來自加州海兔的DFP酶的製作方法

2023-12-01 12:08:11 2

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技術領域：
：本發明涉及具有有機磷水解酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及產生和使用所述多肽的方法。
背景技術：
：：本領域已知有機磷化合物。具體而言，已知一些戰爭藥劑(warfareagent)為有機磷化合物如沙林(Sarin)、環沙林(Cyclosarin)和梭曼/索曼(Soman)。其他有機磷化合物作為農藥為人所知。需要能夠使被上述有機磷化合物汙染的區域去汙染。已提出將具有有機磷水解酶活性如二異丙基氟磷酸酶(diisopropylfluorophosphatase)活性的多肽用於此目的，因為此種多肽能夠水解有害的有機磷化合物並由此將其轉化為有害性較低的產物。在WO99/43791中，公開了來自魷魚(LoligoVulgaris)的二異丙基氟磷酸酶，且亦描述了其用於去汙染的潛在用途以及其他應用。本發明的目的是提供具有有機磷水解酶例如二異丙基氟磷酸酶活性的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸，特別是具有高穩定性和/或高比活性的。發明概述本發明涉及具有有機磷水解酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組：(a)包含胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75％，更優選至少80％，甚至更優選至少85％，最優選至少90％，和甚至最優選至少95％的同一性；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中-高嚴格條件下與以下雜交：(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少65％，更優選至少70％，更優選至少75％，更優選至少80％，更優選至少85％，更優選至少90％，更優選至少95％，更優選至少96％，甚至更優選至少97％，最優選至少98％，且甚至最優選99％同一性的核苷酸序列；(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)胺基酸的變體。本發明還涉及編碼具有有機磷水解酶活性的多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸選自下組：(a)編碼包含胺基酸序列的多肽的多核苷酸，所述胺基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75％同一性；(b)多核苷酸，其在至少中嚴格條件下與以下雜交：(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈；(c)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少65％同一性的核苷酸序列；和(d)多核苷酸，其編碼SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)胺基酸的變體。本發明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、重組表達載體、重組宿主細胞，和產生具有有機磷水解酶活性的多肽的方法。本發明還涉及去汙染的方法，例如，通過降解有機磷化合物。具體而言，本發明涉及通過將本發明的有機磷水解酶施於經一種或多種有害的或不希望的有機磷化合物汙染的區域或裝置來對所述區域或裝置去汙染的方法。本發明還涉及包含編碼此種具有有機磷水解酶活性的多肽的分離的多核苷酸的植物。本發明還涉及產生此種具有有機磷水解酶活性的多肽的方法，包括：(a)在有助於產生該多肽的條件下培養包含編碼此種具有有機磷水解酶活性的多肽的多核苷酸的轉基因植物或植物細胞；和(b)回收所述多肽。具體地，本發明涉及如下各項：1.一種具有有機磷水解酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組：(a)包含胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75％，更優選至少80％，甚至更優選至少85％，最優選至少90％和甚至最優選至少95％的同一性；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中高嚴格條件下與以下雜交：(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少65％，更優選至少70％，更優選至少75％，更優選至少80％，更優選至少85％，更優選至少90％，更優選至少95％，更優選至少96％，甚至更優選至少97％，最優選至少98％，且甚至最優選99％同一性的核苷酸序列；(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)胺基酸的變體。2.項1的多肽，包含SEQIDNO:2的胺基酸序列或其具有有機磷水解酶活性的片段，或由SEQIDNO:2的胺基酸序列或其具有有機磷水解酶活性的片段組成。3.項2的多肽，包含SEQIDNO:2的成熟多肽，或由SEQIDNO:2的成熟多肽組成。4.項1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸序列或其編碼具有有機磷水解酶活性的片段的亞序列，或由SEQIDNO:1的核苷酸序列或其編碼具有有機磷水解酶活性的片段的亞序列組成。5.項4的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成。6.一種分離的多核苷酸，包含編碼項1-5中任一項的多肽的核苷酸序列。7.一種核酸構建體，其包含與一種或多種(幾種)調控序列可操作地連接的項6的多核苷酸，所述調控序列在表達宿主中指導所述多肽的產生。8.一種重組表達載體，其包含項7的核酸構建體。9.一種重組宿主細胞，其包含項7的核酸構建體或包含項8的表達載體。10.一種產生項1-5中任一項的多肽的方法，其包括：(a)在有助於產生多肽的條件下培養以其野生型形式產生所述多肽的細胞；和(b)回收所述多肽。11.一種產生項1-5中任一項的多肽的方法，其包括：(a)在有助於產生多肽的條件下培養包含核酸構建體的宿主細胞，所述核酸構建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列，和(b)回收所述多肽。12.一種產生蛋白質的方法，包括：(a)在有助於產生蛋白質的條件下培養項9的重組宿主細胞；和(b)回收所述蛋白質。13.一種包含項1-5中任一項的多肽的組合物。14.項13的組合物，其中所述組合物是微乳劑或洗劑。15.項1-5中任一項的多肽或項13或14的組合物用於對經至少一種有害的或不希望的有機磷化合物汙染的區域或裝置進行去汙染的用途，優選地，其中所述至少一種有害的或不希望的有機磷化合物選自G試劑、V試劑和農藥。16.通過添加項1-5中任一項的多肽或項13和14的組合物用於去除有機磷化合物的方法。附圖簡述圖1顯示了NN059104的限制圖。定義：術語「有機磷水解酶」在本文中定義為針對有機磷化合物，特別是有機磷化合物包括神經毒氣中的磷酐鍵(phosphorousanhydridebond)的水解活性。因此該術語包括具有水解酶和/或酯酶活性的酶，例如有機磷水解酶活性(EC3.1.8.1)(如有機磷酸酯酶活性)或有機磷酸酐水解酶(anhydrolase)(OPAA)活性，或羧酯酶活性，二異丙基氟磷酸酶(DFP酶)活性(EC3.1.8.2)，脫滷酶活性，氨醯基脯氨酸二肽酶(prolidase)活性和/或亞胺二肽酶活性。術語「DFP酶(EC3.1.8.2)」在本文中定義為二異丙基氟磷酸酶(diisopropylfluorophosphatase)、二烷基氟磷酸酶(dialkylfluorophosphatase)、氟磷酸二異丙酯水解酶(diisopropylphosphorofluoridatehydrolase)、二異丙基氟膦脫滷酶(diisopropylfluorophosphonatedehalogenase)、二異丙基磷酸氟化酶(diisopropylphosphofluoridase)、異丙基磷酸氟化酶(isopropylphosphorofluoridase)、有機磷酸脫水酶(organophosphateacidanhydrase)、有機磷酸酐水解酶(organophosphorousacidanhydrolase)、索曼酶(somanase)和塔崩酶(tabunase)。DFP酶作用於有機磷化合物(包括神經毒氣)中的磷酸酐鍵(如磷-滷化物和磷-氰化物)。本發明的多肽的活性如實施例3中「酶活性的測量」所述進行測量。本發明的多肽具有SEQIDNO:2的成熟多肽的有機磷水解酶活性的至少20％，優選至少40％，更優選至少50％，更優選至少60％，更優選至少70％，更優選至少80％，更優選至少90％，更優選至少95％，更優選至少100％，或甚至更優選高於100％如110％，或120％，或130％，或140％，或甚至更優選至少或高於150％。去汙染活性：本文中術語「去汙染活性」應理解為去除有害試劑如有機磷化合物例如神經毒氣、毒素、農藥，因此該術語包括例如解毒活性。分離的多肽：術語「分離的多肽」用於本文中指由來源分離的多肽。在一個優選的方面，多肽是如通過SDS-PAGE測定的，至少1％純，優選至少5％純，更優選至少10％純，更優選至少20％純，更優選至少40％純，更優選至少60％純，甚至更優選至少80％純，並且最優選至少90％純的多肽。基本上純的多肽：術語「基本上純的多肽」在本文表示多肽製備物，所述多肽製備物含有按重量計至多10％，優選至多8％，更優選至多6％，更優選至多5％，更優選至多4％，更優選至多3％，甚至更優選至多2％，最優選至多1％，並且甚至最優選至多0.5％的與其天然或重組結合的(associated)的其它多肽材料。因此，優選所述基本上純的多肽是按存在於製備物中的全部多肽材料的重量計至少92％純，優選至少94％純，更優選至少95％純，更優選至少96％純，更優選至少96％純，更優選至少97％純，更優選至少98％純，甚至更優選至少99％，最優選至少99.5％純，並且甚至最優選100％純。本發明的多肽優選是基本上純的形式，即，所述多肽製備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結合的其它多肽材料。例如，這能夠通過以下實現：通過公知的重組方法或由經典純化方法製備多肽。成熟多肽：術語「成熟多肽」在本文中定義為具有有機磷水解酶活性的多肽，所述多肽以其在翻譯和任何翻譯後修飾之後的最終形式存在，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。成熟多肽編碼序列：術語「成熟多肽編碼序列」在本文中定義為編碼具有有機磷水解酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。同一性：由參數「同一性」描述的兩個胺基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性。就本發明而言，兩個胺基酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟體包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,TrendsinGenetics16:276-277)的Needle程序，優選3.0.0版或更高版本中執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)來確定。使用的任選參數為缺口罰分(gappenalty)10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBLOSUM62取代矩陣(BLOSUM62的EMBOSS版)。使用Needle標記為「最高同一性(longestidentity)」(使用-nobrief選項獲得)的輸出結果作為百分比同一性，並計算如下：(相同的殘基×100)/(比對長度－比對中缺口的總數)就本發明而言，兩個核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS軟體包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,見上文)的Needle程序，優選3.0.0或更高版本中執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見上文)來測定。使用的任選參數為缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL取代矩陣(NCBINUC4.4的EMBOSS版)。使用Needle標記為「最高同一性」的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，並計算如下：(相同的脫氧核糖核苷酸×100)/(比對長度－比對中缺口的總數)同源序列：術語「同源序列」在本文中定義為預測的蛋白質，其在用本發明的加州海兔(Aplysiacalifornica)有機磷水解酶進行的tfasty搜索(Pearson,W.R.,1999,於BioinformaticsMethodsandProtocols,S.Misener和S.A.Krawetz編,pp.185-219)中給出小於0.001的E值(或期望分數)。多肽片段：術語「多肽片段」在本文中定義為從SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)胺基酸的多肽；其中所述片段具有有機磷水解酶活性。亞序列：術語「亞序列(subsequence)」在本文中定義為從SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的5』和/或3』端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亞序列編碼具有有機磷水解酶活性的多肽片段。等位變體(allelicvariant)：術語「等位變體」在本文中表示佔據相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發生，並且可導致種群內的多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的胺基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸：術語「分離的多核苷酸」用於本文中指從來源分離的多核苷酸。在一個優選的方面，多核苷酸是如通過瓊脂糖電泳測定的，至少1％純，優選5％純，更優選至少10％純，更優選至少20％純，更優選至少40％純，更優選至少60％純，甚至更優選至少80％純，並且最優選至少90％純的多核苷酸。基本上純的多核苷酸：術語「基本上純的多核苷酸」用於本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸製備物，並且所述多核苷酸製備物處於適合於在遺傳工程的蛋白質生產體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10％，優選至多8％，更優選至多6％，更優選至多5％，更優選至多4％，更優選至多3％，甚至更優選至多2％，最優選至多1％，並且甚至最優選至多0.5％的與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可包括天然存在的5』和3』非翻譯區，如啟動子和終止子。優選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90％純，優選至少92％純，更優選至少94％純，更優選至少95％純，更優選至少96％純，更優選至少97％純，甚至更優選至少98％純，最優選至少99％，並且甚至最優選至少99.5％純的。本發明所述多核苷酸優選為基本上純的形式，即，所述多核苷酸製備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列：當用於本文時術語「編碼序列」的意思是直接指定其蛋白產物的胺基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，並且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成或重組核苷酸序列。DNA：術語「DNA」如用於本文中指所有DNA，因此所述DNA可為合成、基因組或cDNA，在本文中定義為能夠通過反轉錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子製備的DNA分子。cDNA缺少通常存在於相應基因組DNA中的內含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然後作為成熟的已剪接的mRNA出現。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內含子序列。核酸構建體：術語「核酸構建體」用於本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或將所述核酸分子以本來不存在於(nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區段，或所述核酸是合成的。當所述核酸構建體含有表達本發明的編碼序列所需的調控序列時，術語核酸構建體與術語「表達盒」同義。調控序列(controlsequence)：術語「調控序列」在本文定義為包括對編碼本發明多肽的多核苷酸表達是必需的所有成分。各個調控序列對於編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個調控序列對於彼此可以是天然的或外源的。這些調控序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以和用於引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區的連接。可操作地連接：術語「可操作地連接」在本文表示這樣的構型，其中將調控序列置於相對於多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調控序列指導多肽編碼序列的表達。表達：術語「表達」包括涉及多肽產生的任何步驟，其包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。表達載體：術語「表達載體」在本文定義為線性的或環狀的DNA分子，其包含編碼本發明多肽的多核苷酸，並且所述多核苷酸與提供用於其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞：如本文中所使用的術語「宿主細胞」包括任何細胞類型，所述細胞類型對於使用包含本發明多核苷酸的核酸構建體或表達載體的轉化、轉染、轉導等是易感的(susceptible)。修飾：術語「修飾」在本文的意思是，對由SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列組成的多肽的任何化學修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(幾個)胺基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(幾個)胺基酸側鏈的置換。人工變體：當用在本文時，術語「人工變體」的意思是具有有機磷水解酶活性的多肽，所述多肽由表達SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的修飾的多核苷酸序列的生物體產生。所述修飾的核苷酸序列通過人為幹預(humanintervention)，通過修飾SEQIDNO:1中公開的多核苷酸序列或其同源序列來獲得。發明詳述具有有機磷水解酶活性的多肽本方面提供了具有水解酶活性，酯酶活性例如有機磷水解酶活性或有機磷酸酐水解酶(OPAA)活性或優選二異丙基氟磷酸酶(DFP酶)活性的新多肽。本發明進一步涉及這些多肽用於對毒素(toxin)、毒物(poison)如神經毒氣例如Vx或Gx型神經毒氣和農藥進行去汙染的用途。本發明的多肽具有至少一種酶活性，如V試劑或G試劑和/或農藥的水解，或去汙染。V試劑可包括VX(O-乙基-S-[2(二異丙基氨基)乙基]甲基硫代磷酸酯，或甲基磷硫代酸)，VE(O-乙基-S-[2-(二乙基氨基)乙基]乙基硫代磷酸酯)，VG(O,O-二乙基-S-[2-(二乙基氨基)乙基]硫代磷酸酯)，VM(O-乙基-S-[2-(二乙基氨基)乙基]甲基硫代磷酸酯)，VR(磷硫代酸)SovietV-氣(RussianVX)，四異(O,O-二異丙基S-(2-二異丙基氨基乙基)硫代磷酸酯)。G試劑可包括塔崩(GA)，沙林(甲基磷氟酸(methylphosphonofluoridicacid))(GB)，索曼(GD)，環沙林(GF)或其組合。農藥可包括殺真菌劑、殺蟲劑、除草劑和殺嚙齒類劑。所述農藥可為內吸磷-S(Demeton-S)、內吸磷-S-甲基(Demeton-S-methyl)、碸吸磷(Demeton-S-methylsulphon)、甲基內吸磷(Demeton-methyl)、對硫磷(Parathion)、亞胺硫磷(Phosmet)、三硫磷(Carbophenothion)、苯噁磷(Benoxafos)、谷硫磷(Azinphos-methyl)、益棉磷(Azinphos-ethyl)、胺吸磷(Amiton)、賽硫磷(Amidithion)、果蟲磷(Cyanthoate)、Dialiphos、樂果(Dimethoate)、敵磷(Dioxathion)、乙拌磷(Disulfoton)、因毒磷(Endothion)、Etion、益硫磷(Ethoate-methyl)、安硫磷(Formothion)、馬拉硫磷(Malathion)、Mercarbam、氧樂果(Omethoate)、異碸磷(Oxydeprofos)、碸拌磷(Oxydisulfoton)、芬硫磷(Phenkapton)、甲拌磷(Phorate)、伏殺硫磷(Phosalone)、乙噻唑磷(Prothidathion)、發硫磷(Prothoate)、蘇硫磷(Sophamide)、甲基乙拌磷(Thiometon)、蚜滅磷(Vamidothion)和甲胺磷(Methamidophos)。在一個方面，本發明的多肽的酶活性包括有機磷水解酶活性。因此在第一個方面，本發明涉及包含胺基酸序列的分離的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有優選至少75％，更優選至少80％，更優選至少85％，甚至更優選至少90％，最優選至少95％，且甚至最優選至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性程度，所述多肽具有有機磷水解酶活性(下文中的「同源多肽」)。在一個優選的方面，本發明的多肽的酶活性包括二異丙基氟磷酸酶(DFP酶)活性。因此在另一個方面，本發明涉及包含胺基酸序列的分離的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有優選至少75％，更優選至少80％，更優選至少85％，甚至更優選至少90％，最優選至少95％，且甚至最優選至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性程度，所述多肽具有二異丙基氟磷酸酶(DFP酶)活性。在一個優選的方面，所述同源多肽具有胺基酸序列，其與SEQIDNO:2的成熟多肽相差十個胺基酸，優選相差五個胺基酸，更優選相差四個胺基酸，甚至更優選相差三個胺基酸，最優選相差兩個胺基酸，並且甚至最優選相差一個胺基酸。本發明的多肽優選包含SEQIDNO:2的胺基酸序列或其等位變體；或它們的具有有機磷水解酶活性的片段。在一個優選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸序列。在另一個優選方面，多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽。在另一個優選方面，多肽由SEQIDNO:2的胺基酸序列或其等位變體；或它們的具有酯酶活性的片段組成。在另一個優選方面，多肽由SEQIDNO:2的胺基酸序列組成。在另一個優選方面，多肽由SEQIDNO:2的成熟多肽組成。在第二個方面，本發明涉及具有有機磷水解酶活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優選非常低嚴格條件下，更優選低嚴格條件下，更優選中嚴格條件下，更優選中-高嚴格條件下，甚至更優選高嚴格條件下，並且最優選非常高嚴格條件下，與以下雜交：(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長互補鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個連續的核苷酸或優選至少200個連續的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有有機磷水解酶活性的多肽片段。在一個優選的方面，所述互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。SEQIDNO:1的核苷酸序列或其亞序列，以及SEQIDNO:2的胺基酸序列或其片段，可用於設計核酸探針，以根據本領域內公知的方法從不同屬和種的菌株鑑定和克隆編碼具有有機磷水解酶活性的多肽的DNA。具體而言，根據標準的Southern印跡方法，可將這些探針用於與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑑定和從其中分離相應的基因。這些探針可明顯短於完整序列，但長度上應為至少14，優選至少25，更優選至少35，並且最優選至少70個核苷酸。然而，優選所述核酸探針是至少100個核苷酸長度。例如，所述核酸探針的長度可為至少200個核苷酸，優選至少300個核苷酸，更優選至少400個核苷酸，或最優選至少500個核苷酸。甚至可以使用更長的探針，例如，長度是優選至少600個核苷酸，更優選至少700個核苷酸，更優選至少800個核苷酸，或最優選至少900個核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標記以探測相應的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標記)。將這些探針涵蓋於本發明中。因而，可從由這些其它菌株製備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交並且編碼具有有機磷水解酶活性的多肽。可以通過瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠電泳，或通過其它分離技術分離來自這些其它菌株的基因組或其它DNA。可以將來自文庫的DNA或分離的DNA轉移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料並且固定於其上。為了鑑定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優選用在Sounthern印跡中。就本發明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴格條件下與標記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應於SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列；包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的DNA序列，其全長互補鏈；或它們的亞序列。可使用例如X射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個優選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在在另一個優選方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個優選方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一個優選方面，核酸探針是包含在質粒NN059104中的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列編碼具有有機磷水解酶活性的多肽。在另一個優選方面，核酸探針是包含在質粒NN059104中的成熟多肽編碼區。對於長度至少100個核苷酸的長探針，將非常低至非常高的嚴格條件定義為在42℃，在5XSSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切並且變性的鮭精DNA中，並且對於非常低和低嚴格性為25％的甲醯胺、對於中和中-高嚴格性為35％的甲醯胺、或對於高和非常高嚴格性為50％的甲醯胺，根據標準的Southern印跡法進行預雜交和雜交最佳12至24小時。對於長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2％SDS優選至少在55℃(中嚴格性)，更優選至少在60℃(中-高嚴格性)，甚至更優選至少在65℃(高嚴格性)，並且最優選至少在70℃(非常高嚴格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對於長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴格條件定義為在比根據Bolton和McCarthy計算法(1962,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)得出的Tm低大約5℃至大約10℃，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6，6mMEDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉(sodiummonobasicphosphate)，0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據標準的Southern印跡步驟進行預雜交、雜交和雜交後洗滌最佳12至24小時。對於長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將所述載體材料在6×SSC加0.1％SDS中洗滌一次15分鐘，並用6×SSC在比計算的Tm低5℃至10℃的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三方面，本發明涉及具有有機磷水解酶活性的分離的多肽，其由包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優選至少75％，更優選至少80％，優選至少85％，甚至更優選至少90％，且甚至最優選至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性程度，其編碼活性多肽。參見本文的多核苷酸部分。在第四方面，本發明涉及SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)胺基酸的人工變體。優選地，胺基酸改變對性質是較不重要的(ofaminornature)，即保守的胺基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質的摺疊和/或活性；通常為1至大約30個胺基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變淨電荷或其它功能來促進純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結合域(bindingdomain)。保守取代的實例是在以下組之內：鹼性胺基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性胺基酸組(穀氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸組(穀氨醯胺和天冬醯胺)、疏水胺基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族胺基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小胺基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的胺基酸取代是本領域已知的，並且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,於TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20個基本胺基酸，非基本胺基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的胺基酸殘基。有限數量的非保守胺基酸、不由遺傳密碼編碼的胺基酸和非天然胺基酸可以取代胺基酸殘基。「非天然胺基酸」在蛋白質合成後已經過修飾，和/或在它們的側鏈具有不同於基本胺基酸的化學結構。非天然胺基酸能夠以化學方法合成，並且優選是商業上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3,3-二甲基脯氨酸。或者，胺基酸改變具有這樣的性質以使多肽的物理化學性質改變。例如，胺基酸改變可改進多肽的熱穩定性，改變底物特異性，改變最適pH等。能夠根據本領域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區誘變法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來鑑定親本多肽中的必需胺基酸。在後一技術中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，並且測試所得突變分子的生物活性(即，有機磷水解酶活性)以鑑定對於所述分子的活性關鍵的胺基酸殘基。同樣參見Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結構的物理分析而測定，如通過以下這些技術：如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點胺基酸的突變來測定。參見例如deVos等,1992,Science255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBSLett.309:59-64。必需胺基酸的同一性也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據本發明的多肽相關。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然後是有關的篩選方法，例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625公開的那些方法來進行並測試單個或多個胺基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等,1991,Biochem.30:10832-10837；美國專利號5,223,409；WO92/06204)和區域定向的誘變(Derbyshire等,1986,Gene46:145；Ner等,1988,DNA7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等,1999,NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，並且使用本領域內標準方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個胺基酸殘基的重要性，並且能夠應用於未知結構的多肽。SEQIDNO:2的成熟多肽的胺基酸取代、缺失和/或插入的總數可為至少40，優選至少35，優選至少30，優選至少25，優選至少20，優選至少15，優選至少10，優選至少9，優選至少8，優選至少7，優選至少6，優選至少5，優選至少4，優選至少3，優選至少2或優選至少1。具有有機磷水解酶活性的多肽的來源本發明的多肽可以獲得自任何屬的海洋生物。就本發明而言，用於本文與給定的來源相連的術語「獲得自」，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產生。在一個優選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發明具有有機磷水解酶活性的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是具有有機磷水解酶活性的革蘭氏陽性細菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽；或具有有機磷水解酶活性的革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)多肽。在一個優選的方面，所述多肽是具有有機磷水解酶活性的嗜鹼芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個優選的方面，所述多肽是具有有機磷水解酶活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸瘟亞種(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多肽。在另一個優選的方面，所述多肽是具有有機磷水解酶活性的不產色鏈黴菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈黴菌(Streptomycesavermitilis)、天藍鏈黴菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈黴菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈黴菌(Streptomyceslividans)多肽。本發明具有有機磷水解酶活性的多肽也可以是真菌多肽，並且更優選具有有機磷水解酶活性的酵母多肽如念珠菌屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍黴屬(Yarrowia)多肽；或更優選具有有機磷水解酶活性的絲狀真菌多肽如枝頂孢黴屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、麴黴屬(Aspergillus)、短梗黴屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬蠟菌屬(Ceriporiopsis)、毛喙殼屬(Chaetomidium)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、赤黴屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質黴屬(Humicola)、耙齒菌屬(Irpex)、蘑菇屬(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌屬(Meripilus)、毛黴屬(Mucor)、毀絲黴屬(Myceliophthora)、新考瑪脂黴屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青黴屬(Paecilomyces)、青黴屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛黴屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸黴屬(Tolypocladium)、木黴屬(Trichoderma)、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽。在一個優選的方面，所述多肽是具有有機磷水解酶活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多肽。在另一個優選方面，所述多肽是具有有機磷水解酶活性的解纖維枝頂孢黴(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢麴黴(Aspergillusaculeatus)、泡盛麴黴(Aspergillusawamori)、煙麴黴(Aspergillusfumigatus)、臭麴黴(Aspergillusfoetidus)、日本麴黴(Aspergillusjaponicus)、構巢麴黴(Aspergillusnidulans)、黑麴黴(Aspergillusniger)、米麴黴(Aspergillusoryzae)、嗜角質金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、氈金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、杆孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、禾穀鐮孢(Fusariumcerealis)、庫威鐮孢(Fusariumcrookwellense)、大刀鐮孢(Fusariumculmorum)、禾本科鐮孢(Fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(Fusariumgraminum)、異孢鐮孢(Fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢(Fusariumnegundi)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、多枝鐮孢(Fusariumreticulatum)、粉紅鐮孢(Fusariumroseum)、接骨木鐮孢(Fusariumsambucinum)、膚色鐮孢(Fusariumsarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色鐮孢(Fusariumsulphureum)、圓鐮孢(Fusariumtorulosum)、擬絲孢鐮孢(Fusariumtrichothecioides)、鑲片鐮孢(Fusariumvenenatum)、灰腐質黴(Humicolagrisea)、特異腐質黴(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質黴(Humicolalanuginosa)、白耙齒菌(Irpexlacteus)、米黑毛黴(Mucormiehei)、嗜熱毀絲黴、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、繩狀青黴(Penicilliumfuniculosum)、產紫青黴(Penicilliumpurpurogenum)、黃孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、Thielaviaachromatica、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭孢殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小孢梭孢殼(Thielaviamicrospora)、卵孢梭孢殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana、瘤孢梭孢殼(Thielaviaspededonium)、毛梭孢殼(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、土生梭孢黴(Thielaviaterrestris)、哈茨木黴(Trichodermaharzianum)、康寧木黴(Trichodermakoningii)、長枝木黴(Trichodermalongibrachiatum)、裡氏木黴(Trichodermareesei)或綠色木黴(Trichodermaviride)多肽。在本發明的一個方面，所述多肽來自海洋動物如頭足類和軟體類。在一個優選的方面，所述多肽是加州海兔多肽。在一個更優選的方面，所述多肽是具有有機磷水解酶活性的加州海兔多肽。在一個最優選的方面，所述多肽是具有有機磷水解酶活性的加州海兔登錄號DSM22525多肽，例如包含SEQIDNO:2的成熟多肽的多肽，大腸桿菌NN059104。可理解的是對於前述的種，本發明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領域熟練技術人員將容易地識別適合的等同物的同一性。這些種的菌株在許多培養物保藏中心對於公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國典型培養物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農業研究機構專利培養物保藏中心北區研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)和NCIMB。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑑定和獲得這些多肽。用於從天然生境(habitat)分離微生物的技術是本領域內公知的。隨後可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領域普通技術人員熟知的技術將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等,1989,見上文)。本發明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)融合於本發明的核苷酸序列(或其部分)來產生融合的多肽。產生融合多肽的技術是本領域已知的，並包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，並且使融合多肽的表達在相同啟動子和終止子的控制下。融合多肽還可以包括切割位點。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點，從融合蛋白質釋放具有有機磷水解酶活性的多肽。切割位點的實例包括，但不限於，編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76；Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等,1995,Biotechnology13:498-503；和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381)；Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位點，其在精氨酸殘基後通過因子Xa蛋白酶切割(Eaton等,1986,Biochem.25:505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點，其在賴氨酸後通過腸激酶切割(Collins-Racie等,1995,Biotechnology13:982-987)；His-Tyr-Glu位點或His-Tyr-Asp位點，其通過GenenaseI切割(Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點，其在Arg後通過凝血酶切割(Stevens,2003,DrugDiscoveryWorld4:35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點，其在Gln後通過TEV蛋白酶切割(Stevens,2003,見上文)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點，其在Gln後通過基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens,2003,見上文)。多核苷酸本發明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發明具有有機磷水解酶活性的多肽的核苷酸序列，或由編碼本發明具有有機磷水解酶活性的多肽的核苷酸序列組成。在一個優選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1或由SEQIDNO:1組成。在另一個更優選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌Top10中所含質粒NN059104中含有的序列，或由大腸桿菌Top10中所含質粒NN059104中含有的序列組成。在另一個優選方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成。在另一個更優選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌Top10中所含質粒NN059104中含有的成熟多肽編碼序列或由大腸桿菌Top10中所含質粒NN059104中含有的成熟多肽編碼序列組成。本發明還涵蓋編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDNO:2的胺基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO:2的胺基酸序列或其成熟多肽組成；由於遺傳密碼的簡併性，所述核苷酸序列不同於SEQIDNO:1或其成熟多肽編碼序列。本發明還涉及SEQIDNO:1的亞序列，所述亞序列編碼具有有機磷水解酶活性的SEQIDNO:2的片段。本發明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個突變，或由具有至少一個突變的SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成，其中所述突變核苷酸序列編碼SEQIDNO:2的成熟多肽。用於分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術是本領域內已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA製備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結構特性的克隆DNA片段，從而實現從這種DNA克隆本發明的多核苷酸。參見，例如，Innis等,1990,PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴增方法，如連接酶鏈式反應(LCR)、連接活化轉錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基於核苷酸序列的擴增(NASBA)。可以從加州海兔，或其它或相關生物體克隆多核苷酸，並且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發明還涉及包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的分離的多核苷酸，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優選至少65％，更優選至少70％，更優選至少75％，更優選至少80％，更優選至少85％，甚至更優選至少90％，最優選至少95％，並且甚至最優選至少96％，至少97％，至少98％，或者至少99％同一性的同一性程度，其編碼具活性多肽。修飾編碼本發明多肽的核苷酸序列對於合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術語與所述多肽「基本上相似」指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同於從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩定性、最適pH等方面不同的人工變體。可以在作為SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構建變體序列：所述取代不產生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的胺基酸序列，但是符合意欲產生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產生不同的胺基酸序列。關於核苷酸取代的概述，參見，例如，Ford等,1991,ProteinExpressionandPurification2:95-107。對於本領域技術人員顯而易見的是，這些取代能夠在對於分子功能重要的區域之外進行，並且仍然產生活性多肽。對於由本發明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關鍵的並且因此優選不進行取代的胺基酸殘基，可以根據本領域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區誘變法(參見，例如，Cunningham和Wells,1989,見上文)來鑑定。在後一技術中，將突變引入到分子中的每個荷正電的殘基處，並且測試所得突變分子的有機磷水解酶活性，以鑑定對於所述分子的活性關鍵的胺基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能夠通過分析三維結構測定，通過如核磁共振分析、晶體學或光親和標記這樣的技術來測定(參見，例如，deVos等,1992,見上文；Smith等,1992,見上文；Wlodaver等,1992,見上文)。本發明還涉及編碼本發明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴格條件下，優選低嚴格條件，更優選中等嚴格條件，更優選中-高嚴格條件，甚至更優選高嚴格條件，並且最優選非常高的嚴格條件下，與以下序列雜交：(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等,1989,見上文)，如本文所定義的。在一個優選的方面，互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。本發明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸通過以下方法獲得：(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴格條件下，將DNA的群體與以下序列雜交：(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有有機磷水解酶活性的多肽。在一個優選的方面，互補鏈是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的全長互補鏈。核酸構建體本發明還涉及包含本發明的分離的多核苷酸的核酸構建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個(幾個)調控序列可操作地連接，所述調控序列在合適的宿主細胞中在與該調控序列相容的條件下指導編碼序列的表達。可用許多方式操作編碼本發明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達。依賴於表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術是本領域熟知的。調控序列可以是適當的啟動子序列，其是由用於表達編碼本發明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽的表達的轉錄調控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，並且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內多肽的基因獲得。用於指導本發明的核酸構建體轉錄，特別是在細菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子：大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈黴菌(Streptomycescoelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽澱粉酶基因(amyM)、解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青黴素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內醯胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)，以及tac啟動子(DeBoer等,1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。另外的啟動子在"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"於ScientificAmerican,1980,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,見上文中描述。用於指導本發明的核酸構建體在絲狀真菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子：米麴黴TAKA澱粉酶、曼赫根毛黴(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴中性α-澱粉酶、黑麴黴酸穩定性α-澱粉酶、黑麴黴或泡盛麴黴葡糖澱粉酶(glaA)、曼赫根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴丙糖磷酸異構酶、構巢麴黴乙醯胺酶、鑲片鐮孢澱粉葡糖苷酶(WO00/56900)、鑲片鐮孢Daria(WO00/56900)、鑲片鐮孢Quinn(WO00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)、裡氏木黴β-葡糖苷酶、裡氏木黴纖維二糖水解酶I、裡氏木黴纖維二糖水解酶II、裡氏木黴內切葡聚糖酶I、裡氏木黴內切葡聚糖酶II、裡氏木黴內切葡聚糖酶III、裡氏木黴內切葡聚糖酶IV、裡氏木黴內切葡聚糖酶V、裡氏木黴木聚糖酶I、裡氏木黴木聚糖酶II、裡氏木黴β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑麴黴中性α-澱粉酶基因和米麴黴丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得：釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1,ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUP1)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對於酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488描述。調控序列也可以是合適的轉錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3』末端可操作地連接。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發明中。對於絲狀真菌宿主細胞優選的終止子從如下酶的基因獲得：米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、黑麴黴α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對於酵母宿主細胞優選的終止子從如下酶的基因獲得：釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYC1)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對於酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos等,1992,見上文描述。調控序列還可以是合適的前導序列，其是對於宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區。前導序列可操作地連接於編碼多肽的核苷酸序列的5』-末端。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何前導序列用在本發明中。對於絲狀真菌宿主細胞優選的前導序列從如下酶的基因獲得：米麴黴TAKA澱粉酶和構巢麴黴丙糖磷酸異構酶。對於酵母宿主細胞合適的前導序列從如下酶的基因獲得：釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3』末端可操作地連接的序列，並且在轉錄時，宿主細胞將其識別為信號以將聚腺苷殘基添加至轉錄的mRNA。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發明中使用。對於絲狀真菌宿主細胞優選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得：米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑麴黴α-葡糖苷酶。對於酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,MolecularCellularBiology15:5983-5990描述。調控序列還可以是信號肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的胺基酸序列，並且指導編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5』端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼分泌多肽的編碼序列片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。或者，編碼序列5』端可含有對於所述編碼序列異源的信號肽編碼序列。異源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的。或者，外源信號肽編碼序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，指導表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑(即，分泌至培養基中)的任何信號肽編碼序列可在本發明中使用。對於細菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列：芽孢桿菌屬NCIB11837產麥芽糖澱粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內醯胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)、克勞氏芽孢桿菌鹼性蛋白酶(Bacillusclausiialcalineprotease)(aprH)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述。對於絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列：米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴中性澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶、特異腐質黴纖維素酶、特異腐質黴內切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質黴脂肪酶。對於酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等,1992,見上文描述。在一個方面，所述分離的、合成的或重組的多肽可包括缺乏信號序列的本發明的多肽。調控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位於多肽氨基末端的胺基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的並且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉化為成熟活性多肽。可以從枯草芽孢桿菌鹼性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、曼赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲黴漆酶(WO95/33836)的基因獲得前肽編碼序列。當信號肽和前肽序列二者均出現在多肽的氨基末端時，將前肽序列置於緊接著(nextto)多肽氨基末端，並且將信號肽序列置於緊接著前肽序列的氨基末端。同樣理想的是添加調節序列，其允許相對於宿主細胞的生長來調節多肽的表達。調節系統的實例是引起基因表達響應化學或物理刺激物，包括調節化合物的存在而開啟或關閉的那些系統。原核系統中的調節系統包括lac、tac、xyl和trp操縱基因系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-澱粉酶啟動子、黑麴黴葡糖澱粉酶啟動子和米麴黴葡糖澱粉酶啟動子作為調節序列。調節序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列可與調節序列可操作地連接。表達載體本發明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發明的多核苷酸、啟動子和轉錄和翻譯終止信號。本文中所述的多種核酸和調控序列可以結合在一起以產生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個(幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列。或者，可以通過在適當的用於表達的載體中插入所述核苷酸序列或包含所述序列的核酸構建體來表達本發明的多核苷酸序列。在製備表達載體的過程中，將編碼序列置於載體中，使得該編碼序列與適當的表達調控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質粒或病毒)，其能夠方便地進行重組DNA步驟，並且能夠產生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴於載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環狀質粒。載體可以是自主複製載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其複製獨立於染色體複製，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用於確保自複製的手段(means)。或者，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中並且與整合了該載體的染色體一起複製的載體。此外，可以使用單獨的載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉座子(transposon)。本發明的載體優選含有一個或多個(幾個)選擇性標記，其允許簡單選擇經轉化、轉染、轉導等的細胞。選擇性標記是基因，其產物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養缺陷型的原養性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性如氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素或四環素抗性。對於酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用於絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限於amdS(乙醯胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲醯基轉移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙醯轉移酶)、hph(潮黴素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5』-磷酸脫羧酶(orotidine-5』-phosphatedecarboxylase))、sC(硫酸腺苷醯轉移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優選用在麴黴屬細胞中的是構巢麴黴或米麴黴的amdS和pyrG基因和吸水鏈黴菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發明的載體優選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立於基因組的自主複製。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用於通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用於指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應優選含有足夠數量的核酸，如100至10,000鹼基對，優選400至10,000鹼基對，並且最優選800至10,000鹼基對，其與相應的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。為了自主複製，載體可以進一步包含複製起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地複製。複製起點可以是介導自主複製的任何質粒複製子(replicator)，其在細胞中發揮功能。術語「複製起點」或「質粒複製子」在本文定義為能夠使質粒或載體體內複製的核苷酸序列。細菌複製起點的實例是允許在大腸桿菌中複製的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的複製起點，和允許在芽孢桿菌屬中複製的質粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的複製起點。用於酵母宿主細胞中的複製起點的實例是2微米複製起點，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的複製起點的實例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,NucleicAcidsResearch15:9163-9175；WO00/24883)。分離AMA1基因和構建包含該基因的質粒或載體能夠根據公開於WO00/24883中的方法完成。可以將多於一個拷貝的本發明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產物的產生。多核苷酸拷貝數的增加可通過如下方法獲得：將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或將可擴增的選擇性標記基因包括於多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝的細胞，和由此得到多核苷酸的額外拷貝。用於連接上述元件以構建本發明的重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見，例如，Sambrook等,1989,見上文)。宿主細胞本發明還涉及重組宿主細胞，其包含本發明的分離的多核苷酸，可有利地用於多肽的重組生產中。將包含本發明的多核苷酸的載體導入宿主細胞，使載體作為染色體整合體或如前所述的自複製的染色體外載體維持。術語「宿主細胞」包括由於複製過程中發生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何後代。宿主細胞的選擇在很大程度上依賴於編碼多肽的基因及其來源。宿主細胞可以是在本發明的多肽的重組產生中有用的任何細胞，例如，原核或真核細胞。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限於，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈黴菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌和海洋芽孢桿菌。革蘭氏陰性細菌包括但不限於，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。在本發明的實施中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限於，嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇雲金芽孢桿菌細胞。在一個優選的方面，細菌宿主細胞是解澱粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在一個更優選的方面，細菌宿主細胞是解澱粉芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另一個更優選的方面，細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞。在本發明的實施中有用的鏈球菌屬細胞包括但不限於，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。在一個優選的方面，細菌宿主細胞是似馬鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是釀膿鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是乳房鏈球菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈黴菌屬細胞。在本發明的實施中有用的鏈黴菌屬細胞包括但不限於，不產色鏈黴菌、除蟲鏈黴菌、天藍鏈黴菌、灰色鏈黴菌和淺青紫鏈黴菌細胞。在一個優選的方面，細菌宿主細胞是不產色鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是除蟲鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是天藍鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是灰色鏈黴菌細胞。在另一個優選的方面，細菌宿主細胞是淺青紫鏈黴菌細胞。可通過如下方法實現將DNA引入到芽孢桿菌屬細胞：例如原生質體轉化(參見，例如，Chang和Cohen,1979,MolecularGeneralGenetics168:111-115)，使用感受態細胞(參見，例如，Young和Spizizen,1961,JournalofBacteriology81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,JournalofMolecularBiology56:209-221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne,1987,JournalofBacteriology169:5771-5278)。可通過如下方法實現將DNA引入到大腸桿菌細胞：例如原生質體轉化(參見，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等,1988,NucleicAcidsRes.16:6127-6145)。可通過如下方法實現將DNA引入到鏈黴菌屬細胞：例如原生質體轉化和電穿孔(參見，例如，Gong等,2004,FoliaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合(參見，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或轉導(參見，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通過如下方法實現將DNA引入到假單胞菌屬細胞，例如電穿孔(參見，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通過如下方法實現將DNA引入到鏈球菌屬細胞，例如天然感受態(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生質體轉化(參見，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，電穿孔(參見，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用任何已知的將DNA引入宿主細胞的方法。宿主細胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一個優選的方面，宿主細胞是真菌細胞。「真菌」用在本文包括以下門：子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等,於AinsworthandBisby’sDictionaryofTheFungi,第8版,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,見上,171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等,1995,見上)。在一個更優選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。「酵母」用在本文包括產子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內孢黴目(Endomycetales))、產擔子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬於半知菌類(FungiImperfecti)(芽孢綱(Blastomycetes))的酵母。由於酵母的分類在未來可能改變，就本發明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.編,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在一個甚至更優選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍黴屬細胞。其他酵母宿主細胞描述於WO2007/023163，第23頁第1-15行。在另一個更優選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。「絲狀真菌」包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等,1995,見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特徵在於由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它複雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發酵的。在一個甚至更優選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢黴屬、麴黴屬、短梗黴屬、煙管黴屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質黴屬、梨孢菌屬、毛黴屬、毀絲黴屬、新考瑪脂黴屬、脈孢菌屬、擬青黴屬、青黴屬、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節菌屬、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬、彎頸黴屬、栓菌屬(Trametes)或木黴屬細胞。其他絲狀真菌宿主細胞描述於WO2007/023163第23頁第20-35行。可將真菌細胞通過涉及原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉化。用於轉化麴黴屬和木黴屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton等,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述。用於轉化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述。可使用由如下文獻描述的方法轉化酵母：Becker和Guarente,於Abelson,J.N.和Simon,M.I.編,GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,194卷,182-187頁,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等,1983,JournalofBacteriology153:163；和Hinnen等,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920。產生方法本發明還涉及產生本發明多肽的方法，其包括：(a)在有助於產生多肽的條件下培養以其野生型形式產生所述多肽的細胞；和(b)回收所述多肽。在一個優選的方面，所述細胞為海兔屬的細胞。在一個最優選的方面，所述細胞為加州海兔DSM22525。本發明還涉及產生本發明的多肽的方法，包括：(a)在有助於產生多肽的條件下培養如本文中所述的重組宿主細胞；和(b)回收所述多肽。本發明還涉及用於產生本發明的多肽的方法，其包括：(a)在有助於產生多肽的條件下培養重組宿主細胞，其中所述宿主細胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變，其中所述突變核苷酸序列編碼多肽，該多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽或由SEQIDNO:2的成熟多肽組成，和(b)回收所述多肽。在本發明的產生方法中，使用本領域公知的方法在適合於產生所述多肽的營養培養基中培養細胞。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公開的組成製備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌至培養基，則其能夠從細胞裂解物(lysate)回收。可以使用本領域已知的對於所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，酶測定法(enzymeassay)可用於測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規方法從營養培養基中回收，所述常規方法包括但不限於離心、過濾、提取、噴霧乾燥、蒸發或沉澱。本發明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化，所述方法包括但不限於層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，製備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。組合物本發明還涉及包含本發明多肽的組合物。優選地，所述組合物富集此種多肽。術語「富集」指該組合物的有機磷水解酶活性以例如至少1.1的富集因子增加。所述組合物可包含本發明的多肽作為主要的酶組分，例如，單組分組合物。或者，所述組合物可包含多種酶活性，如氨肽酶、澱粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶(chitinase)、角質酶、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、滷過氧化物酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽穀氨醯胺酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉穀氨醯胺酶或木聚糖酶。其他酶可通過例如海洋生物或屬於麴黴屬的微生物，優選棘孢麴黴(Aspergillusaculeatus)、泡盛麴黴(Aspergillusawamori)、煙麴黴(Aspergillusfumigatus)、臭麴黴(Aspergillusfoetidus)、日本麴黴(Aspergillusjaponicus)、構巢麴黴(Aspergillusnidulans)、黑麴黴(Aspergillusniger)或米麴黴(Aspergillusoryzae)；鐮孢屬的微生物，優選杆孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、禾穀鐮孢(Fusariumcerealis)、庫威鐮孢(Fusariumcrookwellense)、大刀鐮孢(Fusariumculmorum)、禾本科鐮孢(Fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(Fusariumgraminum)、異孢鐮孢(Fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢(Fusariumnegundi)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、多枝鐮孢(Fusariumreticulatum)、粉紅鐮孢(Fusariumroseum)、接骨木鐮孢(Fusariumsambucinum)、膚色鐮孢(Fusariumsarcochroum)、硫色鐮孢(Fusariumsulphureum)、圓鐮孢(Fusariumtorulosum)、擬絲孢鐮孢(Fusariumtrichothecioides)或鑲片鐮孢(Fusariumvenenatum)；腐質黴屬的微生物，優選特異腐質黴(Humicolainsolens)或疏棉狀腐質黴(Humicolalanuginosa)；或木黴屬的微生物，優選哈茨木黴(Trichodermaharzianum)、康寧木黴(Trichodermakoningii)、長枝木黴(Trichodermalongibrachiatum)、裡氏木黴(Trichodermareesei)或綠色木黴(Trichodermaviride)來產生。或者，所述酶可由屬於芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)的微生物或細菌如大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)來產生。其他酶亦可由嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇雲金芽孢桿菌產生。在一個方面，其他酶由似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌或馬鏈球菌產生。在一個方面，其他酶由不產色鏈黴菌、除蟲鏈黴菌、天藍鏈黴菌、灰色鏈黴菌或淺青紫鏈黴菌產生。可以依照本領域內已知的方法製備多肽組合物，並且可以是液體或幹組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本領域內已知方法將包含於所述組合物中的多肽穩定化。下文給出本發明的多肽組合物的優選用途的實例。本發明的多肽組合物的劑量和使用所述組合物的其他條件可基於本領域已知方法來確定。用途本發明還涉及使用具有有機磷水解酶活性的多肽(有機磷水解酶)或其組合物的方法。在一個優選實施方案中，本發明還涉及本發明的有機磷水解酶用於對經至少一種有害的或不希望的有機磷化合物汙染的區域或裝置進行去汙染的用途。將本發明的有機磷水解酶或包含本發明的有機磷水解酶的組合物以足以降解至少一種有害的或不希望的有機磷化合物的至少一部分的量施於所述區域或裝置。在另一個實施方案中，本發明的有機磷水解酶可用於供施於例如人的皮膚的洗劑或其他乳劑如微乳劑中。將本發明的有機磷水解酶或包含本發明的有機磷水解酶的組合物施於皮膚以針對至少一種有害的或不希望的有機磷化合物進行保護。在進一步的實施方案中，本發明的有機磷水解酶可併入用於檢測至少一種有害的或不希望的有機磷化合物的測定法中。此類測定法對於快速評估不希望的有機磷化合物的存在可為有益的。有害的或不希望的有機磷化合物包括有毒的有機磷膽鹼酯酶抑制化合物包括神經毒氣如二異丙基氟磷酸(DFP)、O-異丙基甲基磷氟酸(沙林)，O-頻哪醇基甲基磷氟酸(O-pinacolylmethylphosphonofluoridate)(索曼)和O-環己基甲基磷氟酸(O-cyclohexylmethylphosphonofluoridate)。其他有害的化合物包括V試劑，其可包括VX、VE、VG、VM、VRTetriso和SovietV-氣(RussianVX)。農藥可包括殺真菌劑、殺蟲劑、除草劑和殺嚙齒類劑。農藥可為內吸磷-S(Demeton-S)、內吸磷-S-甲基(Demeton-S-methyl)、碸吸磷(Demeton-S-methylsulphon)、甲基內吸磷(Demeton-methyl)、對硫磷(Parathion)、亞胺硫磷(Phosmet)、三硫磷(Carbophenothion)、苯噁磷(Benoxafos)、谷硫磷(Azinphos-methyl)、益棉磷(Azinphos-ethyl)、胺吸磷(Amiton)、賽硫磷(Amidithion)、果蟲磷(Cyanthoate)、Dialiphos、樂果(Dimethoate)、敵磷(Dioxathion)、乙拌磷(Disulfoton)、因毒磷(Endothion)、Etion、益硫磷(Ethoate-methyl)、安硫磷(Formothion)、馬拉硫磷(Malathion)、Mercarbam、氧樂果(Omethoate)、異碸磷(Oxydeprofos)、碸拌磷(Oxydisulfoton)、芬硫磷(Phenkapton)、甲拌磷(Phorate)、伏殺硫磷(Phosalone)、乙噻唑磷(Prothidathion)、發硫磷(Prothoate)、蘇硫磷(Sophamide)、甲基乙拌磷(Thiometon)、蚜滅磷(Vamidothion)和甲胺磷(Methamidophos)。本發明進一步由下述實施例描述，其不應視為限制本發明的範圍。實施例用作緩衝液和底物的化學品為至少試劑級的商品。實施例1：DFP酶基因的克隆和表達設計了編碼來自加州海兔的DFP酶的合成基因並由商業供應商合成了該基因，然後將該基因通過如下所述的PCR克隆入表達載體pET30a+DFP酶的克隆將下述列出的PCR引物組用於PCR擴增合成的DFP酶基因。為了克隆的目的，將限制性位點NdeI和XhoI引入PCR片段末端(在下述列出的引物序列中，位點以下劃線表示)。引物1：5』-ATATACATATGGCACCTACGGTTGTATCTCTTC-3』(SEQIDNO:3)引物2：5』-GTGCTCGAGGTTTTTGTCACAATACTGAGGC-3』(SEQIDNO:4)旋轉純化(spinpurified)PCR片段，將其用NdeI和XhoI(NewEnglandBiolabs)消化，並使用T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs)連接入事先經NdeI和XhoI消化的質粒表達載體pET30a+(InVitrogen)。在16℃進行過夜(ON)溫育之後，將連接反應物轉化入感受態大腸桿菌TOP10細胞(Invitrogen)，並將其鋪板於含20μg/ml卡那黴素的LB瓊脂板。將平板在37℃溫育16小時。從選定的轉化體純化質粒DNA，並對其測序以供克隆過程的驗證。最終將質粒轉化入感受態大腸桿菌BL21(DE3)細胞以供蛋白質表達。DFP酶表達將攜帶上述的質粒的BL21(DE3)細胞接種入125ml錐形瓶中的補充了20μg/ml卡那黴素的20mlTB-Glycerol培養基(TBGK-培養基)。將培養物在37℃和180rpm生長過夜。翌日將含有1升TBGK培養基的2升錐形瓶用這些培養物接種至起始OD600＝0.1。在30℃和180rpm生長培養物直至OD600達到0.7，此時將IPTG以終濃度1mM添加。繼續在30℃和180rpm生長16小時。實施例2：純化從培養物通過在5000rpm離心10分鐘來收穫細胞，並使用CelLytic蛋白質提取試劑(Sigma)來提取胞內蛋白。將裂解的發酵物通過0.22μm瓶頂(bottletop)過濾器(Nalgene)過濾。將固體NaCl、Tris-HCl和咪唑添加至下述濃度：50mMTris-HCl，20mM咪唑和0.5MNaCl。將pH調整至7.4，並使用在純化器(purifier)900系統上預加載Cu2+的螯合SepharoseFF柱來純化該溶液。洗脫是逐步用增加的咪唑濃度(0、10％、20％和50％500mM咪唑)來進行的。匯集了屬於同一個峰的級分，將其濃縮並使用具有30kDa截留值的AmiconUltra離心過濾裝置緩衝液交換入50mMTRIS,pH7.0。實施例3：酶活性的測量DFP酶活性如下所述確定：酶活性是通過如Blum等,JACS128(2006):12750-12757中所述的恆定pH測定法或使用如等,AnalBiochem385(2009):187-193中所述的原位傅立葉變換紅外光譜法來確定的。在恆定pH測定法中，DFP水解是通過測量氟離子在298K在氮氣氣氛下的釋放來確定的。該測定法是在3mlpH7.5，含10mMNaCl和10％乙腈中進行的。反應是通過添加2微升的0.5mg/mlDFP酶起始的。起始速度是在八個不同底物濃度(0.5-10mM)確定的，並針對DFP水解的未催化的速率進行校正。使用原位傅立葉變換紅外(FITR)光譜法以在神經毒劑底物水解為相應的磷酸和膦酸時，測量這些神經毒劑底物的實時反應速率。通過將純化的DFP酶添加至含有在50mMTris，2mMCaCl2，pH7.5中的1mM二氫香豆素(dihydrocoumarine)的溶液來在分光光度計中在25℃在235nm處跟蹤(follow)二氫香豆素的水解。對於DFP酶，當計算為每分鐘每mg蛋白質在235nm處吸光度的減少時，二氫香豆素水解的比活性計算為：對於加州海兔，44U/mg，而對於魷魚，1.7U/mg。定性活性測試用下述G試劑測試DFP酶：DFP、索曼、環沙林和沙林。海兔DFP酶針對所有四種G試劑顯示活性。底物魷魚對底物的比活性U/mg加州海兔對底物的比活性U/mgDFP(1.79％)30543沙林(1.97％)115195索曼(1.89％)95198環沙林(1.9％)205263香豆素1.744從該表可見，來自加州海兔的DFP酶對沙林、索曼和環沙林具有較佳活性，儘管對DFP具有較低活性。生物材料的保藏依據布達佩斯條約的條款，下述的生物材料已經保藏於德意志微生物和細胞培養物保藏中心(DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSM))，並給予下述的登錄號：保藏物登錄號保藏日期大腸桿菌NN059104DSM225252009年4月28日所述菌株於下述條件下保藏：確保在本專利申請未決期間，由外國專利法律決定授權的人能夠獲得所述培養物。所述保藏物為所保藏菌株的基本上純的培養物。在提交了題述申請的對應申請或其子申請(progeny)的國家中，依據該外國專利法律的要求，可以獲得所述保藏物。然而，應當理解，保藏物的可獲得性並不構成對實施題述發明的許可，實施題述發明是對政府行為所授予的專利權的侵犯。在本文中描述並要求保護的發明在範圍上並不受本文中披露的具體方面所限制，因為這些方面旨在作為本發明幾個方面的說明。旨在使任何等同的方面落在本發明的範圍內。事實上，依據前述描述，除了那些在本文中顯示並描述的之外，對於本發明的多種修飾對於本領域技術人員而言會是顯而易見的。此類修飾亦旨在落在所附權利要求的範圍之內。在出現衝突時，應以包括定義的本公開為準。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp