和正常組 織中的表達，並且證實了與相應正常組織相比，大部分miRNAs在源自人類腫瘤的細胞系中 以較低水平表達的發現(Gaur等人，2007)。直到最近，關於在癌症中觀察到的改變的miRNA表達是惡性轉化的原因還是結果 仍有不確定性。在2007年，Kumar等人的研究首次證實了 miRNA表達的普遍降低確實促進 了腫瘤發生。這些作者通過在細胞系中擊倒(knockdown)miRNA-加工酶Drosha和Dicer總 體降低了成熟miRNAs的產生。因此，小鼠和人類癌症細胞顯示降低的穩態miRNA水平。這 些具有總體miRNA損失的細胞在體外顯示增強的細胞生長(Kumar等人，2007)。由於在腫 瘤中存在miRNAs的總體減量調節，miRNA概況可反映腫瘤的起源和分化狀態。因此，miRNA 表達概況的分析將很快發展成癌症診斷的重要工具，對個體中miRNA水平的可靠檢測和 定量方法的應用將成為在這方面最具相關性的先決條件。RNA分子的檢測和定量，包括小調節RNAs例如miRNAs的檢測，可原則上通過多種 標準方法進行，包括基於標準核酸雜交的技術例如Northern雜交、RNA酶保護、引物延伸或 微陣列雜交。但是，這些方法不適用於日常實驗室常規應用，原因在於它們依賴於放射性標 記試劑的使用和/或成本過高。實時PCR技術已發展成用於前體和成熟miRNAs的定量(參見，例如，Schmittgen 等人，2008)。原則上，常規應用兩種方法用於小RNA分子的擴增和檢測，包括成熟miRNAs 的檢測。一種方法基於特異性莖-環RT-引物，其含有通用PCR引物，該引物與miRNA-特 異性PCR引物組合用於擴增。在該系統中(參見，例如，Applied Biosystems TaqMan MicroRNA Assay, Applied Biosystems，USA)，通過水解探針檢測靶成熟 miRNAs。第二種 方法利用通用PCR引物(連接到特異性RT-引物)和LNA(鎖定核酸，Locked Nucleic Acid) 引物進行擴增並利用SybrGreen⑧進行靶miRNAs的檢測(參見，例如，miRCURY LNA TM Univeral RT microRNA PCR，Exiqon，Denmark)。但是，通過這些方法很難在一個樣品中區 分miRNA的成熟形式和前體形式。因此，始終存在對於檢測小RNA分子的改進方法的需要。

發明內容
在本發明的上下文中，令人驚訝地發現通過包括利用可降解的3'-不可延伸的寡 核苷酸(下文也稱為「輔助寡核苷酸」(「helper oligo」))的方法可檢測可變長度的RNA 分子，包括小調節RNA分子。本發明的方法特別適合於檢測一個樣品中的多於一個RNA分 子種類，特別是當這些RNA分子源自一個前體分子時。因此，本發明的方法特別適合於檢測 和區分小調節RNAs的成熟形式和前體形式，包括，例如，miRNAs的成熟形式和前體形式的 檢測和定量。因此，第一方面，本發明提供檢測RNA分子的方法，所述方法包括以下步驟
a)提供含有所述RNA分子的樣品；
b)將包含第一引物結合位點的第一多核苷酸與所述RNA分子雜交；
c)通過逆轉錄所述RNA分子的序列延伸所述第一多核苷酸以產生第一鏈cDNA；
d)將第二多核苷酸與所述第一鏈cDNA雜交，其中所述第二多核苷酸是3'-不可延伸 的寡核苷酸，其包含(i) 3'-部分，其與所述第一鏈cDNA的一部分互補，以及
( ) 5'-突出端，其包含第二引物結合位點的序列；
並且其中所述第二多核苷酸包含至少一個或幾個dU核苷酸殘基；
e)在不存在dUTP的情況下，延伸所述第一鏈cDNA以產生延伸反應產物，所述延伸反 應產物包含與所述第二引物結合位點互補的序列；以及通過優選不耐熱的尿嘧啶DNA糖基 化酶(UNG)的酶促反應消化所述第二多核苷酸；
f)在檢測部分存在的情況下，使用與所述第一引物結合位點互補的第一引物和與所 述第二引物結合位點互補的第二引物，通過聚合酶鏈式反應擴增所述延伸反應產物；以及
g)通過實時螢光讀出而檢測擴增產物。根據本發明的方法的原理分別圖示於圖1和圖2。詳細地，在第一反應步驟中，將 第一多核苷酸(本文還命名為RT_(逆轉錄)_引物)與待測的RNA分子雜交。這種第一多 核苷酸被設計為與待測RNA分子的一部分互補，並且進一步包含第一引物結合位點，即第 一引物可特異性結合的序列。一旦所述第一多核苷酸與RNA分子退火，通過逆轉錄酶的酶 促反應延伸所述第一多核苷酸，使靶RNA分子的序列以3'到5'方向被逆轉錄。因此，產生 與待測RNA分子的序列互補的cDNA分子。而且，該cDNA分子的長度對應於待測RNA分子 的長度。在隨後的反應步驟中，第二多核苷酸與之前已通過逆轉錄產生的cDNA雜交。這 種第二多核苷酸被設計為(i)與所述cDNA的一部分互補，(ii)進一步包含5'-突出端，其 具有第二引物結合位點，即第二引物可特異性結合的序列，以及(iii)是3'-不可延伸的。 第二多核苷酸與它的靶序列退火後，通過逆轉錄第二多核苷酸的序列，所述cDNA進一步以 5 『-到3 『方向延伸，從而產生DNA延伸反應產物，所述DNA延伸反應產物具有包含與第二弓I 物結合位點互補的序列的5'-部分。通過將第二多核苷酸設計成3'-不可延伸的，在第二 反應步驟中，第二多核苷酸的延伸被阻止。第二多核苷酸被設計成可降解的多核苷酸，然後 它可例如通過酶切割被降解。然後，在分別與第一和第二引物結合位點互補的第一和第二 引物存在的情況下，以及在檢測部分存在的情況下，通過聚合酶鏈式反應進行延伸反應產 物的擴增。在本發明的方法應用於平行檢測兩種不同RNA分子的情況下，當使用兩種可區 分的檢測部分時，可在一個反應設置(one reaction setup)中擴增兩種延伸反應產物。而 且，如果待測RNA分子具有不同大小，可檢測到具有不同長度的不同的延伸反應產物。如本發明的上下文所用，特徵「提供樣品」通常是指適於製備含有RNA分子或RNA 分子群體的組合物的所有種類的程序。這些程序包括但不限於適於製備細胞或組織提取物 的標準生化和/或細胞生物學程序，其細胞和/或組織可源自含有感興趣RNA分子的任何 種類的生物。例如，根據本發明的樣品可以是源自生長在細胞培養物中的一個細胞或多個 細胞或通過解剖和/或手術從生物體得到的純化的總RNA和/或大小分級分離的總RNA。具 體地，根據本發明的樣品可以是從一個或多個患者的一個或多個組織中得到的總RNA。從細 胞、細胞提取物或組織中製備總RNA可包括一個或多個生化純化步驟，例如，舉例來說，離 心和/或分級分離，通過機械或化學破裂步驟包括例如多次冷凍和/或融化循環、一次或多 次鹽處理和/或苯酚-氯仿提取進行的細胞裂解。任選地，根據本發明，提供樣品還可包括 通過聚乙二醇和鹽存在下的沉澱和/或變性聚丙烯醯胺凝膠電泳的方法來去除大的RNA， 例如豐富的核糖體rRNA。從細胞和/或組織純化總RNA的方法是本領域普通技術人員熟知 的，並且包括例如標準程序，例如利用硫氰酸胍-酸性苯酚-氯仿提取(例如TRIzolInvitrogen, USA)。而且，根據本發明的樣品可進一步包含一種或多種合成的RNA分子或由 一種或多種合成的RNA分子組成，所述合成的RNA分子可作為用於定量的內標。根據本發 明的樣品的實例包含例如血液、肺、肝臟或從個體得到的任何其他組織和/或活檢樣品。如本文所用，術語「多核苷酸」通常是指具有可變長度和序列的核苷酸分子，其能 夠通過互補鹼基配對結合RNA或DNA靶分子。根據本發明的多核苷酸通常是指包含至少 10個、優選至少20個以及更優選至少30個核苷酸的分子。對本領域普通技術人員顯而 易見的是本發明的多核苷酸具有適當的長度來提供所需要的特異性。一般而言，多核苷酸 可以是DNA寡核苷酸或RNA寡核苷酸，優選DNA寡核苷酸。因此，多核苷酸包含由核鹼基 (nucleobase)(即含氮鹼基)，可以是核糖、2:脫氧核糖或其任何衍生物的五碳糖，以及磷 酸基團組成的所有種類的結構。核鹼基和糖組成稱為核苷的單位。磷酸基團可與糖的2、3 或5位碳，特別是與糖的3和5位碳形成鍵。核糖核苷酸含有核糖作為糖部分，而脫氧核糖 核苷酸含有脫氧核糖作為糖部分。核苷酸可含有嘌呤或嘧啶鹼基。本發明的多核苷酸可進 一步包含一個或多個修飾的核苷酸和/或一個或多個主鏈修飾，例如，舉例來說，2' -0-甲 基 Q'-0Me)RNA、2'-氟(2'_F)、肽核酸(PNA)或鎖定核酸(LNA)。如本文所用，術語「引物」通常是指能夠由模板依賴的DNA聚合酶「引發」DNA合成 的寡聚化合物，或可選地，指上述這樣的多核苷酸。即，引物的3 』 -端通常包含游離的3 』 -OH 基團，其他核苷酸可通過3』到5』 -磷酸二酯鍵的形成連接到其上。本發明的引物可以是 長度至少大約10個，優選至少大約20個，以及更優選大約30個核苷酸。如本發明的上下 文所用，設計引物，以使它通過鹼基對互補特異性地退火和/或結合於它的指定的引物結 合位點。在本發明的上下文中，術語「引物」等同地意指「多核苷酸」。本發明的引物是例如 分別在實施例1和2的表1和表2中所示例的。如本文所指，「引物結合位點」意思是被設計為使得能夠進行互補引物或多核苷酸 的退火和/或雜交的一段核苷酸。在本發明的上下文中，引物結合位點可以由大約10至 20個或更多個核苷酸組成，並且可展現被認為適於與感興趣的引物分子建立互補鹼基配對 的任何序列。而且，引物結合位點可形成較長多核苷酸的部分，並且可因此位於5'-端附 近、3'-端附近或該多核苷酸的序列間的任何位置。具體地，在本發明的上下文中，第一引 物結合位點形成第一多核苷酸的部分，第二引物結合位點形成第二多核苷酸的部分。該第 一和第二引物結合位點可以是彼此相同的或彼此不同的。優選地，第一和第二引物結合位 點顯示不同的序列特異性。而且，引物結合位點優選地不表示待測RNA分子的序列。通用 引物結合位點例如，舉例來說，T7或T3最小引物位點的序列是本領域普通技術人員熟知 的，並且可例如從公共資料庫，包括NCBI基因庫(National Center for Biotechnology Information, Maryland, USA)中得至Ij。在根據本發明的方法的步驟b)中，包含第一引物結合位點的第一多核苷酸與待 測RNA分子雜交。該第一多核苷酸可以與靶RNA分子的內源序列互補，或者可選地，可以與 多核苷酸尾互補，RNA分子已在它的3'-端通過該多核苷酸尾進行延伸。該多核苷酸尾可 以是任意核苷酸段，並且優選是聚腺苷酸尾，即多個腺苷殘基的序列段。因此，在本發明的一個實施方式中，第一多核苷酸與待測RNA分子的內源序列互 補。在可選實施方式中，第一多核苷酸與特定序列互補，所述特定序列在進行步驟b)之前 已連接到RNA分子的3'-端。當使用與RNA分子的序列互補的第一多核苷酸時，即序列特異性的第一多核苷酸時(方法I的原理，參見圖1)，與RNA分子的序列互補的第一多核苷酸 的那些核苷酸應優選地不與步驟c)中使用的第二多核苷酸的序列重疊。而且，第一多核苷 酸的特異性可以通過在逆轉錄過程中，即步驟c)中，平行使用封閉第一引物結合位點序列 的dU-DNA寡核苷酸來進行提高。當使用與已連接到RNA分子3'-端的序列互補的第一多 核苷酸時(方法II的原理，參見圖幻，使用錨定的多核苷酸是優選的。在本發明的上下文 中，錨定的多核苷酸意思是在連接的多核苷酸尾序列之前攜帶對靶RNA分子具有特異性的 至少一個或多個核苷酸的多核苷酸。在該情況下，如果RNA不是聚腺苷酸化的mRNA，在逆轉 錄之前RNA分子的加尾是需要的。如本發明的上下文中所指，術語「與……互補」通常意思是通過互補鹼基配對，多 核苷酸特異性地結合感興趣的靶序列的能力。互補鹼基對在兩個彼此互補的核苷酸分子 (其可任選地包含修飾)之間形成。在本發明的上下文中，例如在第一多核苷酸和RNA靶 分子之間形成的互補鹼基對可包含所有種類的規範的或不規範的鹼基對，包括但不限於 Watson-Crick A-U, Wat son-Crick A-T, Wat son-Crick G-C, G-U Wobble 鹼基對、A-U 和 A-C 反向Hoogsteen鹼基對、或嘌呤-嘌呤和嘧啶-嘧啶鹼基對例如剪切的G-A鹼基對或G-A 亞氨基鹼基對。優選地，在本發明的上下文中，互補鹼基對是指規範的鹼基對。如本文所用，術語「雜交」通常意思是兩條互補鏈的退火。成功的雜交取決於多種 因素，包含溫度、鹽濃度和/或PH。雜交的最適溫度優選在低於Tm值5-15 °C的範圍內，其 中Tm值定義為雜交物的解鏈溫度(Tm)，即50 %的雙鏈核酸鏈分離時的溫度。計算Tm值的 各種公式是本領域普通技術人員已知的。在本發明的上下文中，有益於雜交的條件可包括 使用緩衝液，所述緩衝液含有試劑以使雙鏈體的形成最大化並抑制多核苷酸非特異性結合 它的靶分子。如果需要，可將多核苷酸的終濃度對每個反應進行最優化。有益於雜交的條 件還包括使多核苷酸與靶分子溫育足夠長的時間以進行最優退火。優選地，根據本發明的 雜交是指多核苷酸與靶分子在溶液中溫育的雜交條件。本發明的雜交條件例如在實施例1 和實施例2的方法I和方法II中說明。而且，有利的是在聚合酶反應過程中，例如在第一 鏈cDNA合成以及在輔助寡核苷酸雜交後的延伸過程中，使溫度條件最優化。這種最優化是 本領域普通技術人員易於進行的。如本文通常所用，術語「 3 『-不可延伸的寡核苷酸」意思是由核糖核苷酸、脫氧核苷 酸或二者組成的，但在3'-末端不含有反應性、即游離的3'-0Η基團的多核苷酸。在缺乏反 應性3'-0Η基團的情況下，通過酶促添加另外的核苷酸，在5'-到3'-方向上的寡核苷酸的 延伸和/或延長被抑制。優選地，根據本發明的3『-不可延伸的寡核苷酸在它的3'-端含有 磷酸基團。在本發明的上下文中，術語「多核苷酸」和「寡核苷酸」等同使用。而且，本發明 的3'-不可延伸的寡核苷酸的特徵在於它包含與它的靶序列具有序列互補性的3'-部分， 同時具有包含第二引物結合位點序列的5'-部分。但是，該5'-部分不能與靶序列退火，從 而產生5'-突出端。在本發明的上下文中，術語「5'-突出端」是本領域普通技術人員熟知 的，並在圖1和圖2中被進一步說明。如本文所用，術語「擴增」是指合成與模板核酸(例如，第一鏈cDNA和/或根據本 發明的方法的步驟e)中產生的延伸反應產物)的一條或兩條鏈互補的核酸分子的過程。擴 增核酸分子通常包括使模板核酸變性，在低於引物解鏈溫度的溫度下使引物與模板核酸退 火，以及酶促地從引物延伸以產生擴增產物。變性、退火和延伸步驟的每個可以進行一次。但是，通常地，變性、退火和延伸步驟進行多次以使擴增產物的數量增加，雖然指數擴增不 是本方法要求的，但經常指數增加。擴增通常需要脫氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶(例如 Taq聚合酶)以及為達到聚合酶最佳活性的適當的緩衝液和/或輔因子(例如，MgCl2和/ 或KCl)的存在。本發明的擴增條件例如在實施例1第6和7部分中描述。如本發明的上下文所用，術語「聚合酶鏈式反應」或「PCR」通常意思是特異性擴增 模板分子的任何測定或方法。聚合酶鏈式反應是本領域普通技術人員已知的標準方法， 其中模板分子是核酸模板。在本發明的上下文中，模板分子可以是DNA或RNA分子，優選的 是通過引物延伸和逆轉錄從RNA分子產生的cDNA分子。模板核酸不是必須要求純化的；它 可以是以僅少量存在的，例如，舉例來說，僅以低豐度表達的RNA分子。為了通過聚合酶鏈 式反應擴增延伸反應產物，在誘導引物延伸的反應條件下，將引物與其它PCR試劑組合。例 如,鏈延伸反應物通常包含 50 mM KClUO mM Tris-HCl (pH 8. 3)、1.5 mM MgCl2、最多 1.0 Pg變性的模板DNA、50皮摩爾每種寡核苷酸引物、2. 5 U Taq聚合酶以及10 % DMSO。反應 通常含有150-320 μΜ的dATP、dCTP、dTTP、dGTP或其一種或多種類似物。在某些情況下， 在反應中，可用300-640 μΜ dUTP替代dTTP。在本發明的上下文中，聚合酶鏈式反應在第一 和第二引物存在的情況下以及在檢測部分存在的情況下進行。根據本發明的聚合酶鏈式反 應的實驗條件例如在實施例1中描述。在聚合酶鏈式反應的過程中，新合成的鏈形成雙鏈分子，所述雙鏈分子可用於反 應的後續步驟。鏈分離、退火和延伸步驟可根據需要經常重複進行以產生與靶核酸分子相 應的所期望數量的擴增產物。反應中的限速因素是反應中存在的引物、耐熱酶和核苷三磷 酸的量。擴增步驟和雜交步驟優選地重複至少一次。為了在檢測中使用，擴增和雜交步 驟的數量將取決於例如樣品的性質。如果樣品僅包含靶核酸的幾個拷貝，可能需要更多的 擴增和雜交步驟來擴增足以用於檢測的靶序列。通常地，擴增和雜交步驟重複至少大約15 次，但可以重複多達至少20、30或甚至40次。耐熱聚合酶是指熱穩定的聚合酶，即，當置於 升高的溫度下持續實現雙鏈模板核酸變性所必需的時間時，該酶不會不可逆地變性。通常 地，合成在各個引物的3』端啟動，並以5』到3』方向沿模板鏈進行。耐熱聚合酶已從黃棲 ^MiJhermus /Varas)、紅棲熱菌(7 rw力er)、嗜熱棲熱菌(7 iAer oMi^ )、水生棲熱 菌(7 a卯aiicm)、乳棲熱菌(7 ^^(￡^5)、紅色棲熱菌(7 rMe/^)、嗜熱脂肪芽孢桿菌 {Bacillus stearo thermophilus )和熾熱甲燒嗜熱菌(ifethano thermus fervidus )中分離。 雖然如此，不耐熱聚合酶也可在PCR中應用，只要酶是可被補充的。任選地，在本發明的上 下文中，聚合酶鏈式反應可以在尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)存在的情況下進行。在本發明的上下文中，術語「檢測」通常意思是顯現、分析和/或定量本發明的 擴增產物。具體地，術語「檢測」是指本領域已知的適用於通過螢光讀出，優選通過實時 RT-PCR檢測擴增產物的任何方法。術語「實時螢光讀出」通常意思是本領域已知的適於實時，即在擴增的過程中，顯 現、檢測、分析和/或定量本發明的擴增產物的所有種類的成像方法。具體地，實時螢光讀 出是指實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR，也稱為定量實時聚合酶鏈式反應，即Q-PCR/qPCR)， 其是基於聚合酶鏈式反應的方法並適於擴增和同時定量靶DNA分子。RT-PCR能夠對DNA樣 品中的一個或多個特定的序列既進行檢測又進行定量(當被歸一化(mormalized)到DNA 輸入或另外的歸一化基因時，其為拷貝的絕對數量或相對量)。在實時PCR或RT-PCR中，在PCR反應的每個循環中測量螢光，而螢光的量與PCR產物的量成比例。一般而言，在實時 PCR中檢測產物的兩種常用方法是(1)嵌入任何雙鏈DNA的非特異性螢光染料，以及⑵ 用螢光報導分子部分標記的序列特異性DNA探針，其允許僅在探針與它的互補DNA靶雜交 後進行檢測。優選地，根據本發明的實時螢光讀出包括，但不限於，使用Lightcycler 系 統(Roche，Germany)進行的擴增產物的實時成像。實時PCR和/或RT-PCR的原理是本領 域普通技術人員熟知的，並在例如 「Critical Factors for Successful Real-Time PCR Qiagen, Germany中描述。實時螢光讀出得到的結果在本發明的上下文中顯示並進一步在 圖3至圖5中示例。如本文所用，術語「檢測部分」通常是指可摻入DNA，或可選地可附著和/或連接 到多核苷酸，以及可通過螢光測量用於顯現和/或定量感興趣的擴增產物的任何物質或試 劑。根據本發明的檢測部分可以是嵌入染料，例如，舉例來說SyberGreen ，或非嵌入部 分，例如螢光團。SyberGreen藝結合所有的雙鏈DNA分子並且一旦結合就發出具有確定波 長的螢光信號。嵌入染料的使用使得能夠進行許多不同靶的分析，而不需要合成靶特異性 標記的探針。但是，由於非特異性RNA產物和引物-二聚體也導致螢光信號，所以當使用嵌 入染料例如SyberGreen⑧時，需要高PCR特異性。螢光團包括但不限於螢光素染料、羅丹 明染料或花菁染料。螢光標記可從不同供應商包括例如hvitrogenTM (USA)購得。本發明的方法可適用於檢測可變長度的RNA分子。但是，在本發明的上下文中，已 發現本文所述的方法特別適於檢測小RNA分子。因此，在優選實施方式中，RNA分子具有15-200個核苷酸，優選20-100個核苷酸 的長度。S卩，在本發明的上下文中，待測RNA分子可具有10-250個核苷酸，或15-200個核 苷酸，或40-120個核苷酸的長度，或優選20-100個核苷酸的長度。但是，對本領域普通技 術人員顯而易見的是為了獲得不同範圍，以上的上限和下限也可以進行組合。因此，RNA分 子也可具有15-120、或40-100、或80-250個核苷酸的長度。而且，本發明含有的樣品可含 有具有可變長度的RNA分子群體。即，在本發明的上下文中提供的樣品可包含具有相同長 度的RNA分子，或可包含具有不同長度的RNA分子，其包括但不限於感興趣RNA分子的前體 形式和成熟形式。優選地，在本發明的上下文中提供的樣品包含具有可區分長度的RNA分 子，例如，舉例來說，RNA分子的前體形式和成熟形式。這些的實例包括但不限於前體miRNA 和成熟miRNA，其可在大約50-100個核苷酸的長度上變化。在進一步優選的實施方式中，RNA分子選自成熟miRNA (miRNA)、前體 miRNA (pre-miRNA)、初級 miRNA 前體(pri-miRNA)、小幹擾 RNA (siRNA)、piwi-相互作用 RNA (piRNA)、前體 piRNA 和短髮夾 RNA (shRNA)。在本發明的上下文中等同使用的術語「成熟miRNA」、「miRNA」或「微RNA」通常是 指在細胞中表達的具有短長度的RNA分子。具體地，術語「miRNA」是指從長度為大約70個 核苷酸的內源髮夾形前體分子產生的長度為大約20-25個核苷酸的單鏈RNA。編碼miRNAs 的基因分別在人類、動物、植物和病毒的基因組中發現。編碼基因的miRNA比加工的成熟miRNA分子長得多。S卩，miRNAs在細胞核中首先 被轉錄為具有帽和聚腺苷酸尾的初級轉錄物(也稱為「初級miRNA前體」)，並被加工為稱為「前體-miRNA」 (pre-miRNA)的短的70個核苷酸的莖-環結構。該加工由稱為微處理機 複合體(Microprocessor complex)的蛋白複合體在動物中進行，所述蛋白複合體由核酸酶 Drosha和雙鏈RNA結合蛋白Pasha組成。然後，這些pre-miRNAs在細胞質中通過與內切核 酸酶Dicer的相互作用被加工為成熟miRNAs，所述內切核酸酶Dicer還起始RNA-誘導的沉 默複合體(RISC)的形成。該複合體負責由於miRNA表達和RNA幹擾而觀察到的基因沉默。術語「小幹擾RNA」或「siRNAs」通常意思是這樣的RNA分子，其在將dsRNA分子外 源遞送到細胞後，在長dsRNA的轉基因表達後產生，或通過基因轉移、細胞轉染或細胞轉導 被引入細胞，或在細胞中內源地表達。術語「siRNA」還指短的調節RNA分子，其參與RNA幹 擾和基因沉默，優選地引起靶RNA轉錄物的降解。小幹擾RNA可以是單鏈RNA或可以是由 兩條分開的RNA鏈，即有義和反義鏈組成的雙鏈RNA。小幹擾RNAs的長度通常為20-25個 核苷酸。術語「piwi-相互作用RNA」或「piRNA」通常是指在種系發育過程中，特別是在精 子發生過程中被功能性地連接用於沉默轉座子並保持基因組完整性的RNA分子。Piwi-相 互作用RNAs通過與Piwi蛋白的相互作用形成RNA-蛋白複合體的部分，並且在大小上不 同於miRNAs，這是因為它們優選具有沈-31個核苷酸的長度。如本文所用，術語「piRNA」 還包含調節性小RNAs的亞類，稱為「重複相關小幹擾RNA」 ("Repeat asociated small interfering RNA」)或 「rasiRNA」。RasiRNA 既與 Ago 蛋白亞族又與 Piwi Argonaute 蛋白 亞族締合，而piRNA僅與Piwi Argonaute亞族締合。在種系中，rasiRNA參與建立和維持 異染色質結構，控制重複序列中出現的轉錄物以及沉默轉座子和逆轉座子。RasiRNA在它的 大小上也有所不同。與長度為21-23個核苷酸的miRNAs、長度為20-25個核苷酸的siRNAs 以及長度為M-31個核苷酸的PiRNAs不同，rasiRNAs的長度為M-四個核苷酸，這取決於 來源的生物。不同亞類的miRNA、siRNA和piRNA也可通過它們的生物合成方式來區分，因 為miRNA需要酶Dicer-I用於它的產生，siRNA需要酶Dicer_2，而rasiRNA不需要這二者。術語「短髮夾RNA」或「shRNA」通常是指具有莖-環髮夾結構的短RNA分子。短髮 夾RNA也可以是源自內源模板的莖-環RNA結構，所述內源模板包括但不限於基因編碼載 體或質粒。具體地，短髮夾RNA意思是可形成緊的髮夾轉角並可用於沉默基因表達的RNA 分子。在本發明的第一方面的優選實施方式中，步驟a)的RNA分子在3'-末端通過多核 苷酸尾延伸，這優選地通過聚腺苷酸聚合酶、末端轉移酶或連接酶的酶促反應，更優選地通 過聚腺苷酸聚合酶的酶促反應來進行。如本文所用，術語「多核苷酸尾」通常是指在RNA分子3'-端的一段核苷酸。根據 本發明的多核苷酸尾可以具有可變長度，優選地包含大約20-200個核苷酸。根據本發明的 多核苷酸尾可以由任何種類的核苷酸組成，如果認為適當，也可包含任何種類的修飾的核 苷酸。在本發明的上下文中，設計多核苷酸尾，以使在合適的條件下引物或多核苷酸可與其 雜交。如果由聚腺苷酸聚合酶的酶促反應產生，本發明的多核苷酸尾優選由腺苷殘基組成。在本發明的上下文中，「聚腺苷酸聚合酶」通常意思是以不依賴序列的方式催化腺 苷添加到RNA分子3'-端的酶。具體地，本發明的聚腺苷酸聚合酶意思是具有酶分類號EC 2. 7. 7. 19的多核苷酸腺苷醯轉移酶或類似酶。術語「末端轉移酶」通常是指催化核苷酸添加到DNA分子3』 -末端的酶，優選地，如在本發明的上下文中，是指催化核苷酸添加到RNA分子3』 -末端的酶。本發明的末端轉 移酶優選地將核苷酸添加到突出的3』端，但還以較低效率將核苷酸添加到DNA片段平端和 3』 -凹端。如本文所用，術語「連接酶」意思是通過在雙鏈體DNA中的單鏈斷裂位點處催化形 成磷酸二酯形成而形成新的化學鍵從而可催化兩個大分子連接的酶。本發明的連接酶優 選地被分類為EC 6. 5. 1. 1並也可作用於RNA底物。在另一優選實施方式中，本發明的方法的特徵在於第一多核苷酸與RNA分子的序 列互補、與多核苷酸尾互補，或與二者均互補。如上詳述，在本方法的步驟b)中與RNA分子雜交的第一多核苷酸可以是與靶核酸 互補的序列特異性多核苷酸，或者與多核苷酸尾互補的多核苷酸，當聚腺苷酸聚合酶用於 3』延伸時，所述多核苷酸尾是聚腺苷酸尾。當使用與多核苷酸尾具有序列互補性的多核苷 酸時，使用寡-dT多核苷酸是優選的。寡-dT多核苷酸意思是由脫氧胸苷殘基組成的多核 苷酸。在本發明的上下文中，進一步令人驚訝的發現是可降解的多核苷酸(也稱為「輔 助寡核苷酸」)可用於當需要將某種序列添加和/或延伸到DNA分子的一條鏈或兩條鏈時 的任何應用。使用可降解的多核苷酸是連接反應或使用帶尾的PCR引物的替代方案，並且 具有擴增和檢測與可降解的多核苷酸雜交的準確原始序列的優勢。因此，在還另一個優選實施方式中，本發明的方法的特徵在於第二多核苷酸是可 降解的多核苷酸。第二多核苷酸是可降解的多核苷酸，其被設計，以使其可被尿嘧啶-DNA-糖基化 酶(UNG)特異性地消化。尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)催化尿嘧啶和糖之間的N-糖苷鍵 (N-glycosylic bond)的水解，在含有尿嘧啶的單鏈或雙鏈DNA中留下脫嘧啶位點。因此， 為了能被尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)消化，本發明的可降解的多核苷酸應包含脫氧尿嘧 啶(dU)核苷酸殘基。在防止PCR攜帶汙染的情況下，在尿嘧啶-DNA-糖基化酶存在的情況下，dU_核苷 殘基向多核苷酸中的摻入，包括它們的酶促消化，是本領域普通技術人員的公知常識，並且 在例如美國專利號5，035, 996,5, 683，896和5，945，313中描述。在本發明的上下文中，第二多核苷酸包含dU-核苷酸殘基並因此可在步驟e)後通 過尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)的酶促反應被消化。這具有第二多核苷酸不抑制隨後擴增 反應的優勢。具體地，通過不耐熱的尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)的處理進行的多核苷酸(即 「輔助寡核苷酸」)的降解可以是PCR反應的一部分(例如當UNG被包含在PCR酶混合物中 時)。如果之後的PCR確實摻入dUTP，使用的UNG必須是不耐熱的。優選地，可降解的多核苷酸的5』部分包含第二引物結合位點的序列，3』部分包含 靶RNA分子5』部分的特異性序列。例如，可降解的多核苷酸的該序列特異性部分可被設計 為僅適合靶RNA分子的成熟形式或前體形式或兩種形式。可選地，本發明的可降解的多核 苷酸也可以由RNA核苷酸組成。在進一步優選的實施方式中，本發明的方法的特徵在於第二多核苷酸具有3'-末 端磷酸形式的封閉的3'-末端。
如上詳述，3'-末端磷酸基團有效地阻斷多核苷酸的任何酶促延伸，即在聚合酶 鏈式反應過程中另外的核苷酸的連接。第二多核苷酸的封閉的3'-末端也可以通過本領域 普通技術人員已知的任何其他合適的修飾來得到。封閉的3'-末端的實施方式在本方法的 上下文中具有特別的優勢。在優選實施方式中，本發明的方法的特徵在於步驟f)中的檢測部分是嵌入染料。如本文所用，術語「嵌入染料」通常意思是結合雙鏈DNA的任何染料。具體地，本 發明的嵌入染料是結合雙鏈DNA但不結合單鏈DNA，並且一旦該染料結合雙鏈DNA，它的熒 光會增加，其實例包含，例如，可購得的染料例如SybrGreen (Invitrogen, USA)。根據本 發明的嵌入染料在PCR中結合所有雙鏈DNA，引起染料的螢光。因此，在PCR過程中DNA產 物的增加引起螢光強度的增加，並在每個循環測量，從而使得DNA濃度被定量。但是，dsDNA 染料例如SybrGreen 將結合所有dsDNA PCR產物，也包含非特異性PCR產物例如，舉例來 說，「引物二聚體」。這可能潛在地幹擾或阻止預期的靶序列的準確定量。一般而言，PCR反 應如通常製備，其具有螢光嵌入染料的添加。反應在循環變溫器中運行，在每個循環後，用 檢測器測量螢光水平；染料僅在結合dsDNA (S卩，PCR產物)時才發出螢光。參考標準稀釋 物，可測定PCR中的dsDNA濃度。與其他實時PCR方法類似，如此得到的值不具有與它相關 的絕對單位(即mRNA拷貝/細胞)。測量的DNA/RNA樣品與標準稀釋物的比較將只提供 樣品相對於標準的分數或比值，僅得到不同組織或實驗條件之間的相對比較。為了確保定 量的準確度，通常必要的是將靶基因的表達歸一化到穩定表達的基因。這可以校正跨實驗 樣品的RNA數量或質量的可能差異。在另一優選實施方式中，本發明的方法的特徵在於步驟f)中的檢測部分是水解 探針。如本文所用，術語「水解探針」通常是指可以被酶促水解的寡核苷酸。具體地，在 本發明的上下文中，「水解探針」是指在PCR反應過程中可以被Taq DNA聚合酶的5'-到3' 外切核酸酶活性水解的寡核苷酸。更優選地，本發明的「水解探針」意思是TaqMan 探針， 即攜帶螢光團和猝滅劑部分的序列特異性寡核苷酸，其中螢光團和猝滅劑部分連接到寡核 苷酸上以使螢光團(即螢光報導分子或螢光標記)與猝滅劑的鄰近性防止報導分子發出熒 光。在定量實時PCR分析中使用TaqMan⑧探針是本領域普通技術人員已知的熟知方法，並 且例如在實施例1中示例。一般而言，設計TaqMan⑩探針，以使螢光團連接在寡核苷酸探 針的5'-端或接近寡核苷酸探針的5'-端，而猝滅劑定位在3'-端或接近3'-端。在多核 苷酸鏈式反應(PCR)的組合的退火/延伸階段中，探針被Taq DNA聚合酶的5'-到3'外切 核酸酶活性切割，從而將螢光團和猝滅劑部分分開，結果是螢光報導分子可發出螢光信號， 然後該螢光信號可被測量。可檢測的螢光與積累的PCR產物的量成比例。在本發明的上下文中，連接於水解探針的螢光團(即螢光報導分子或螢光標記) 可以選自但不限於螢光素染料的基團，所述螢光素染料例如羧基螢光素(FAM)、6_羧 基-4'，5'-二氯-2'7'-二甲氧基螢光素(JOE)、螢光素異硫氰酸酯(FITC)、四氯螢光素 (TET)或5』 -六氯-螢光素-CE亞磷醯胺(HEX)；羅丹明染料例如，舉例來說，羧基_X_羅 丹明(ROX)、Texas Red和四甲基羅丹明(TAMRA)，花菁染料例如吡喃 花菁染料，DYM8、
Quasar 570、或染料例如Cy3、Cy5、Alexa 568等等。螢光標記的選擇通常由它的光譜性質和成像設備的可獲得性來決定。定量測定中螢光標記的使用是本領域普通技術人員熟知的 標準方法，螢光團可從幾個供應商，包括例如Invitrogen USA購得。猝滅劑通常是指吸收從供體分子(即螢光報導分子)轉移的能量的分子。艮口， 供體分子將能量轉移到猝滅劑，供體返回到基態並產生猝滅劑的激發態。螢光猝滅還取決 於供體和受體分子之間的距離。直到近幾年，猝滅劑通常是螢光染料，例如，螢光素作為報 道分子以及羅丹明作為猝滅劑(FAM/TAMRA探針)。最熟知的猝滅劑之一是TAMRA(四甲 基-羅丹明)，其用於降低報導染料的發射。由於TAMRA的性質，它適於作為FAM (羧基熒 光素)、HEX (六氯螢光素)、TET (四氯-螢光素)、J0E (5』-二氯-二甲氧基-螢光素) 和Cy3-染料(花菁)的猝滅劑。可選地，根據本發明的「猝滅劑」可以是非螢光(稱為暗) 猝滅劑，其通常能夠多路進行(multiplexing)。在本發明的上下文中可應用的暗猝滅劑包 括但不限於試劑，例如，舉例來說，猝滅380-530 nm範圍的染料的DABCYL二甲 基氨基)-苯基]-偶氮]-苯甲酸)，在530 nm具有最大吸收值並有效猝滅520-670 nm光 譜的Eclipse 猝滅劑(4-[[2-氯-4-硝基-苯基]-偶氮]-苯胺，Epoch Biosciences, Inc. Corporation Delaware 21720,23rd Drive NE, Suite 150, Bothell Washington 98021，USA的商標)，或Black Hole猝滅劑，例如BHQ-I ([ (4-(2-硝基-4-甲基-苯 基)-偶氮)-基-((2-甲氧基-5-甲基-苯基)-偶氮)]-苯胺)和BHQ-2 硝 基-苯基)-偶氮)-基-((2，5_ 二甲氧基-苯基)_偶氮)]_苯胺)(均可獲自Biosearch Technologies, he.)，其能夠猝滅整個可見光譜。為了降低背景螢光並以這種方式來改進 靈敏度，這些非螢光受體經常用作螢光受體的替代物。在本發明的上下文中，水解探針用於檢測擴增產物的存在或缺乏。如上詳述，該技 術利用用一個螢光部分和一個猝滅部分標記的單鏈雜交探針。在PCR(聚合酶鏈式反應)的 退火步驟中，標記的水解探針結合靶DNA(即，擴增產物)並在隨後的延伸階段中，被Taq聚 合酶的5』到3』外切核酸酶活性降解。結果，激發的螢光部分和猝滅部分在空間上彼此分 離。結果，當沒有猝滅劑處於非常接近的位置時，一旦螢光團激發，就可檢測到螢光發射。例 如，ABI PRISM7700序列檢測系統(Applied Biotechnology Institute, Inc. Corporation Iowa, Building 36, Cal Poly State University San Luis Obispo, California 93407, USA的商標)利用水解探針技術。使用ΑΒΓ PRISM 7700系統進行PCR擴增和檢測的信息 可見於 http //www, appliedbiosystems. com/products.
根據本發明的水解探針以及它們在本發明的方法中的用途例如分別在實施例1和2中 描述。本發明的方法已進一步成功地應用於在一個反應設置中檢測多餘一種RNA分子。 即，在優選實施方式中，應用本發明的方法，以使平行檢測至少兩種不同RNA分子。在該設 置中，RNA分子可以具有不同長度或具有不同的特性或二者均不同。但是，作為在一個反應 中平行檢測至少兩種RNA分子的先決條件，延伸反應產物的擴增應在檢測部分存在的情況 下進行，其中檢測部分不是嵌入染料。優選地，為了在一個反應中檢測至少兩種不同RNA分 子，在步驟f)中相應延伸反應產物的擴增應在序列特異性水解探針存在的情況下進行。因此，在優選實施方式中，本發明的方法的特徵在於在步驟f)中擴增至少兩種不 同的延伸反應產物。如上詳述，術語「延伸反應產物」是指本方法的步驟e)中產生的分子。即，「延伸反應產物」是與作為步驟f)中擴增模板的RNA分子的序列相對應的分子。更優選地，本發明的方法的特徵在於步驟f)中的擴增在至少兩種水解探針存在 的情況下進行，其中至少一種所述水解探針對特定種類的RNA分子具有特異性，以及其中 所述探針包含不同組的供體/受體部分。如上詳述，用作為螢光報導分子或螢光標記的螢光團標記每個水解探針。因此，在 本發明的上下文中，所述螢光團/螢光報導分子/螢光標記理解為「供體部分」。而且，每個 水解探針另外用猝滅劑標記。在本發明的上下文中，該猝滅劑，也可以是螢光團，通常理解 為「受體部分」。合適的供體和受體部分是本領域已知，本領域普通技術人員能夠選擇供體和相應 受體分子的合適的組合。如本文關於供體和相應的受體螢光部分所用，「相應的」是指受體 螢光部分具有與供體螢光部分的激發光譜重疊的發射光譜。但是，兩個信號應可互相分離。 因此，受體螢光部分的發射光譜的最大波長優選應比供體螢光部分的激發光譜的最大波長 大至少30 nm,更優選至少50 nm例如至少80 nm,至少100 nm或至少140 nm。根據本發明的優選的供體螢光部分是螢光標記，其包括但不限於例如螢光染料， 例如螢光素染料、羅丹明染料、花菁染料和香豆素染料。例如，供體螢光部分可以是螢光 素，而受體螢光部分可以選自 LC-Red 610、LC-Red 640、LC-Red 670、LC-Red 705、Cy5 禾口 Cy5. 5，優選LC-Red 610或LC-Red 640。更優選地，供體螢光部分是螢光素並且受體螢光部 分是LC-Red 640或LC-Red 610。供體和受體螢光部分可以通過接頭連接到適當的水解探 針。每個接頭的長度可以是重要的，因為接頭將影響供體和受體螢光部分之間的距離。用 於本發明目的的接頭臂的長度是從核苷酸鹼基到螢光部分以埃(Angstroms)表示的距離。可選地，受體部分可以是猝滅劑，優選暗猝滅劑。在本發明的上下文中，羧基螢光素(FAM)作為供體螢光部分和BHQ-2硝 基-苯基)-偶氮)-基-((2，5-二甲氧基-苯基)-偶氮)]-苯胺)作為受體部分的組合 已發現特別適用於本方法。5』 -六氯-螢光素-CE-亞磷醯胺(HEX)作為供體螢光部分和 BHQ-2 ([(4-(1-硝基-苯基)-偶氮)-基-((2，5-二甲氧基-苯基)-偶氮)]-苯胺)作 為受體部分(即暗猝滅劑)的組合也特別適用於本方法。因此，供體/受體部分的優選組合是羧基螢光素(FAM)和BHQ-2硝 基-苯基)-偶氮)-基-((2，5-二甲氧基-苯基)-偶氮)]-苯胺)，以及5』-六氯-螢光 素-CE亞磷醯胺(HEX)和BHQ-2 ([ (4-(1-硝基-苯基)-偶氮)-基-((2，5-二甲氧基-苯 基)_偶氮)]_苯胺)。在本發明的上下文中，進一步已發現當使用不同供體/受體部分標記的水解探針 時，可以在一個反應中檢測源自相同種類的不同長度的RNA分子。S卩，本發明的方法可以應用於檢測兩種不同種類的RNA分子，其中所述兩種不同 種類的RNA分子源自一種前體分子。在那種情況下，本發明的方法可以應用於通過雙色檢 測和定量在一個單獨的反應中檢測和擴增這兩種RNA分子。該情形的實例包括但不限於 檢測成熟miRNA(miRNA)與前體miRNA (pre_miRNA)。具體地，在此，多核苷酸和/或引物的 設計在成熟通道中引起成熟加前體信號的檢測，原因在於成熟探針也結合前體中的成熟序 列。前體通道僅檢測前體信號。對本領域普通技術人員顯而易見的是第一和第二多核苷酸的不同設計將影響區分檢測成熟miRNA和前體miRNA的可能性。如果對於不同miRNA形式，即成熟和前體miRNA， 第一和第二多核苷酸是相同的，那麼第一探針可被設計用於檢測前體和成熟miRNA，而第二 探針可被設計為僅檢測前體形式。檢測具有不同長度並源自一種前體分子的兩種RNA分子 例如在圖5中示例。可選地，可設計前體特異性第一多核苷酸以及成熟miRNA特異性寡核 苷酸。然後，第一探針可被設計用於檢測成熟miRNA，第二探針可被設計用於僅檢測前體形 式。因此，在優選實施方式中，RNA分子的特定種類源自一種前體分子，優選地其中 RNA分子具有不同長度。在本發明的上下文中，已發現第一和第二多核苷酸的設計決定檢測RNA種類的兩 種形式(例如成熟和前體miRNA)還是僅檢測一種形式。即，靶miRNA的前體形式也可通過 產生該靶miRNA的較小擴增子(例如與成熟形式相同的大小)的內部PCR引物來擴增和檢 測。在這種情況下，水解探針必須被設計為適合在第一和第二多核苷酸之間。然後，前體形 式不能在兩個通道中都被檢測到，而僅在前體通道中被檢測到。因此，成熟和前體的定量是 分開的。在這種情況下，不需要由可降解的多核苷酸進行的前體形式的延伸。然而，對於前 體miRNA的擴增，使用前體特異性第一多核苷酸和第二前體特異性多核苷酸。因此，在另一優選實施方式中，本發明的方法的特徵在於通過不同擴增產物的檢 測，優選地通過具有可區分的螢光讀出的不同擴增產物的檢測來確定不同種類RNA分子之 間的比例。對本領域普通技術人員顯而易見的是不同擴增產物的檢測應包含使用具有不同 供體/受體部分的不同水解探針，其可產生可區分的螢光信號。用於確定不同種類的RNA 分子之間比例的典型反應包含不同擴增產物的相對定量。相對定量確定靶RNA分子與內源 參照分子的量之間的比例，所述內源參照分子通常是合適的管家基因。然後，該歸一化的值 可用於比較例如不同樣品中的差異基因表達。可選地，相對定量可以通過依賴於Ct值的直接比較的比較Δ ACt方法來進行。Ct 值是閾值循環並且是指擴增圖跨過閾值的循環，即，在此處存在螢光的顯著可檢測的增加。 通常地，CT用作計算每個樣品中起始模板量的工具。ACt值描述了靶基因的Ct值和相應內 源參照基因的Ct值之間的差異。當應用比較Δ ACt方法時，標準曲線的製備僅需要確定在 初始實驗中靶和內源參照基因的擴增效率。用於相對定量的比較△ ACtS法是本領域已 知的標準方法並且例如在Livak和khmittgen，2001中詳述。另一方面，本發明提供試劑盒，其包含如本發明的上下文中所定義的第一和第二 多核苷酸、一組dNTPs、逆轉錄酶和檢測部分，優選包含對一種或多種不同RNA分子具有特 異性的一種或多種水解探針。在所述方面的優選實施方式中，試劑盒進一步包含(i)具有尿嘧啶-DNA-糖基化 酶(UNG)活性的酶，和/或(ii)如本發明的上下文中所定義的第一和/或第二引物。另一方面，本發明涉及根據本發明的試劑盒用於檢測RNA分子，優選用於檢測如 本發明的上下文中所定義的一種或多種RNA分子的用途。本發明的另一方面是檢測RNA分子的方法，所述方法包括以下步驟
a)提供含有所述RNA分子的樣品；
b)將包含第一引物結合位點的第一多核苷酸與所述RNA分子雜交；c)通過逆轉錄所述RNA分子的序列延伸所述第一多核苷酸以產生第一鏈cDNA；
d)將第二多核苷酸與所述第一鏈cDNA雜交，其特徵在於所述第二多核苷酸是3'-不 可延伸的寡核苷酸，其包含
(i) 3'-部分，其與所述第一鏈cDNA的一部分互補，以及 ( ) 5'-突出端，其包含第二引物結合位點的序列；
e)延伸所述第一鏈cDNA以產生延伸反應產物，所述延伸反應產物包含與所述第二引 物結合位點互補的序列；
f)在檢測部分存在的情況下，使用與所述第一引物結合位點互補的第一引物和與所 述第二引物結合位點互補的第二引物，通過聚合酶鏈式反應擴增所述延伸反應產物；以及
g)通過實時螢光讀出而檢測擴增產物。上述方法的特定方面是這樣的方法其中所述RNA分子具有15-200個核苷酸，優 選20-100個核苷酸的長度；或者
其中所述RNA分子選自成熟miRNA (miRNA)、前體miRNA (pre-miRNA)、初級miRNA前 體(pri-miRNA)、小幹擾 RNA(siRNA)、piRNA(piwi-相互作用 RNA)、前體 piRNA 和短髮夾 RNA(shRNA)；或者其中步驟a)的所述RNA分子在3'-末端通過多核苷酸尾延伸，該延伸優 選地通過聚腺苷酸聚合酶、末端轉移酶或連接酶的酶促反應，更優選地通過聚腺苷酸聚合 酶的酶促反應來進行；或者
其中所述第一多核苷酸與所述RNA分子的序列互補、與所述多核苷酸尾互補，或與二 者均互補；或者
其中所述第二多核苷酸是可降解的多核苷酸；或者
其中所述第二多核苷酸包含dU-核苷酸殘基並在步驟e)後通過尿嘧啶-DNA-糖基化 酶(UNG)的酶促反應被消化；或者
其中所述第二多核苷酸具有3'-末端磷酸形式的封閉的3'-末端；或者其中所述步驟 f)中的檢測部分是嵌入染料；或者
其中所述步驟f)中的檢測部分是水解探針；或者 其中在步驟f)中擴增至少兩種不同的延伸反應產物；或者
其中所述步驟f)中的擴增在至少兩種水解探針存在的情況下進行，其中至少一種所 述水解探針對特定種類的RNA分子具有特異性，並且其中所述探針包含不同組的供體/受 體部分；或者
其中所述特定種類的RNA分子源自一種前體分子，優選地所述特定種類的RNA分子具 有不同長度；或者
其中不同種類RNA分子之間的比例通過不同擴增產物的檢測，優選地通過具有可區分 的螢光讀出的不同擴增產物的檢測來確定。本發明的另一方面是試劑盒，其包含
-如前述權利要求任一項所定義的第一和第二多核苷酸， -一組 dNIPs， -逆轉錄酶，和
-檢測部分，優選對一種或多種不同RNA分子具有特異性的一種或多種水解探針。上述試劑盒的特定方面是這樣的試劑盒其進一步包含(i)具有尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)活性的酶，和/或(ii)如前述權利要求任一項所定義的第一和/或第二引 物。本發明的另一方面是上述試劑盒用於檢測RNA分子，優選用於檢測如上所定義的 一種或多種RNA分子的用途。以下附圖和實施例的意圖是說明本發明的各種實施方式。如此，其中所述的具體 修飾不能理解為對本發明範圍的限制。對本領域普通技術人員顯而易見的是可以進行各種 等同方案、變化和修飾而不偏離本發明範圍。因此，應理解的是這些等同方案被包含在本文 中。


圖1圖解了使用對靶RNA分子具有序列特異性的第一多核苷酸(包含第一引物結 合位點，此處命名為通用引物結合位點B = UPB)檢測成熟和前體miRNA的方法I的原理。 在PCR反應之前使用酶UNG將第二多核苷酸(dU輔助寡核苷酸，包含第二引物結合位點= 通用引物結合位點A，UPA)消化。通過使用第一和第二引物(即分別為UPA和UPB)來進 行延伸反應產物的PCR擴增。在兩種不同水解探針存在的情況下，進行兩種擴增產物的檢 測，所述兩種不同水解探針分別與成熟和前體第一鏈cDNA互補並用不同的供體/受體部分 (即 FAM/BHQ2 和 HEX/BHQ2)標記。圖2圖解了使用與成熟和前體miRNA的聚腺苷酸尾互補的第一多核苷酸和可降解 的第二多核苷酸(dU輔助寡核苷酸)檢測miRNA的方法II的原理。此處，靶RNA分子的 3'-端首先通過聚腺苷酸-聚合酶的酶促反應延伸，因而產生與第一多核苷酸雜交的聚腺 苷酸尾。隨後的步驟對應圖1所示的方法I的步驟。實時PCR擴增圖，其顯示47個擴增循環測量的FAM螢光的增加(圖3至圖6)。圖3顯示使用與成熟miR-21 RNA互補的序列特異性第一多核苷酸(方法I)通過 實時RT-PCR螢光讀出的方式檢測合成的miR-21 RNA寡核苷酸分子(50 fg)。圖4顯示使用與成熟miR-21 RNA互補的序列特異性第一多核苷酸(方法I)用於 逆轉錄，通過實時RT-PCR螢光讀出的方式從肺癌和正常組織檢測內源表達的miR-21 RNA0圖5顯示使用分別與miR-21 RNA的成熟和前體形式互補的序列特異性第一多核 苷酸用於逆轉錄，通過實時RT-PCR螢光讀出的方式(方法I)同時檢測成熟和前體miR-21 RNA (用合成的寡核苷酸作為原料(input material))。圖6顯示使用與聚腺苷酸尾互補的第一多核苷酸(方法II)用於逆轉錄，通過實 時RT-PCR螢光讀出的方式同時檢測成熟和前體miR-21 RNA(用合成的寡核苷酸作為原 料)。
具體實施方式
實施例實施例1
方法I
用特異性RT-引物(第一多核苷酸)和用於第一鏈cDNA延伸的dU DNA輔助寡核苷酸(第二多核苷酸)檢測miRNA。逆轉錄
1. miRNA和RT-引物變件將4. 5 μ 含有miRNA和60 nM (在10 μ RT反應物中的 終濃度)特異性RT-引物的溶液在65°C變性10 min，然後立刻冷卻到4 °C或置於冰上。2. 添加用於逆轉錄的反應成分.-4. 5 μ 變性的miRNA/RT引物+ 2 μ 5x RT緩 衝液 + 0, 25 μ RNA 酶抑制劑 + 1 μ dNTP 混合物 + 0, 25 μ RT 酶 + 2 μ PCR 級水=10 M-I RT 反應物(參見 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit, Roche, Germany 的包裝插頁)
3.逆轉錄沾"C5 min逆轉錄，85 "C 5 min滅活RT酶，4 "C冷卻
4.添加dUDNA多核苷酸和另外的RTgS:+ 1 μ 60 nM dU DNA寡核苷酸+ 0, 5 μ 1:4 稀釋的 RT 酶(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit, Roche, Germany)
5.第一鏈cDNA的延伸55"C 5 min逆轉錄，85 "C 5 min滅活RT酶，4 °〇冷卻或儲 存在_20°C
dU DNA多核苷酸降解、擴增和檢測
6.dU DNA多核苷酸降解和隨後的PCR反應1 μ 來自逆轉錄的cDNA + 1 χ Taqman RNA AMP Kit RNA 混合物 + 0，5 μΜ 通用 PCR 引物 A + 0, 5 μΜ 通用 PCR 引物 B + 0, 2 μΜ mi21 成熟探針 + 2，8 mM MgAc (20 μ PCR 反應)
7.LC480 PCR循環儀(Roche Diamostics GmbH, Germany)上的PCR 程序 反應體積20 μ ；檢測形式雙色水解探針；
擴增循環47，95 "C 15 s,60 V 25 s ；冷卻 40 V 30 min 表1 多核苷酸序列 實施例Ia
使用成熟特異性RT-引物進行逆轉錄以及可降解的dU DNA寡核苷酸進行cDNA延伸，檢測50 fg成熟miR-21，其為合成的寡核苷酸。結果顯示於圖3。在逆轉錄中使用成 熟特異性RT-引物並使用可降解的dU DNA寡核苷酸進行cDNA延伸，可以檢測成熟miR-21， 其為合成的多核苷酸。實施例Ib
使用成熟特異性RT-弓丨物進行逆轉錄以及可降解的dU DNA寡核苷酸進行cDNA延伸，檢 測從K562細胞系分離的miRNA中的成熟miR-21。結論在逆轉錄中使用成熟特異件RT-引 物並使用可降解的dU-DNA寡核苷酸進行cDNA延伸，可以檢測來自K562細胞系的miRNA中 的成熟miR-21。實施例Ic
使用成熟特異性RT-引物進行逆轉錄以及可降解的dU DNA寡核苷酸進行cDNA延伸， 檢測從肺癌/正常組織FFPET材料分離的miRNA中的成熟miR-21。結果顯示於圖4。結論: 在逆轉錄中使用成熟特異性RT-引物並使用可降解的dU DNA寡核苷酸進行cDNA延伸，可 以檢測從肺癌/正常組織FFPET材料分離的miRNA中的成熟miR-21。實施例Id
使用前體特異性RT-引物進行逆轉錄以及可降解的dU DNA寡核苷酸進行cDNA延伸， 檢測前體miR-21 (原料合成的寡核糖核苷酸)。_ 在逆轉錄中使用前體特異性RT-引 物並使用可降解的dU DNA寡核苷酸進行cDNA延伸可以檢測以合成的寡核糖核苷酸形式 提供的前體miR-21。實施例Ie
使用成熟和前體特異性RT-引物進行逆轉錄以及可降解的dU DNA寡核苷酸進行cDNA 延伸，同時檢測成熟和前體miR-21 (原料合成的寡核苷酸)。結果顯示於圖5。結論在 逆轉錄中使用成熟和前體特異性RT-引物以及使用可降解的dU DNA寡核苷酸進行cDNA延 伸，可在同一反應中檢測成熟和前體miR-21。在成熟miR-21的背景中檢測前體，當最低至 1%前體時仍是可能的。實施例2 方法II
使用(錨定的)寡-dT RT-引物(第一多核苷酸)以及用於第一鏈CDNA延伸的dU DNA輔助寡核苷酸(第二多核苷酸)檢測miRNA。聚腺苷酸加尾和miRNA分離
1.聚腺苷酸加尾..根據Poly (A) Tailing Kit (Ambion Inc.，Austin，TX，USA)的包 裝插頁
2.聚腺苷酸化的miRNA 遊分惠.·根據 Hi曲 Pure miRNA Isolation Kit (Roche DiagnosticsGmbH,Germany)的包裝插頁中用於分離含有小RNA的總RNA的1-柱方案。僅 有變化為如推薦的，使用等量的緩衝液BB和BE用於使用細胞/組織裂解液進行分離。逆轉錄
3.miRNA和RT-引物變性/將4. 5 μ 含有miRNA和200 nM (在10 μ RT反應體 積中的終濃度)錨定的寡-dT RT-引物的溶液在65°C變性10 min，然後立刻冷卻到4 °〇或 置於冰上。4.添加用於逆轉錄的反應成分/4. 5 μ 變性的miRNA/RT引物+ 2 μ 5χRT 緩衝液 + 0. 25 μ RNA 酶抑制劑 + 1 μ dNTP 混合物 + 0. 25 μ RT 酶 + 2 μ PCR 級水=10 μ RT 反應物(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit, Roche DiagnosticsGmbH, Germany 的包裝插頁)。5.逆轉錄和第一鏈DNA的延伸55 "C 5 min逆轉錄,-85 "C 5 min滅活RT酶, 55 "C 12 min逆轉錄，到達55 °C後立即添加+ μ 100 nM dU DNA寡核苷酸+ 0，5 μ 1:4 ##白勺 RT Sl (Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit, Roche) ；85 。C 5 min滅活RT酶；4 V冷卻或儲存在_20°C。dU DNA寡核苷酸降解，擴增和檢測
6. dU DNA寡核苷酸降解和隨後的PCR反應.· μ 來自逆轉錄的cDNA + 1 χ Taqman RNA AMP Kit RNA 混合物 + 0. 5 μΜ 通用 PCR 引物 A + 0. 5 μΜ 通用 PCR 引物 B + 0. 2 μΜ mi21 成熟探針 + 2. 8 mM MgAc (20 μ PCR 反應)。7. LC480 PCR循環儀(Roche Diamostics GmbH, Germany)上的PCR 程序
反應體積20 μ ；檢測形式雙色水解探針；擴增循環47，95 V 15 s,60 °C 25 s ； 冷卻 40 "C 30 min。
表2:多核苷酸序列
權利要求
1.檢測RNA分子的方法，所述方法包括以下步驟a)提供含有所述RNA分子的樣品；b)將包含第一引物結合位點的第一多核苷酸與所述RNA分子雜交；c)通過逆轉錄所述RNA分子的序列延伸所述第一多核苷酸以產生第一鏈cDNA；d)將第二多核苷酸與所述第一鏈cDNA雜交，其中所述第二多核苷酸是3'-不可延伸 的寡核苷酸，其包含(i) 3'-部分，其與所述第一鏈cDNA的一部分互補，以及( ) 5'-突出端，其包含第二引物結合位點的序列；並且其中所述第二多核苷酸包含至少一個或幾個dU核苷酸殘基；e)在不存在dUTP的情況下，延伸所述第一鏈cDNA以產生延伸反應產物，所述延伸反 應產物包含與所述第二引物結合位點互補的序列；以及通過優選不耐熱的尿嘧啶DNA糖基 化酶(UNG)的酶促反應消化所述第二多核苷酸；f)在檢測部分存在的情況下，使用與所述第一引物結合位點互補的第一引物和與所 述第二引物結合位點互補的第二引物，通過聚合酶鏈式反應擴增所述延伸反應產物；以及g)通過實時螢光讀出而檢測所述擴增產物。
2.權利要求1的方法，其特徵在於所述RNA分子具有15-200個核苷酸，優選20-100個核苷酸的長度。
3.權利要求1或2的方法，其特徵在於所述RNA分子選自成熟miRNA(miRNA)、前體 miRNA(pre-miRNA)、初級 miRNA 前體(pri-miRNA)、小幹擾 RNA(siRNA)、piRNA(piwi-相互 作用RNA)、前體piRNA和短髮夾RNA(shRNA)。
4.權利要求1至3任一項的方法，其特徵在於步驟a)的所述RNA分子在3'-末端通過 多核苷酸尾延伸，該延伸優選通過聚腺苷酸聚合酶、末端轉移酶或連接酶的酶促反應，更優 選通過聚腺苷酸聚合酶的酶促反應來進行。
5.權利要求1至4任一項的方法，其特徵在於所述第一多核苷酸與所述RNA分子的序 列互補、與所述多核苷酸尾互補，或與二者均互補。
6.權利要求1至5任一項的方法，其特徵在於所述第二多核苷酸具有3'-末端磷酸形 式的封閉的3'-末端。
7.權利要求1至6任一項的方法，其特徵在於步驟f)中的所述檢測部分是嵌入染料。
8.權利要求1至7任一項的方法，其特徵在於步驟f)中的所述檢測部分是水解探針。
9.權利要求8的方法，其特徵在於在步驟f)中擴增至少兩種不同的延伸反應產物。
10.權利要求9的方法，其特徵在於所述步驟f)中的擴增在至少兩種水解探針存在的 情況下進行，其中至少一種所述水解探針對特定種類的RNA分子具有特異性，並且其中所 述探針包含不同組的供體/受體部分。
11.權利要求10的方法，其特徵在於所述特定種類的RNA分子源自一種前體分子，優選 地所述特定種類的RNA分子具有不同長度。
12.權利要求9至11任一項的方法，其特徵在於不同種類的RNA分子之間的比例通過 不同擴增產物的檢測，優選地通過具有可區分的螢光讀出的不同擴增產物的檢測來確定。
13.試劑盒，包含如前述權利要求任一項所定義的第一和第二多核苷酸，一組 dNIPs， 逆轉錄酶，以及檢測部分，優選對一種或多種不同RNA分子具有特異性的一種或多種水解探針， 具有尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)活性的酶， 以及任選地如前述權利要求任一項所定義的第一和/或第二引物。
14.根據權利要求13的試劑盒用於檢測RNA分子，優選用於檢測如權利要求2-3任一 項所定義的一種或多種RNA分子的用途。
全文摘要
本發明涉及檢測RNA分子的方法、試劑盒及其相關用途。第一方面，本發明涉及檢測RNA分子的方法，所述方法包括以下步驟提供含有所述RNA分子的樣品；將第一多核苷酸與所述RNA分子雜交；延伸所述第一多核苷酸以產生第一鏈cDNA；將第二多核苷酸與所述第一鏈cDNA雜交；延伸所述第一鏈cDNA以產生延伸反應產物；通過聚合酶鏈式反應擴增所述延伸反應產物；以及通過實時螢光讀出，檢測擴增產物。另一方面，本發明涉及試劑盒，所述試劑盒包含如本發明所定義的第一和第二多核苷酸、一組dNTPs、逆轉錄酶和檢測部分。另一方面，本發明涉及所述試劑盒用於檢測RNA分子的用途。
文檔編號C12Q1/68GK102102130SQ20101059397
公開日2011年6月22日 申請日期2010年12月17日 優先權日2009年12月18日
發明者阿爾伯斯 A., 海因德爾 D., 貝格曼 F., 弗羅納 S., 安肯鮑爾 W. 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司