牛奶體細胞檢測試劑盒及方法
2023-12-02 02:06:21 3
專利名稱：牛奶體細胞檢測試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測牛奶品質和奶牛隱性乳房炎的方法，尤其涉及一種通過確定 牛奶中體細胞的含量以檢測奶牛隱性乳房炎的方法。
背景技術：
在當今世界各國乳製品產業中，乳房炎是造成損失最多的一種疾病.也是一種嚴 重的人畜共患病。據美國國家乳房炎委員會1996年統計，每年因隱性乳房炎造成的直接 經濟損失約17億美元。在我國，奶牛主要是千家萬戶的分散養殖，管理條件差、檢測手段 不完善，因此乳房炎特別是隱性乳房炎的發病率很高，據統計，個別養殖場的發病率可達 46. 4% -85. 7%，每年每頭牛因產奶量降低造成損失約1526元。患了乳房炎的牛，其牛乳理 化性質和營養成分將發生改變，乳汁中的病原體及其毒素和殘留的抗生素均將威脅乳製品 的安全.損害消費者的身體健康。隱性乳房炎若不及時診斷治療，大多可轉變成臨床型乳 房炎。此時，奶牛將被淘汰，造成重大經濟損失。隱性乳房炎發病率高，無明顯的臨床症狀，但乳汁的生物化學、乳汁成分發生變 化，看不到乳汁和乳房變化，因此常被人忽視。其最大的危害是由於病情的發展，會變成臨 床型乳房炎。如能做到早發現就可儘早採取必要措施，控制病情的發展，把損失減少到最小 程度。牛乳中體細胞數量的增加是檢驗奶牛是否患有乳房炎症的最好指標。雖然牛乳中 體細胞數量增加，但奶牛乳房並沒有顯示明顯的異常症狀，處於這種狀態的乳房炎稱為亞 臨床型乳房炎。根據這一特點，牛乳中的SCC可以用來指示炎症反應的程度。一般來說，未 感染乳房炎的牛乳中的SCC低於20萬/mL，良好的牧場，體細胞數量通常在10萬/mL以下； 當奶牛群中存在有亞臨床型乳房炎或臨床型乳房炎時，體細胞數量均在50萬/mL以上。奶 牛處於應激狀態或炎熱的夏季，體細胞數量也會增高。目前該項目檢測主要應用的檢測方法為CMT(California mastitis test)、 BTB(Bromo-thymol blue test)、NFT(Negretti field test)、氯化物硝酸銀試驗、體細胞計 數和細菌學檢測等方法進行檢測。這些檢測方法均需要依賴相應的儀器設備、並需要使用 液體試劑等，不便於實地檢測，而且試劑的保存和使用也受到限制，也不便於快速簡便的得 到實驗結果。因而，目前需要一種能夠早期、快速、簡便、可靠地診斷隱性乳房炎的方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測牛奶中體細胞數量的試劑盒與方法。為解決上述技術問題，本發明是按下述方式來實現的。牛奶中的體細胞包括白細 胞、淋巴細胞、巨噬細胞、上皮細胞等。當奶牛患有乳房炎時，上述體細胞在牛奶中的含量會 增高，尤其白細胞將顯著增高10倍以上。因此本發明針對牛奶中的體細胞進行檢測來檢測 奶牛的患病情況。
本發明提供的牛奶體細胞檢測試劑盒由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸水濾 紙、反應支持物組成。其中所述樣品墊設置在所述檢測試劑盒的一端，並依次連接所述膠體金墊、硝酸 纖維素膜、吸水濾紙；所述膠體金墊含有膠體金標記的乳牛體細胞單克隆抗體；所述硝酸 纖維素膜設置有檢測條帶和質控條帶，所述檢測條帶設置於靠近膠體金墊的一側並含有乳 牛體細胞單克隆抗體，所述質控條帶設置於遠離膠體金墊的一側並含有羊抗鼠IgG多克隆 抗體；所述樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙均設置在所述反應支持物上。優選地，所述樣品墊的一端壓住所述膠體金墊的一端並與之粘貼，所述膠體金墊 的另一端和所述吸水濾紙的一端壓住所述硝酸纖維素膜並與之粘貼。優選地，所述樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜以及吸水濾紙均粘貼在所述反應支 持物上。
優選地，所述反應支持物的材料為塑料。應用本發明的檢測試劑盒的檢測牛奶體細胞的方法包括以下步驟(1)將牛奶樣品滴加至所述樣品墊上並滴加稀釋液；(2)所述樣品中的體細胞在經過所述膠體金墊的過程中與所述膠體金標記的乳牛 體細胞單克隆抗體特異性結合形成複合物；(3)所述複合物在經過所述硝酸纖維素膜的過程中依次與相對於所述複合物不足 量的乳牛體細胞單克隆抗體以及所述羊抗鼠IgG多克隆抗體特異性結合；(4)如果所述檢測條帶處出現紅色或粉紅色，則表明牛奶樣品中的體細胞數量在 檢測限度以上，為陽性；如果所述檢測條帶處未出現紅色或粉紅色，則表明牛奶樣品中的體 細胞數量在檢測限度以下，為陰性；(5)如果所述質控條帶處出現紅色或粉紅色，則表明實驗結果有效；如果所述質 控條帶處未出現紅色或粉紅色，則表明膠體金失效或者實驗操作有誤，實驗結果無效。優選地，所述膠體金標記的乳牛體細胞單克隆抗體的量根據所使用的膠體金來確定。優選地，每釐米硝酸纖維素膜上所包被的乳牛體細胞單克隆抗體的量為 0. 5-2 μ g，每釐米硝酸纖維素膜上所包被的羊抗鼠IgG多克隆抗體的量為2-5 μ g。優選地，所述牛奶樣品的滴加量為20-50 μ L0優選地，所述檢測限度為30萬/mL樣品。本發明的有益效果如下。本發明所述的牛奶體細胞檢測試劑盒，能夠簡化牛乳中體細胞檢測流程。利用這 種檢測試劑盒檢測牛乳體細胞數量，不對任何實驗儀器、環境或者操作人員具有依賴性，操 作簡單、方便、檢測周期短、易於判讀，不需要特殊的儀器設備，不需要專業培訓，適應性強， 便於隨時隨地的監測和檢驗。本發明的檢測方法操作簡單方便、不依賴較高實驗室條件、用於快速檢測牛奶中 體細胞數量是否超過檢測限度的檢測試劑盒，進而實現快速簡便的輔助診斷隱性乳房炎。
圖1是本發明的一個檢測試劑盒的正面示意圖2是本發明的一個檢測試劑盒的側面示意圖；圖3是本發明的一個檢測試劑盒檢測結果陽性示意圖；圖4是本發明的一個檢測試劑盒檢測結果陰性示意圖；圖5是本發明的一個檢測試劑盒結果無效示意圖；圖6是本發明的一個檢測試劑盒結果無效示意圖。其中1、吸水濾紙；2、硝酸纖維素膜；3、膠體金墊；4、樣品墊；5、反應支持物；T、 檢測條帶；C、質控條帶。
具體實施例方式參照圖1和圖2，對本發明的檢測試劑盒的一種實施方式進行進一步的說明。乳牛體細胞檢測試劑盒由吸水濾紙1、硝酸纖維素膜2、膠體金墊3、樣品墊4和反 應支持物5組成。所述硝酸纖維素膜2包括含有乳牛體細胞單克隆抗體的檢測條帶T以及 含有羊抗鼠IgG多克隆抗體的質控條帶C。所述膠體金墊3含有膠體金標記的乳牛體細胞 單克隆抗體。包被檢測條帶T和質控條帶C的硝酸纖維素膜2粘貼在反應支持物5上，在 檢測條帶T的方向上硝酸纖維素膜的邊緣距離反應支持物5邊緣28. 0mm，在質控條帶C的 方向上硝酸纖維素膜的邊緣距離反應支持物5的邊緣32. 0mm。在質控條帶線C的方向上 反應支持物5上粘貼有吸水濾紙1，長度為33. 0mm，壓住硝酸纖維素膜1. 0mm。在檢測條帶 T的方向上反應支持物5上首先粘貼6. 0mm長的膠體金墊3，壓住硝酸纖維素膜檢測條帶T 的邊緣1. 0mm ；在此方向上繼續粘貼樣品墊4，長度為25. 0mm，壓住膠體金墊2. 0mm。吸水濾 紙可以防止樣本在硝酸纖維素膜的一端堆積，從而導致後續的樣本無法繼續前行，進而能 夠使反應充分。將30 ill的待檢樣品(新鮮牛奶)直接滴加至檢測試劑盒樣品墊4，再滴加80 u 1 的稀釋液，此時樣品將依次沿著反應支持物5上的各個附著物向吸水濾紙的方向移動，10 分鐘內讀取實驗結果。如果牛奶中含有的體細胞超過檢測限度，則與檢測試劑盒上的膠體金標記的乳牛 體細胞單克隆抗體特異性結合形成複合物，而後繼續前行，與包被在硝酸纖維素膜2上的 另一個乳牛體細胞單克隆抗體發生特異性結合，在檢測條帶處出現紅色或者粉紅色，即檢 測線，表明牛奶樣品中的體細胞數量在檢測限度以上，為陽性，參照圖3。如果牛奶中含有的體細胞在限度範圍之下，就不能形成足量複合物，檢測條帶處 也就不能出線紅色或粉紅色，為陰性，參照圖4。無論樣本中含有的牛奶體細胞是否超標，上述體細胞與膠體金標記的單克隆抗體 所結合形成的複合物都會繼續前行至質控條帶並與此處包被的羊抗鼠IgG多克隆抗體結 合，形成紅色或者粉紅色條帶，即為質控線。如果在檢測中此條帶不出現，則證明膠體金失 效或者操作有失誤，結果無效，需要重新檢測，參照圖5和圖6。以上所述之具體實施例，意在具體說明本發明的思路，並不限於以上具體實施例 所公開的方式。凡基於本發明之設計思路，進行簡單推演與替換，都屬於本發明保護範圍。
權利要求
一種牛奶體細胞檢測試劑盒，其特徵在於，由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙、反應支持物組成；其中所述樣品墊設置在所述檢測試劑盒的一端，並依次連接所述膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙；所述膠體金墊含有膠體金標記的乳牛體細胞單克隆抗體；所述硝酸纖維素膜設置有檢測條帶和質控條帶，所述檢測條帶設置於靠近膠體金墊的一側並含有乳牛體細胞單克隆抗體，所述質控條帶設置於遠離膠體金墊的一側並含有羊抗鼠IgG多克隆抗體；所述樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙均設置在所述反應支持物上。
2.根據權利要求1所述的牛奶體細胞檢測試劑盒，其特徵在於，所述樣品墊的一端壓 住所述膠體金墊的一端並與之粘貼，所述膠體金墊的另一端和所述吸水濾紙的一端壓住所 述硝酸纖維素膜並與之粘貼。
3.根據權利要求2所述的牛奶體細胞檢測試劑盒，其特徵在於，所述樣品墊、膠體金 墊、硝酸纖維素膜以及吸水濾紙均粘貼在所述反應支持物上。
4.根據權利要求3所述的牛奶體細胞檢測試劑盒，其特徵在於，所述反應支持物的材 料為塑料。
5.一種應用權利要求1所述的檢測試劑盒的檢測牛奶體細胞的方法，其特徵在於，該 方法包括以下步驟(1)將牛奶樣品滴加至所述樣品墊上並滴加稀釋液；(2)所述樣品中的體細胞在經過所述膠體金墊的過程中與所述膠體金標記的乳牛體細 胞單克隆抗體特異性結合形成複合物；(3)所述複合物在經過所述硝酸纖維素膜的過程中依次與相對於所述複合物不足量的 乳牛體細胞單克隆抗體以及所述羊抗鼠IgG多克隆抗體特異性結合；(4)如果所述檢測條帶處出現紅色或粉紅色，則表明牛奶樣品中的體細胞數量在檢測 限度以上，為陽性；如果所述檢測條帶處未出現紅色或粉紅色，則表明牛奶樣品中的體細胞 數量在檢測限度以下，為陰性；(5)如果所述質控條帶處出現紅色或粉紅色，則表明實驗結果有效；如果所述質控條 帶處未出現紅色或粉紅色，則表明膠體金失效或者實驗操作有誤，實驗結果無效。
6.根據權利要求5所述檢測牛奶體細胞的方法，其特徵在於，所述膠體金標記的乳牛 體細胞單克隆抗體的量根據所使用的膠體金來確定。
7.根據權利要求5所述檢測牛奶體細胞的方法，其特徵在於，每釐米硝酸纖維素膜上 所包被的乳牛體細胞單克隆抗體的量為0. 5-2 μ g，每釐米硝酸纖維素膜上所包被的羊抗鼠 IgG多克隆抗體的量為2-5 μ g。
8.根據權利要求5所述檢測牛奶體細胞的方法，其特徵在於，所述牛奶樣品的滴加量 為 20-50 μ L0
9.根據權利要求6-8所述檢測牛奶體細胞的方法，其特徵在於，所述檢測限度為30萬 /mL樣品。
全文摘要
本發明涉及一種牛奶體細胞檢測試劑盒，由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸收濾紙、反應支持物組成。所述膠體金墊與所述樣品墊連接且含有膠體金標記的乳牛體細胞單克隆抗體；所述硝酸纖維素膜與所述膠體金墊連接並設置有檢測條帶和質控條帶，所述檢測條帶設置於靠近膠體金墊的一側並含有乳牛體細胞單克隆抗體，所述質控條帶設置於遠離膠體金墊的一側並含有羊抗鼠IgG多克隆抗體。本發明還提供的應用所述檢測試劑盒的檢測牛奶體細胞的方法。本發明所述的牛奶體細胞檢測試劑盒及方法，能夠簡化牛乳中體細胞檢測流程。利用這種檢測試劑盒檢測牛乳體細胞數量，不對任何實驗儀器、環境或者操作人員具有依賴性，操作簡單、方便、檢測周期短、易於判讀，不需要特殊的儀器設備，不需要專業培訓，適應性強，便於隨時隨地的監測和檢驗。
文檔編號C12Q1/02GK101865922SQ20101017369
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月17日 優先權日2010年5月17日 公開號201010173697.發明者江兵澤 申請人:北京易斯威特生物醫學科技有限公司;顧子易;張慶