非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎小鼠模型的建立方法
2023-12-01 17:17:11
非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎小鼠模型的建立方法
【專利摘要】本發明公開了一種建立非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎小鼠模型的方法。該方法選擇高脂飼料餵養C3H/HeN小鼠12周，觀察小鼠體重、肝重、轉氨酶、糖脂代謝指標及肝臟組織學變化，建立非酒精性脂肪性肝病小鼠。再選擇10PFU量的鼠肝炎3型病毒(MHV-3)感染小鼠，觀察受感染後小鼠的存活率、肝臟組織學及肝內病毒複製，從而建立類似人類疾病過程的非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎小鼠模型。該模型的建立為系統研究非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎的病毒動力學、免疫學改變和防治措施提供了有力的工具。
【專利說明】非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎小鼠模型的建立方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物醫學研究領域，涉及一種動物模型的構建方法，特別涉及一種用 於模擬、研究和防治非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎的小鼠模型的構建方法。
【背景技術】
[0002] 非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是代謝綜 合徵在肝臟的表現，包括單純性脂肪肝（simple steatosis),脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH),以及NASH相關的肝纖維化/肝硬化、肝癌。隨著生活水平的提 高，NAFLD在發展中國家的發病率顯著上升，我國NAFLD發病率在過去的10年增加了近一 倍，部分地區的發病率已達四分之一。我國是肝炎病毒感染的高發地區，約有1億B型肝炎 病毒（Hepatitis B virus, HBV)感染者及 4000 萬C型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV) 感染者，其中合併NAFLD的患者有逐年增加的趨勢，NAFLD合併病毒性肝炎是我國面臨的一 個新的健康問題。目前，關於NAFLD對病毒性肝炎的病毒動力學、免疫學及肝臟損傷影響機 制仍不明確。
[0003] 對於NAFLD合併病毒性肝炎的人群研究存在很多難點。首先，研究中多用肝臟超 聲診斷脂肪肝。肝臟超聲檢查僅能檢出肝內脂肪沉積超過30%的中度脂肪肝，難以檢出輕 度脂肪肝（肝臟內脂肪沉積為5% -30% )，因此在分組時，可能將輕度脂肪肝患者作為無脂 肪肝的對照。其次，在研究NAFLD合併慢性B型肝炎（Chronic h印atitis B，CHB)時，難以 保證受試者在代謝、病毒、治療等多種因素上的一致性。第三，人群研究難以獲取肝組織觀 察肝內免疫、代謝等方面的改變。建立可以模擬人類NAFLD合併病毒性肝炎疾病特點的動 物模型，可以克服上述臨床研究中的不足。
[0004] 相關的模型建立方法極少，中國科技大學傅苗苗在2009年發表的碩士研究生 學位論文《B肝病毒轉基因小鼠對營養性脂肪肝炎更敏感》中，曾採用膽鹼蛋氨酸缺乏 (Methionine-Choline_Deficient，MCD)飲食餵養轉有B肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg)的轉基因小鼠，建立NASH合併HBsAg表達的小鼠模型。但該模型與非酒精 性脂肪性肝病合併病毒性肝炎患者的臨床特點仍存在些許不同。第一，該小鼠模型僅轉入 了含有編碼HBsAg的基因片段，並不是完整的病毒基因，在體內不能形成完整的病毒顆粒， 不能模擬病毒複製情況；第二，該模型為轉基因小鼠，小鼠免疫系統對轉入的基因片段所表 達的HBsAg產生耐受，不能產生抗病毒免疫應答；第三，MCD飲食誘導的小鼠模型，只是在肝 髒病理上具有和非酒精性脂肪性肝炎一致的特徵，但是模型小鼠會出現體重降低，外周胰 島素敏感，甚至出現低血糖，與臨床患者的代謝情況相反。範建高等（Fatty liver reduces hepatitis B virus replication in a genotype B hepatitis B virus transgenic mice model，Journal of gastroenterology and hepatology，27(2012) 1858 - 1864)使用高脂飲 食餵養HBV轉基因小鼠，構建了具有非酒精性脂肪性肝病及HBV病毒表達的小鼠模型。該 動物模型較傅苗苗建立的小鼠模型更接近臨床病人表現，但是無法克服轉基因小鼠所共有 的缺陷。第一，轉基因小鼠對HBV病毒耐受，小鼠免疫系統對HBV病毒不會產生免疫應答， 不能進行免疫學方面的研究；第二，轉基因小鼠雖然可以複製並釋放HBV顆粒，但是HBV病 毒本身並不能感染小鼠肝細胞，不能模擬病毒感染及複製的完整周期。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是針對現有NAFLD合併病毒性肝炎動物模型所存在的不足，提供 一種建立NAFLD合併病毒性肝炎小鼠模型的方法，用該方法建立的小鼠模型克服了現有 NAFLD合併病毒性肝炎動物模型所存在的不足，模型小鼠構建成本低廉、易於復現、臨床症 狀明顯、具有完整的病毒感染及複製周期，並可以刺激免疫系統產生抗病毒免疫應答，可以 複製出NAFLD合併病毒性肝炎的多種特徵且與人類情況類似。
[0006] 為實現本發明的目的，本發明一方面提供一種非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝 炎小鼠模型的建立方法，包括對小鼠依次進行高脂飲食誘導、鼠肝炎病毒感染，構建非酒精 性脂肪性肝病合併病毒性肝炎模型小鼠。
[0007] 其中，所述小鼠選擇C3H/HeN純系近交小鼠。
[0008] 特別是，所述小鼠選擇雌性C3H/HeN純系近交小鼠。
[0009] 其中，所述C3H/HeN純系近交小鼠的年齡為6-7周胎齡。
[0010] 特別是，所述小鼠的動物級別為SPF級。
[0011] 尤其是，所述C3H/HeN純系近交小鼠的體重為15. 8-19. 4g。
[0012] 其中，所述高脂飲食誘導是採用高脂飼料餵養小鼠至少12周，構建非酒精性脂肪 性肝病小鼠。
[0013] 特別是，所述高脂飲食誘導時間優選為12周。
[0014] 特別是，每千克所述1?脂詞料含有258g釀蛋白、162g糊精、89g鹿糖、32g ?油、 317g豬油、65g纖維素、58g礦物質、13g維生素、4gL -胱氨酸、3g酒石酸膽鹼及0. 069g食 物抗氧化劑。
[0015] 尤其是，將小鼠餵養於無菌過濾空氣鼠籠內，控制籠內溫度為22°C，相對溼度為 40%，12小時光照/黑暗交替進行，供給雙蒸水，小鼠於籠內自由進食；每周更換兩次墊料 及飼料。
[0016] 尤其是，餵養過程中每周更換兩次墊料及飼料，可防止高脂飼料變質，影響小鼠進 食。
[0017] 其中，所述鼠肝炎病毒感染是對高脂飲食誘導後的小鼠注射鼠肝炎病毒，感染小 鼠，建立非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎小鼠模型。
[0018] 特別是，所述鼠肝炎病毒選擇鼠肝炎3型病毒。
[0019] 特別是，採用腹腔注射的方式注射所述的鼠肝炎3型病毒。
[0020] 尤其是，所述腹腔注射是在小鼠中下腹壁行腹腔內注射。
[0021] 其中，所述鼠肝炎病毒的注射量為每隻小鼠體內注射至少5PFU(病毒噬斑形成單 位）的鼠肝炎病毒，優選為5-15PFU，進一步優選為10PFU。
[0022] 本發明另一方面提供一種非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎小鼠模型的建立 方法，包括如下順序進行的步驟：
[0023] A)高脂飲食誘導處理
[0024] 在無菌過濾空氣鼠籠內，自由攝取食水的條件下，採用高脂飼料餵養小鼠至少12 周，誘導獲得非酒精性脂肪性肝病小鼠；
[0025] B)第一次體徵監測
[0026] 對高脂飲食誘導處理的小鼠進行體重、體型，肝臟形態、肝臟組織學變化以及血液 中丙氨酸轉氨酶、穀草轉氨酶、空腹血糖、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、胰島素水平及 胰島素抵抗水平測定；
[0027] C)病毒感染處理
[0028] 將鼠肝炎病毒通過注射的方式注入非酒精性脂肪性肝病小鼠體內，感染小鼠，建 立非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎小鼠模型；
[0029] D)第二次體徵監測
[0030] 分別於病毒感染第4、8、12、16、20、30天對病毒感染小鼠外周血檢測轉氨酶，觀察 病毒感染小鼠肝臟組織學及肝內病毒複製變化。
[0031] 其中，步驟A)中所述小鼠選擇C3H/HeN純系近交小鼠。
[0032] 特別是，所述小鼠選擇雌性C3H/HeN純系近交小鼠。
[0033] 其中，所述C3H/HeN純系近交小鼠的年齡為6-7周胎齡。
[0034] 特別是，所述小鼠的動物級別為SPF級。
[0035] 尤其是，所述C3H/HeN純系近交小鼠的體重為15. 8-19. 4g。
[0036] 特別是，所述高脂飲食誘導時間優選為12周。
[0037] 特別是，每千克所述1?脂詞料含有258g釀蛋白、162g糊精、89g鹿糖、32g ?油、 317g豬油、65g纖維素、58g礦物質、13g維生素、4gL -胱氨酸、3g酒石酸膽鹼及0. 069g食 物抗氧化劑。
[0038] 尤其是，將小鼠餵養於無菌過濾空氣鼠籠內，控制籠內溫度為22°C，相對溼度為 40%，12小時光照/黑暗交替進行，供給雙蒸水，小鼠於籠內自由進食；每周更換兩次墊料 及飼料。
[0039] 尤其是，餵養過程中每周更換兩次墊料及飼料，可防止高脂飼料變質，影響小鼠進 食。
[0040] 其中，步驟C)中所述鼠肝炎病毒選擇鼠肝炎3型病毒。
[0041] 特別是，採用腹腔注射的方式注射所述的鼠肝炎3型病毒。
[0042] 尤其是，所述腹腔注射是在小鼠中下腹壁行腹腔內注射。
[0043] 其中，所述鼠肝炎病毒的注射量為每隻小鼠體內注射至少5PFU(病毒噬斑形成單 位）的鼠肝炎病毒，優選為5-15PFU，進一步優選為10PFU。
[0044] 本發明方法所建立的模型具有如下優點：
[0045] 1、本發明方法首先採用高脂飲食餵養小鼠製備NAFLD小鼠，然後再採用鼠肝炎3 型病毒感染NAFLD小鼠，避免了因為MHV-3感染後，小鼠肝內免疫微環境的顯著改變，導致 在病毒感染後的小鼠的基礎上誘導非酒精性脂肪性肝病自然病理過程發生變化，與人類非 酒精性脂肪性肝病病變產生差異；本發明先誘導產生NAFLD再感染MHV-3,才能觀察NAFLD 對MHV - 3感染的影響，本發明的模型小鼠的構建方法具有簡便易行、成本低廉、可重複性 高、遺傳背景清晰、模擬人類代謝症候群和抗病毒免疫應答，以及完整的病毒感染與複製周 期的優點；
[0046] 小鼠感染MHV-3後，小鼠肝內會發生顯著的免疫微環境改變，包括：肝內雙陰性T 細胞（double negative T cell，DN Treg cell)、CD4+CD25+T 細胞、CD8+PD-1+T 細胞及 CD8+FasL+T 細胞比例增加，肝內 IFN-γ、IFN-β、IL-I β、IL-6、IL-12、IL-4、TNF-α 表達 及含量增加。在這樣的基礎上誘導NAFLD的形成，會對NAFLD的自然病理過程產生較顯著 的影響，例如加快NASH的形成。因此，應當先誘導NAFLD再感染MHV-3,才能觀察NAFLD對 MHV-3感染的影響。
[0047] 2、本發明方法選用的C3H/HeN小鼠自由攝取高脂飲食至少12周後，小鼠體形肥 胖、體重增加、轉氨酶輕度升高、糖脂代謝異常及肝內脂肪沉積，與人類的NAFLD的各種臨 床症狀相類似；
[0048] 3、本發明方法所選鼠肝炎3型病毒感染NAFLD C3H/HeN小鼠先患有急性肝炎，約 80%的存活小鼠2周後轉為持續性感染，對合併肝炎小鼠的免疫狀態及病毒複製情況進行 研究，是探討NAFLD對病毒性肝炎免疫學影響的有力工具；
[0049] 4、本發明方法建立的小鼠模型重複性好，遺傳背景清晰，為系統性、動態性研究 NAFLD對病毒性肝炎的免疫學、病毒學影響提供新的研究思路；
[0050] 5、本發明方法選用的高脂飼料易於獲取，鼠肝炎3型病毒易於體內、體外培養，所 建模型成本相對較低，同時也克服了轉基因小鼠對病毒耐受，對病毒不產生免疫應答，並缺 乏病毒感染與複製完整周期的局限型。
[0051] 本發明採用免疫力健全的小鼠，成年小鼠感染病毒後產生免疫應答，而轉基因小 鼠在胚胎發育階段，免疫細胞因識別轉入的病毒抗原，而產生克隆敲除，不會產生針對病毒 抗原的免疫應答；本發明的模型小鼠在MHV-3感染後，外周血抗檢測到MHV3抗體，呈陽性 的，淋巴細胞也出現激活，證明小鼠感染MHV3病毒後產生免疫應答；轉基因小鼠雖然是轉 入的HBV全部基因組，也能合成完整的病毒顆粒，但是新合成的HBV病毒是不能感染小鼠肝 細胞的（HBV只能感染靈長類動物肝細胞）。故，轉基因小鼠缺乏完整的病毒感染過程。一 部分轉基因小鼠，甚至只轉入部分HBV基因，只能合成一些病毒抗原，連完整的病毒顆粒都 無法合成。因此說轉基因小鼠中，缺乏完整的病毒複製周期。而MHV3病毒,是鼠肝炎病毒， 即感染小鼠肝細胞的病毒，並能在小鼠肝細胞中複製。本發明的模型小鼠採用活病毒注入 小鼠體內，並觀察到小鼠出現症狀、轉氨酶升高、甚至死亡，這就是一個感染的過程。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0052] 圖1是本發明高脂飲食及正常飲食餵養C3H/HeN小鼠體重變化曲線圖；
[0053] 圖2是餵養12周後的小鼠外觀圖，其中A為高脂飲食餵養小鼠外觀圖，B為正常 飲食餵養小鼠外觀圖；
[0054] 圖3是餵養12周後的小鼠肝臟外觀改變圖，其中A為正常飲食餵養小鼠肝臟，B為 高脂飲食餵養小鼠肝臟；
[0055] 圖4是本發明餵養12周的小鼠肝組織HE染色及油紅0染色顯微鏡觀察圖，其中 A為正常飲食小鼠肝組織HE染色鏡檢圖；B為正常飲食小鼠肝組織油紅0染色鏡檢圖；C為 高脂飲食小鼠肝組織HE染色鏡檢圖；D為高脂飲食小鼠肝組織油紅0染色鏡檢圖，箭頭所 示為肝細胞內沉積之脂肪滴；
[0056] 圖5本發明NAFLD合併病毒性肝炎小鼠生存曲線；
[0057] 圖6本發明NAFLD合併病毒性肝炎小鼠肝臟組織學變化鏡檢圖（HEX400)，其中， A為對照組NAFLD小鼠肝臟切片圖；B、C、D依次為感染4、8、20天小鼠肝臟切片圖；圖中▲ 所示為肝細胞腫脹，胞漿疏鬆，丨所示為肝細胞壞死灶；
[0058] 圖7本發明NAFLD合併病毒性肝炎小鼠肝內MHV-3病毒檢測凝膠電泳圖，其中A 為未感染MHV-3的對照組NAFLD小鼠樣本，未見病毒條帶；B為MHV-3感染30天小鼠樣本， 4隻小鼠中有3隻小鼠肝內可擴增到病毒條帶，條帶大小位於100-150bp，與目的片段117bp 吻合。
【具體實施方式】
[0059] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
[0060] 實施例1
[0061] 1、高脂飲食誘導處理
[0062] 1A)選擇6-7周齡SPF級雌性C3H/HeN小鼠125隻，予以高脂飼料餵養（簡稱為高 脂飼料組小鼠），其中，高脂飼料購於南通特洛菲飼料科技有限公司，貨號TP23520,每千克 飼料含有258g酪蛋白、162g糊精、89g蔗糖、32g豆油、317g豬油、65g纖維素、58g礦物質、 13g維生素、4gL -胱氨酸、3g酒石酸膽鹼及0. 069g食物抗氧化劑；
[0063] 本發明中實驗小鼠選擇性格溫順的雌性小鼠，既方便飼養又利於試驗處理的順利 進行。
[0064] 1B)另取6-7周齡SPF級雌性C3H/HeN小鼠15隻，予以正常飼料餵養（簡稱正常 對照組小鼠）；
[0065] 1C)每周稱取兩組小鼠體重，並觀察小鼠一般情況，連續餵養12周後高脂飼料組 小鼠體重顯著高於正常對照組小鼠的體重，並且高脂飼料組小鼠體型肥胖，皮毛油膩，不喜 活動；小鼠的體重、體型從餵養的第3周開始表現出顯著的差異性；2組小鼠的體重測定結 果如圖1所示；體型及形態如圖2所示。
[0066] 1D)餵養12周後高脂飼料誘導的小鼠構建為非酒精性脂肪性肝病（NAFLD)小鼠， 然後隨機取高脂飼料組小鼠15隻，及正常對照組15隻小鼠，收集外周血檢測轉氨酶及糖脂 代謝指標，觀察肝臟外觀及皮下脂肪堆積情況，稱取肝臟重量，收集肝組織進行蘇木素一伊 紅染色和油紅〇染色，觀察肝臟組織學變化，檢測結果如下：
[0067] 肝臟的外觀變化如圖3所示，其中：正常對照組小鼠的肝臟紅潤有光澤，邊緣銳 利，質韌（圖3A);高脂飼料組小鼠的肝臟顯著增大、邊緣圓鈍、色澤紅黃、表面光滑、有油膩 感、質地變脆，同時可見內臟及皮下脂肪增多（圖3B);
[0068] 肝臟組織學可見肝細胞脂肪變（如圖4);
[0069] 肝臟的重量以及血液中丙氨酸轉氨酶（ALT)、穀草轉氨酶（AST)、空腹血糖、膽固 醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、胰島素水平及胰島素抵抗水平測定結果如表1所示；
[0070] 表1餵養12周後的小鼠肝臟以及血相指標檢測結果
[0071]
【權利要求】
1. 一種非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎小鼠模型的建立方法，其特徵是包括對小 鼠依次進行高脂飲食誘導、鼠肝炎病毒感染，構建非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎模 型小鼠。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵是所述小鼠選擇C3H/HeN純系近交小鼠。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其特徵是所述高脂飲食誘導是採用高脂飼料餵養小 鼠至少12周，構建非酒精性脂肪性肝病小鼠。
4. 如權利要求1或2所述的方法，其特徵是所述鼠肝炎病毒感染是對高脂飲食誘導後 的小鼠注射鼠肝炎病毒，感染小鼠，建立非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎小鼠模型。
5. 如權利要求4所述的方法，其特徵是所述鼠肝炎病毒選擇鼠肝炎3型病毒。
6. 如權利要求4所述的方法，其特徵是採用腹腔注射的方式注射所述的鼠肝炎3型病 毒。
7. 如權利要求4所述的方法，其特徵是所述鼠肝炎病毒的注射量為每隻小鼠體內注射 至少5PFU的鼠肝炎病毒。
8. -種非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎小鼠模型的建立方法，其特徵是包括如下 順序進行的步驟： A) 高脂飲食誘導處理 在無菌過濾空氣鼠籠內，自由攝取食水的條件下，採用高脂飼料餵養小鼠至少12周， 誘導獲得非酒精性脂肪性肝病小鼠； B) 第一次體徵監測 對高脂飲食誘導處理的小鼠進行體重、體型，肝臟形態、肝臟組織學觀察以及血液中丙 氨酸轉氨酶、穀草轉氨酶、空腹血糖、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、胰島素水平及胰島 素抵抗水平測定； C) 病毒感染處理 將鼠肝炎病毒通過注射的方式注入非酒精性脂肪性肝病小鼠體內，感染小鼠，建立非 酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎小鼠模型； D) 第二次體徵監測 分別於病毒感染第4、8、12、16、20、30天對病毒感染小鼠外周血檢測轉氨酶，觀察病毒 感染小鼠肝臟組織學及肝內病毒複製變化。
9. 如權利要求8所述的方法，其特徵是步驟A)中所述小鼠選擇C3H/HeN純系近交小 鼠；步驟C)中所述鼠肝炎病毒選擇鼠肝炎3型病毒。
10. -種非酒精性脂肪性肝病合併病毒性肝炎模型小鼠，其特徵是按照如權利要求 1-9任一所述方法構建而成。
【文檔編號】A61K35/76GK104365543SQ201410588721
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月28日 優先權日:2014年10月28日
【發明者】寧琴, 羅小平, 習東, 吳婷, 王宏武, 王曉晶, 嚴偉明 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院