模塊式肽基試劑的製作方法

2023-12-02 08:05:01

專利名稱：模塊式肽基試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有穩定骨架的肽，該穩定骨架易於修飾以提供多個相互作用的結構域例如抑制或結合結構域。
背景技術：
基於免疫學的診斷分析的一個缺點是其依賴於抗體的使用。這些試劑，無論單克隆或多克隆，都是大型大分子多肽，它們製備昂貴且因常在保存期間變得不穩定而使許多診斷產品的保存期很短。此外，一個典型的免疫球蛋白(例如IgG)含有大量在生理學上重要但在抗原識別中卻不起作用的物質(Fc區域)。這樣的附加物質對許多應用都是非必需的，並會增加背景噪音、抑制擴散以及引起副反應。此外，將抗體重鏈和輕鏈結合在一起的二硫鍵是潛在不穩定的。這樣，抗體結構(和物質)的只有一小部分是直接涉及抗原識別的，然而抗原整體卻常常被製備並用於傳感器或診斷裝置中。
從完整抗體生產較小的Fab區域是可能的，但是Fab生產需要若干化學或酶加工步驟以及額外的蛋白純化程序。這些加工程序會增加診斷產品的成本。
所需要的是易於合成、穩定的抗原識別元素，其涉及抗原識別的分子質量比例更高。
發明概述本發明提供易於合成的、易於修飾以包括結合結構域、抑制劑結構域、接頭、標記、試劑、反應位點、催化位點的肽骨架，或試劑以及其它化學實體。
在一種實施方式中，本發明提供包含與SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列具有至少90％同一性的胺基酸序列的穩定分離肽。這樣的穩定分離肽可以具有聚脯氨酸螺旋、短環區以及α螺旋，其中肽發生摺疊以使聚脯氨酸螺旋與α螺旋產生疏水相互作用。本發明的肽是衍生自鳥胰多肽的小肽，它常比具SEQ ID NO1的肽更穩定。本發明的其它肽不如具SEQ ID NO1的肽穩定。理想的肽包括與SEQ IDNO11或14具有至少90％同一性的胺基酸序列。具有SEQ ID NO11或14的肽如上所述發生摺疊，並經二硫鍵進一步穩定。
本發明還提供分離的編碼穩定肽的核酸，該穩定肽包含與SEQ IDNO2～6、8～11或14之中任一序列具有至少90％同一性的胺基酸序列。優選地，該分離的核酸編碼與SEQ ID NO11或14中任一具有至少90％同一性的胺基酸序列。這樣的核酸例子包括SEQ ID NO12或13。
在另一實施方式中，本發明提供包含肽骨架和相互作用的結構域的肽基試劑，其中肽骨架包含與SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列具有至少90％同一性的胺基酸序列。理想的肽基試劑具有肽骨架和相互作用的結構域，其中肽骨架包含與SEQ ID NO11或14具有至少90％同一性的胺基酸序列。該肽骨架可以具有聚脯氨酸螺旋、短環區和α螺旋，其中肽骨架發生摺疊以使聚脯氨酸螺旋與α螺旋產生疏水相互作用。理想的肽骨架比具有SEQ ID NO1的肽更穩定。理想的肽基試劑比不具有相互作用的結構域的肽骨架更穩定。然而，某些相互作用的結構域的插入會使得肽骨架不穩定，對本領域技術人員來說這些去穩定化的肽基試劑仍然是有用的。
用於附著在，或插入，肽骨架的相互作用的結構域可以是由本領域技術人員選擇的任何有用的肽或分子。相互作用的結構域的例子包括結合結構域、抑制劑結構域、抗原識別肽、接頭、標記、固相支持物、和酶活性位點。本發明的一種肽基試劑具有相互作用的結構域，此處該肽包含SEQ ID NO18。
本發明還提供一種方法，包括定義含有靶蛋白上的相互作用位點的搜索範圍，該肽可與靶蛋白相互作用；為該肽定義大小；為該肽的胺基酸序列中各位置定義胺基酸類別；用已定義的胺基酸類別中的各成員取代該肽序列胺基酸序列的各位置以生成包括輸出肽序列集合(plurality)的輸出文庫文檔；將輸出文庫文檔傳輸給分子對接程序以使各輸出肽序列集合成員與搜索範圍擬合併產生靶蛋白質-肽序列擬合得分(fit score)；
根據靶蛋白質-肽序列擬合得分將輸出肽序列集合分級；以及展示各輸出肽序列集合成員及其關聯靶蛋白質-肽序列擬合得分；其中一部分輸出肽序列集合能夠與靶蛋白質穩定相互作用。
搜索範圍可以包括靶蛋白質中各非氫原子的x-、y-、和z-坐標。具有較高靶蛋白質-肽序列擬合得分的輸出肽序列常能以較高的親和力與靶蛋白質結合。該方法可進一步包括接受輸入百分數選擇以將輸出肽序列集合限制在一個確定的百分數；其中輸入百分數選擇可以限制輸出文庫文檔的大小和文庫的複雜性。各胺基酸類別可各自包括任一遺傳編碼的L-胺基酸、天然存在的非遺傳編碼L-胺基酸、合成的L-胺基酸、遺傳編碼胺基酸的D-對映異構體、天然存在的非遺傳編碼胺基酸的D-對映異構體、或合成的D-胺基酸。各胺基酸類別也可各自包括任一親水胺基酸、疏水胺基酸、類半胱氨酸胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、極性胺基酸、芳香族胺基酸、非極性胺基酸或脂肪族胺基酸。在一種實施方式中，靶蛋白質為牛胰蛋白酶且輸出肽序列之一為YKLKY(SEQ ID NO18)。
本發明還指向產生肽序列的系統，包括處理器；與處理器相連的存儲器；與處理器相連的顯示器；能夠在處理器上執行以產生肽序列的肽序列製備組件；能夠在處理器上執行以顯示肽序列製備組件所用的各胺基酸殘基的類別輸出組件；和能夠在處理器上執行以展示肽序列的肽序列輸出組件。一個顯示器的例子是印表機。輸出類別組件能顯示肽序列製備組件所用的各胺基酸殘基類別。
本發明進一步提供帶有與能指導機器完成某方法相關內容的機讀介質，該方法包括接收包含靶位上原子坐標集合的搜索範圍，肽集合能以不同的親和力與該靶位結合；接收包括很多胺基酸的肽長度參數；接收定義的、用於沿肽長各位置擬合分析的胺基酸結構類別；生成含有輸出肽序列集合的輸出文庫文檔，該輸出肽序列集合包括定義的、沿肽長各位置的胺基酸結構類別的每個胺基酸；繼而翻譯和旋轉與搜索範圍相關的肽內各位置上的胺基酸結構類別中的各成員，以隨之產生帶有靶位-肽序列擬合得分的肽序列；根據靶位-肽序列擬合得分將肽序列分級；以及顯示具有相關肽序列的所選擇的靶位-肽序列擬合得分百分比；由機讀介質完成的該方法可進一步包括顯示輸出肽序列標記和儲存搜索範圍。


附圖1提供SAP肽的DNA和胺基酸序列。星號表示終止密碼子。密碼子選擇偏好E.coli。如果SAP分子由重組方法產生則使用起始甲硫氨酸。如果肽分子由化學方法產生，則可省略甲硫氨酸殘基。
附圖2提供最終的SAP DNA序列。為便於克隆，為附圖1所示DNA序列添加了側翼核苷酸。5′Nde I位點以下劃線表示，3′Bam HI和內部Sma I位點以相同方式表示。
附圖3提供SAP肽的帶狀圖。鏈從左側的末端甲硫氨酸開始，且序列延伸進入聚脯氨酸螺旋、短環結構域，並最終進入右側的α螺旋區。肽以末端半胱氨酸為終點。
附圖4提供與附圖3相同視角的SAP肽分子結構，但是顯示了胺基酸側鏈。
附圖5突出顯示SAP分子中三個半胱氨酸殘基的位置。可以形成二硫鍵使SAP肽幾乎環化。末端半胱氨酸對將肽錨定在診斷裝置中的固體基質上有用。
附圖6提供SAP和牛胰蛋白酶間相互作用的ITC分析。SAP溶於20mM二甲基胂酸鹽(pH 7.0)、20mM NaCl，終濃度為2mM。將胰蛋白酶透析至相同的緩衝液中，並以20μM的濃度用於量熱計中。整個滴定過程中無明顯結合。溫度保持在30℃。採用每5μL注射40次，兩次注射間重新平衡240秒。
附圖7提供SAP-1和牛胰蛋白酶間相互作用的ITC分析。SAP-1溶於20mM二甲基胂酸鹽(pH 7.0)、20mM NaCl，終濃度為1mM。將胰蛋白酶透析至相同的緩衝液中，並以20μM的濃度用於量熱計中。溫度保持在20℃。採用每5μL注射40次，兩次注射間重新平衡240秒。
附圖8提供SAP-2和牛胰蛋白酶間相互作用的ITC分析。上欄25℃下，SAP-2(1.0mM)滴定至溶於20mM、pH 7.0二甲基胂酸鹽中的胰蛋白酶(20μM)的原始ITC數據。各峰顯示注射產生的熱量以及隨後的結合反應。下欄通過相對時間來整合各注射峰產生的結合等溫線。
附圖9圖示SAP在尿素中的解摺疊。
附圖10圖示SAP-1在尿素中的解摺疊。
附圖11圖示SAP-2在尿素中的解摺疊。
附圖12提供牛胰蛋白酶與SAP-1(實線)和SAP-2(虛線)結合(0至500秒)與解離(500至700秒)的表面等離子結合等溫線。
附圖13是本發明方法實施方式的流程圖。
附圖14是本發明方法作為產肽系統的實施方式的板塊圖。
附圖15是本發明方法另一實施方式的流程圖。
發明詳述本發明提供可以向其中引入一個或多個相互作用的結構域的穩定肽骨架。這樣的相互作用的結構域可以是特異結合結構域、抑制劑結構域、接頭、標記、固相支持物、反應位點、催化位點、有用的化學實體及試劑。相互作用的結構域向肽骨架的附著或引入產生肽基試劑。
本發明還提供產生可用作相互作用的結構域的肽文庫的方法。這些文庫的範圍可以從完全隨機和完全指定，到靶向和部分指定，和到高度靶向和最低程度指定。
定義術語「胺基酸序列」是指肽、多肽或蛋白質分子中的胺基酸位置排列和同一性。術語「胺基酸序列」的使用並不意味著將胺基酸序列限制為肽、多肽或蛋白質的完整、天然胺基酸序列。
「嵌合」用於表示由多於一個核酸片段組成且至少兩個核酸片段來源不同的核酸，例如載體或基因。這樣的核酸片段是經重組技術融合而成、天然不存在的核酸序列。
術語「編碼區」是指編碼感興趣肽、多肽或蛋白質的核苷酸序列。蛋白質編碼區以5′端編碼起始蛋氨酸的核苷酸三聯體「ATG」以及3′端的三個特異終止密碼子三聯體(即TAA、TAG、TGA)之一為界。
「組成型表達」是指用組成型啟動子進行的表達。
「組成型啟動子」是指能夠表達控制細胞生命周期所有或幾乎所有階段的基因的啟動子。
「互補的」或「互補性」用於定義核酸間鹼基配對或雜交程度。例如，如本領域技術人員公知的，腺嘌呤(A)可與胸腺嘧啶(T)形成氫鍵或鹼基對，鳥嘌呤(G)可與胞嘧啶(C)形成氫鍵或鹼基對。由是，A是與T互補的，且G是與C互補的。互補性可能是完全的，此時雙鏈核酸中的所有鹼基都是鹼基配對的。或者，互補性可能是「部分的」，此時核酸中只有某些鹼基是根據鹼基配對原則進行配對的。核酸鏈間的互補性程度影響核酸鏈間雜交的效率和強度。
參比核酸、蛋白質、多肽或肽的「衍生物」分別為具有與各自參比核酸、蛋白質、多肽或肽相關但不相同的序列或化學結構的核酸、蛋白質、多肽或肽。核酸、蛋白質、多肽或肽的衍生物通常是有目的地增強或引入一些在參比核酸、蛋白質、多肽或肽中沒有或很弱的化學、物理或功能特性。核酸的衍生物與參比核酸的核苷酸序列不同，而蛋白質、多肽或肽的衍生物分別與參比蛋白質、多肽或肽的胺基酸序列不同。這種序列差異包括一個或多個取代、插入、增加、缺失、融合和截斷，它們可以任一組合出現。差異可以是微小的(例如，一個核苷酸或胺基酸的差異)或者更實質性的。然而，衍生物序列與參比物不會差異到使得本領域技術人員無法識別該衍生物與參比物是結構和/或功能相關的程度。通常，差異是有限的以使參比物與衍生物整體上非常相似，並且在許多區域是相同的。「突變體」與「衍生的」核酸、蛋白質、多肽或肽不同，因為突變體可以帶有不顯著改變參比核酸、蛋白質、多肽或肽的化學、物理或功能特性的沉默結構差異。相反，參比物與衍生的核酸、蛋白質、多肽或肽之間的差異在於為改良參比核酸、蛋白質、多肽或肽的一種或多種化學、物理或功能特性而製造的有意的改變。
「表達」是指微生物中內源或外源核酸的轉錄和/或翻譯。表達通常是指mRNA的轉錄和穩定累積。表達也可以指蛋白質生產。
「表達盒」意指能指導特定核苷酸序列表達的核酸序列。表達盒通常包含與所要表達的核苷酸序列(例如，編碼區)可操作性連接的啟動子，該核苷酸序列與終止信號可操作性連接。表達盒也典型包含核苷酸序列正確翻譯所需的序列。含有感興趣核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的，這意味著其至少一個成分與其剩餘至少一個其它成分是異源的。表達盒中的核苷酸序列的表達可受組成型啟動子或僅當宿主細胞被暴露於某些特定外源刺激物時才引發轉錄的誘導型啟動子的控制。對於多細胞生物，啟動子也可以特異於特定的組織或器官或發展階段。
術語「同源性」是指核酸與參比核酸間或多肽與參比多肽間的相似程度。這樣的同源性可以是部分的或完全的。完全同源性是指核酸或胺基酸序列是相同的。部分同源的核酸或胺基酸序列是指一條與參比核酸或胺基酸序列不相同的核酸或胺基酸序列。因此，部分同源的核酸相對於其所比較的核酸來說在其序列中具有一個或多個核苷酸差異。同源性程度可通過序列比較來檢測。或者，如本領域技術人員所理解的，不同雜交條件下DNA-DNA或DNA-RNA的雜交可提供核酸間同源性程度的估計(參見，例如，Haines和Higgins(eds.)，核酸雜交，IRL Press，Oxford，U.K.)。
「雜交」是指通過在互補核酸鏈上的核苷酸鹼基間形成氫鍵使互補核酸鏈退火的方法。雜交，以及核酸間的結合強度，受例如所雜交核酸間互補程度、所用條件的嚴緊性、形成的雜交體的Tm值、核酸內的G∶C比率之類因素的影響。
「誘導型啟動子」是指在一種或多種細胞類型中可被外源刺激物，例如化學製品、光、激素、應力、溫度或病原體，開啟的可調型啟動子。
「起始位點」是指圍繞作為所轉錄序列一部分的第一個核苷酸，其被定義為位置+1，位置的區域。基因的所有核苷酸位置參照位於起始位點內的所轉錄序列的第一個核苷酸進行編號。下遊序列(即，3′方向序列)命名為正，上遊序列(即，5′方向序列)命名為負。
「分離的」或「純化的」核酸或「分離的」或「純化的」多肽是指藉助人的力量存在於其天然環境之外的核酸或多肽，因而其不再是天然產物。分離的核酸或多肽可以純化形式存在或存在於非天然環境例如轉基因宿主細胞中。
術語「標記」是指可用於提供可檢測(優選可定量的)信號、以及可附著於核酸、肽或蛋白質的任一原子或分子。標記可通過螢光、放射性、比色法、重量分析法、X-射線衍射或吸收、磁性、酶活力等方式提供可檢測信號。
術語「核酸」是指由含有蔗糖、磷酸和嘌呤鹼或嘧啶鹼的鹼基的單體(核苷酸)組成的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單或雙鏈形式的聚合物。除非特別限定，該術語包括含有天然核苷酸已知類似物的核酸，它與參比核酸具有類似的結合特性並以與天然形成核苷酸類似的方式代謝。另外除非指明，特定的核酸序列還暗含其保守修飾突變體(例如，簡併密碼子取代)和其互補序列、以及明確指出的其參比序列。
術語「開放閱讀框」和「ORF」是指編碼序列的翻譯起始和終止密碼子之間所編碼的胺基酸序列。術語「起始密碼子」和「終止密碼子」是指編碼序列中的一個由三個相鄰核苷酸組成的單位(『密碼子』)，它們分別特異指導蛋白質合成(mRNA翻譯)的起始和鏈終止。
「可操作性連接」意指結合成為同一核酸的分子的一部分，以使一部分的功能受另一部分的影響。通常，「可操作性連接」也指，兩個或更多個核酸適於定位或定向以使它們能夠共同發揮功能。常將核酸可操作性連接以允許從啟動子引發編碼區轉錄。例如，調控序列被稱作「可操作性連接於」或「結合於」編碼RNA或多肽的核酸序列，如果這兩條序列以使調控序列影響RNA或編碼區的表達(即，編碼序列或功能RNA受啟動子的轉錄控制)的方式定位。
「啟動子」是指通過為RNA聚合酶或其它正確轉錄所需因子提供識別位點來控制編碼區表達的核苷酸序列，通常位於編碼區上遊(5′)。「啟動子」包括但不限於最小啟動子——它是由TATA盒組成的短DNA序列。因此，啟動子包括其它特異服務於轉錄起始以及控制或調控表達的序列，例如增強子。相應地，「增強子」是指能夠促進啟動子活性的DNA片段，它可以是啟動子的內在元件或為增強啟動子水平或組織特異性而插入的異源元件。它在兩個方向都能操作(正向或反向)，並且甚至無論被移至啟動子的上遊或下遊都能起作用。啟動子可以整個源自某一天然基因，或者由源自自然界中發現的不同啟動子的不同元件組成，或者甚至由合成的DNA片段組成。啟動子也可以含有結合根據生理或發育條件控制轉錄起始效果的蛋白質因子中所涉及的DNA片段。
此處術語「蛋白質」、「肽」和「多肽」可以互換使用。
「調控序列」和「調控元件」指控制核酸序列表達的某些方面的核苷酸序列。這樣的序列或元件可以位於編碼序列的上遊(5′非編碼序列)、內部、或下遊(3′非編碼序列)。「調控序列」和「調控元件」影響轉錄、RNA加工或穩定性、或相關編碼序列的翻譯。調控序列包括增強子、內含子、啟動子、多腺苷酸化信號序列、拼接信號、終止信號、和翻譯前導序列。它們包括天然的和合成的序列。
如此處所使用的，術語「選擇性標記」是指編碼可觀察或可選擇性狀的基因，這些性狀在具有該基因的生物中得以表達並能夠被檢測。選擇性標記常與不編碼可觀察性狀的感興趣核酸連接，以追蹤或選擇感興趣核酸的出現。任何本領域技術人員已知的選擇性標記都可用於本發明的核酸。某些可選擇性標記允許在不帶該標記時會死亡的宿主存活。可選擇性標記的例子包括抗生素抗性，例如，四環素或氨苄青黴素抗性。
如此處所使用的，術語「嚴緊性」用於定義核酸雜交時溫度、離子強度、及含有其它化合物例如有機溶劑的條件。高「嚴緊條件」下，核酸鹼基配對只出現在具有高頻互補鹼基序列的核酸之間。在「弱」或「低」嚴緊條件下，核酸的互補序列頻率通常較低，從而能夠檢測和/或分離具有不同序列的核酸。
術語「實質上相似」和「實質上同源」是指代表與當前發明序列功能等價物的核苷酸和胺基酸序列。例如，單純表現遺傳密碼簡併但編碼與本發明的胺基酸序列相同的胺基酸序列的改變核苷酸序列是與本發明序列實質上相似的序列。此外，與當前序列實質上相似的胺基酸序列是那些整體胺基酸同一性足以提供穩定肽骨架的胺基酸序列。例如，與本發明序列實質上相似的胺基酸序列是那些與本發明的胺基酸序列相比整體胺基酸同一性為80％或更高，優選90％或更高，例如91％，92％，93％或94％，甚至更優選95％或更高，例如96％，97％，98％或99％。
參比核酸、蛋白質、多肽或肽的「突變體」，分別是具有與各自的參比核酸、蛋白質、多肽或肽相關但不同的序列的核酸、蛋白質、多肽或肽。突變體與參比核酸、蛋白質、多肽或肽的差異是沉默或保守差異。突變體核酸與參比核酸的核苷酸序列不同，而突變體核酸、蛋白質、多肽或肽分別與參比蛋白質、多肽或肽的胺基酸序列不同。突變體與參比核酸、蛋白質、多肽或肽可能區別於序列中的一個或多個取代、插入、增加、缺失、融合和截斷，它們可以任一組合出現。差異可以是微小的(例如，一個核苷酸或胺基酸的差異)或者更實質性的。然而，突變體與參比物的結構和功能不會差異到使得本領域技術人員無法識別該突變體與參比物在結構和/或功能上是相關的。通常，差異是有限的以使參比物與突變體整體上非常相似，並且在許多區域是相同的。
術語「載體」用來指可將另一個或多個核酸片段轉移入細胞的核酸。「載體」包括可以自我轉移或移動的任一雙或單鏈、線性或環狀形式的質粒、粘粒、噬菌體或核酸。它可以通過整合進入細胞基因組或存在於染色體外(例如，具有複製原點的自主複製質粒)轉化原核或真核宿主細胞。細菌系統中使用的載體常包含允許載體獨立於細菌染色體複製的複製源。術語「表達載體」是指含有表達盒的載體。
術語「野生型」是指具有自天然來源分離的該基因或基因產物特徵的基因或基因產物。野生型基因是指在群體中最常觀察到的基因形式，且因此其被專門定為基因的「正常」或「野生型」形式。相反，術語「突變體」或「衍生物」是指與野生型基因或基因產物相比在序列和/或功能特性上呈現修飾的基因或基因產物(即，改變了的特徵)。可以分離天然產生的衍生物。根據與相比野生型基因或基因產物它們具有改變了的特徵這一事實來鑑定它們。
肽骨架本發明肽骨架其序列涉及稱作鳥胰多肽(Avian PancreaticPolypeptide)的小而穩定的肽。APP是通過其N-和C-末端與其受體結合的胰腺激素(Gehlert等人，1996；Gingerich等人，1991；Fuhlendorf等人，1990)。APP有三十六個胺基酸，形成一級結構與眾不同的肽。(Hazelwood，1990，reviewed by Cerda-Reverter和Larhammar，2000)。通常，具三十六個胺基酸的肽會因太短而不能提供足夠穩定特有構象的堆積能。然而，APP肽卻由於結合二級和三級相互作用而非常穩定(Bjornholm和Jorgensen，1993；Kruger等人，1985)。該肽起始於伸出的聚脯氨酸螺旋，接著是短環區，長α螺旋，並終止於一段無序短鏈。聚脯氨酸螺旋和α螺旋平行導致螺旋間接觸區域內形成顯著的範德華力和疏水相互作用(Blundell等人，1981)。該相互作用穩定摺疊的肽結構。APP已被那些對分子動力學模擬及蛋白質摺疊預測感興趣的研究人員用作模型系統(參見，例如，Alexander和MacKerell，1991)。
野生型APP序列如下列SEQ ID NO1)所示GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRY與APP序列相反，本發明肽骨架經過修飾以改造成更適於診斷應用的分子。為形成本發明肽骨架的一個實例而改變的殘基以粗體字示於上述SEQ ID NO1中。在一種實施方式中，Tyr27被Trp取代(SEQID NO2，GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQWLNV VTRHRY)。此胺基酸取代改善疏水核心內的堆積並提供有用的內源光譜探針。在另一實施方式中，將Glyl變成Met-Cys(SEQ ID NO3，MCPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRY)。這一改變使分子能夠通過重組方法製備，其中在大腸桿菌中轉錄和翻譯需要起始Met。在另一實施方式中，在位置30添加半胱氨酸殘基(替換Val30)以與在N-末端添加的半胱氨酸形成穩定二硫鍵(SEQ ID NO4，MCPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNC VTRHRY)。在另一實施方式中，用Pro替換Asp11以形成對螺旋間環結構域更穩定的紐結，並作為向肽骨架編碼的核酸中導入特異Sma I位點的途徑(SEQ ID NO5，GPSQPTYPGD PAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRY)。類似地，可以將Ala12改成Gly以提供肽骨架編碼的核酸內的Sma I位點(SEQ ID NO6，GPSQPTYPGD DGPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRY)。可以將序列RHRY(SEQID NO7)從SEQ ID NO1中除去，因為該序列涉及APP受體結合。除去RHRY(SEQ ID NO7)後，可以添加兩個丙氨酸殘基以正確間隔並定向末端半胱氨酸殘基(SEQ ID NO8，GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTAA)。可以添加C-末端Cys以使肽骨架螯合併正確定向於形成診斷儀器一部分的金或其它固相支持物或表面(SEQ ID NO9，GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRYC；或(SEQ ID NO10，GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTC)。
這樣的序列變化已被用於產生具胺基酸序列SEQ IDNO11(MCPSQPTYPGD PGPVEDLIRFYDNLQQWLNCVTAAC)所示的35胺基酸肽骨架。在另一本發明實施方式中，肽骨架不帶起始蛋氨酸。相反，該肽具有SEQ ID NO14(CPSQPTYPGD PGPVEDLIRF YDNLQQWLNC VTAAC)。
核苷酸序列SEQ ID NO12是可編碼SEQ ID NO11的核酸的一個例子。
M C P S Q P T Y P G D P G PATG TGC CCG AGC CAG CCG ACC TAT CCG GGC GAT CCC GGG CCGV E D L I R F Y D N L Q Q WGTG GAA GAT CTG ATC CGC TTT TAT GAT AAC CTG CAG CAG TGGL N C V T A A C *CTG AAC TGC GTG ACC GCC GCC TGC TAG核苷酸序列SEQ ID NO13是可編碼SEQ ID NO11的核酸的另一個例子。
1 11 21 31 41ACACACCATATGTGCCCGAG CCAGCCGACC TATCCGGGCG ATCCCGGGCCTGTGTGGTAT ACACGGGCTC GGTCGGCTGG ATAGGCCCGC TAGGGCCCGG51 61 71 81 91GGTGGAAGAT CTGATCCGCT TTTATGATAA CCTGCAGCAG TGGCTGAACTCCACCTTCTA GACTAGGCGA AAATACTATT GGACGTCGTC ACCGACTTGA101111121131GCGTGACCGC CGCCTGCTAGGGATCCACAC ACCGCACTGGCG GCGGACGATC CCTAGGTGTG TG以下給出野生型APP(SEQ ID NO1)與本發明肽骨架SEQ IDNO14的比較。
SEQ ID NO1 GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRYSEQ ID NO14CPSQPTYPGD PGPVEDLIRF YDNLQQWLNC VTAAC可在具有SEQ ID NO2～6或SEQ ID NO8～11或SEQ ID NO14之任一序列的肽骨架上進行插入。這種插入的一個常規位置是在環區中心附近的脯氨酸-11殘基和甘氨酸-12殘基之間。若用具SEQ IDNO12的核酸產生具脯氨酸-11殘基和甘氨酸-12殘基間插入的肽基試劑，則插入應當在SEQ ID NO12的核苷酸36和37之間。
許多由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2～6、8～11或14共有的胺基酸在肽內形成重要的分子內接觸並在保持肽中的穩定及構象中起作用。然而，骨架序列的某些可變性並不對肽骨架穩定性產生不利影響。因此，本發明還指向本發明肽骨架的突變體和衍生物，例如，SEQ IDNO2～6、8～11或14的突變體和衍生物。
本發明肽骨架的衍生物和突變體經在參比肽骨架的N-末端和/或C-末端缺失或添加一個或多個胺基酸；在參比肽骨架內在一個或多個位點上缺失或添加一個或多個胺基酸；或在參比肽骨架內在一個或多個位點上取代一個或多個胺基酸而衍生自參比肽骨架。因此，本發明肽骨架可經包括胺基酸取代、缺失、截斷和插入的不同途徑進行改變。
這樣的突變體和衍生物肽可經，例如人工操作，產生。這樣的操作方法是本領域公知的。例如，肽的胺基酸序列突變體可由DNA中突變製備。誘變方法和核苷酸序列改變也是本領域公知的。參見，例如，Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)；Kunkel等人，Methods in Enzymol.，154，367(1987)；美國專利No.4,873,192；Walker和Gaastra，eds.，Techniques in Molecular Biology，MacMillanPublishing Company，New York(1983)以及其中所引用文獻。有關不會不利影響感興趣肽的結構完整性和/或生物活性的適宜胺基酸取代的指導可獲自Dayhoff等人的模型，Atlas of Protein Sequence and Structure，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，C.D(1978)，在此引作參考。
本發明肽骨架衍生物和突變體其部分與SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列的胺基酸位置具有至少約90％、91％、92％、93％或94％的同一性，且這樣的部分通常具有與具SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一的肽骨架相似的穩定性和整體三維結構。在一個理想的實施方式中，肽骨架衍生物和突變體其部分與SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列的胺基酸位置具有至少約95％或96％的同一性，且這樣的部分通常具有與具SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一的肽骨架相似的穩定性和整體三維結構。在一個更理想的實施方式中，肽骨架衍生物和突變體其部分與SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列的胺基酸位置具有至少約97％或98％的同一性，且這樣的部分通常具有與具SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一的肽骨架相似的穩定性和整體三維結構。
肽骨架及肽骨架衍生物和突變體的胺基酸殘基可以是遺傳編碼L-胺基酸、天然存在的非遺傳編碼L-胺基酸、合成的L-胺基酸或上述任一的D-對映異構體。此處所用的二十個遺傳編碼L-胺基酸和常見非編碼胺基酸的胺基酸符號是依據慣例的，示於表1。
表1


包含在本發明範圍內的肽突變體可以帶有由具有相似化學和/或物理特性的胺基酸取代的一個或多個胺基酸，只要這些突變體肽的骨架部分保持與具SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一的肽骨架相似的穩定性和整體三維結構。肽骨架衍生物可以帶有附加的肽或化學成分以及由具有不同的化學和/或物理特性的胺基酸取代的一個或多個胺基酸，只要這些肽骨架衍生物具有與具SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一的肽骨架相似的穩定性和整體三維結構。
可相互取代以形成本發明突變體肽的胺基酸通常屬於相似的類或亞類。正如本領域技術人員公知的，可主要依據胺基酸側鏈特徵將胺基酸分為三個主要類別親水胺基酸、疏水胺基酸和類半胱氨酸胺基酸。這些主要類別可進一步分作亞類。親水胺基酸包括帶有酸性、鹼性或極性側鏈的胺基酸，疏水胺基酸包括帶有芳香或非極性側鏈的胺基酸。非極性胺基酸可進一步細分為包括，在其中，脂肪族胺基酸。此處所使用的胺基酸類別定義如下「疏水胺基酸」是指帶有在生理pH下不帶電荷並被水溶液排斥側鏈的胺基酸。遺傳編碼的疏水胺基酸例子包括Ile、Leu和Val。非遺傳編碼的疏水胺基酸例子包括t-BuA。
「芳香族胺基酸」是指帶有包含至少一個帶共軛π-電子系統環(芳香基團)側鏈的疏水胺基酸。芳香基團可進一步用取代基例如烷基、鏈烯基、炔基、羥基、磺醯基、硝基或氨基基團以及其它基團取代。遺傳編碼的芳香族胺基酸例子包括苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。常見的非遺傳編碼芳香族胺基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、β-2-噻吩基丙氨酸、1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸、4-氯苯基丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸和4-氟苯基丙氨酸。
「非極性胺基酸」是指帶有在生理pH下通常不帶電荷的側鏈且為非極性的疏水胺基酸。遺傳編碼的非極性胺基酸例子包括甘氨酸、脯氨酸和蛋氨酸。非遺傳編碼的非極性胺基酸例子包括Cha。
「脂肪族胺基酸」是指帶有飽和或不飽和直鏈、支鏈或環烴側鏈的非極性胺基酸。遺傳編碼的脂肪族胺基酸例子包括Ala、Leu、Val和Ile。非遺傳編碼的脂肪族胺基酸包括Nle。
「親水胺基酸」是指帶有被水溶液吸引的側鏈的胺基酸。遺傳編碼的親水胺基酸例子包括Ser和Lys。非遺傳編碼的親水胺基酸例子包括Cit和hCys。
「酸性胺基酸」是指帶有pK值小於7的側鏈的親水胺基酸。生理pH下由於氫離子的丟失酸性胺基酸通常帶有負電荷側鏈。遺傳編碼的酸性胺基酸例子包括天冬氨酸(aspartate)和穀氨酸(glutamate)。
「鹼性胺基酸」是指帶有pK值大於7的側鏈的親水胺基酸。生理pH下由於結合水合氫離子鹼性胺基酸通常帶有正電荷側鏈。遺傳編碼的鹼性胺基酸例子包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。非遺傳編碼的鹼性胺基酸的例子包括非環狀胺基酸鳥氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
「極性胺基酸」是指帶有在生理pH下不帶電荷的具有側鏈的親水胺基酸，但該側鏈帶有一個其兩個原子的共用電子對離一個原子更近的鍵。遺傳編碼的極性胺基酸例子包括天冬醯胺和穀氨醯胺。非遺傳編碼的極性胺基酸例子包括瓜氨酸、N-乙醯基賴氨酸和甲硫氨酸亞碸。
「類半胱氨酸胺基酸」是指帶有能與另一胺基酸殘基側鏈形成共價鍵，例如二硫鍵，的側鏈的胺基酸。典型地，類半胱氨酸胺基酸通常帶有包含至少一個巰基(SH)基團的側鏈。遺傳編的類半胱氨酸胺基酸例子包括半胱氨酸。非遺傳編碼的類半胱氨酸胺基酸例子包括高半胱氨酸和青黴胺。
正如本領域技術人員所理解的，上述分類並不是絕對的。有幾種胺基酸表現多於一種特性，因而可被包括在多於一種類別中。例如，酪氨酸同時具有芳香環和極性羥基基團。因此，酪氨酸具有雙重特性，可以被同時包括在芳香和極性類別中。類似地，半胱氨酸能形成二硫鍵外還具有非極性特徵。因此，儘管半胱氨酸並不是嚴格地被分為疏水或非極性胺基酸，它在許多物質中可被用來賦予多肽以疏水性。
幾個常見的非遺傳編碼可存在於本發明多肽突變體中、或可取代本發明多肽突變體中的胺基酸的胺基酸包括但不限於，β-丙氨酸(b-Ala)和其它ω-胺基酸例如3-氨基丙酸(Dap)、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸，等等；α-氨基異丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸(MeGly)；鳥氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；t-丁基丙氨酸(t-BuA)；t-丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基異亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；環己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯基丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯基丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯基丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯基丙氨酸(Phe(4-F))；青黴胺(Pen)；1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩基丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亞碸(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙醯基賴氨酸(AcLys)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；2，4-二氨基丁酸(Dbu)；p-氨基苯基丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基纈氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)和高絲氨酸(hSer)。這些胺基酸也落入上述定義的類別。
上述遺傳編碼和非編碼胺基酸的分類概括於下表2中。應當理解，表2的目的僅僅是列舉而不是一個對此處所述突變體和衍生物多肽中可能含有的胺基酸的窮舉。可用於產生此處所述突變體和衍生物多肽的其它胺基酸殘基可得自，例如，Fasman，1989，CRC PracticalHandbook of Biochemistry and Molecular Biology，CRC Press，Inc..，以及其中所引用的文獻。此處未明確提及的胺基酸可依據已知性狀和/或它們與已明確鑑定胺基酸相比的特徵性化學和/或物理特性方便地歸類於上述類別中。
表2


本發明肽骨架可具有由任一類似分類胺基酸取代的胺基酸來產生突變體肽，只要肽突變體具有與具SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一的肽骨架相似的穩定性和整體三維結構。
儘管本發明的肽骨架可具有可變區，本領域技術人員仍可以根據既定目的選擇不變的骨架結構。因此，本領域技術人員可利用不變的骨架結構形成肽基試劑庫或肽文庫。不變骨架結構的化學和物理特性將保持不變，且任何結合、溶解度、穩定性或其它生物學、化學或物理特性的變化都是由附著於肽骨架的化學或肽部分引起的。
本發明的肽骨架是比較小的。這意味著為預期目的使用了引入肽骨架的肽基試劑的高比率的分子物質。因此，例如，當抗原識別位點附著於或引入肽骨架時，就產生一個很小的肽基試劑，它模擬大很多的抗體的結合特性。
這樣的肽基「抗體」試劑比抗體更穩定，具有較少的抗原表位且易於人工製備和生產。
相互作用的結構域根據本發明，相互作用的結構域可被附著於或引入本發明的肽骨架，例如，SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一。這樣的相互作用的結構域可以是任何由本領域技術人員選擇的分子或部分。有用的相互作用的結構域包括，例如，特異結合結構域、抑制劑結構域、接頭、標記、固相支持物、酶活性位點、催化位點、有用的化學實體和試劑等。
本發明提供的相互作用的結構域的例子還包括編碼牛胰蛋白酶抑制劑部分識別序列的肽(PYRIRF，分子中殘基561至566，SEQ IDNO15)和用此處所述文庫搜索程序以牛胰蛋白酶作為靶蛋白質鑑定的肽(YKLKY，SEQ ID NO18)。一種將SEQ ID NO15的相互作用的結構域與SEQ ID NO11的肽骨架結合的肽基試劑具有SEQ ID NO21(CPSQPTYPGDPPYRIRFGPVEDLIRFYDNLQQWLNCVTAAC)。一種將SEQ ID NO18的相互作用的結構域與SEQ ID NO11的肽骨架結合的肽基試劑具有SEQ ID NO22(CPSQPTYPGDPYKLKYGPVEDLIRFYDNLQQWLNCVTAAC)。
可產生肽文庫以提供大量的相互作用的結構域。例如，可產生肽文庫以用作受體的抑制劑、結合劑、配體和抗原識別位點。在一種實施方式中，肽被設計用於與靶蛋白質、核酸或抗原相互作用。靶蛋白質、核酸或抗原內的特異位點或序列可用於靶向與文庫所提供肽的相互作用。被鑑定具適宜特性的肽之後可用於引入或附著於本發明的肽骨架。
通常，選擇輸入或靶蛋白質或核酸與文庫肽相互作用。本領域技術人員可以選擇任何感興趣的靶蛋白質或核酸。例如，靶蛋白質可以是抗原、抗體、酶、激素、受體、配體、DNA-結合蛋白、膜關聯蛋白、或任何結構蛋白。輸入或文庫肽可以結合靶核酸位點的例子包括啟動子、增強子、多聚腺苷酸化位點、內含子、拼接信號、終止信號、和翻譯前導序列。
定義了輸入或靶蛋白質或核酸的搜索範圍。這一搜索範圍定義肽將與之相互作用或結合的位點的物理和化學特性。例如，搜索範圍可以包含蛋白質或核酸上肽相互作用位點中所有非氫原子的x、y和z坐標。定義該搜索範圍可能考慮的其它參數包括電荷、親水性、疏水性、距離和輸入或靶蛋白質或核酸內原子的方向。
本領域技術人員可以選擇文庫肽的長度。例如，理想的文庫中肽可以是約1至約30個胺基酸長度。更理想的文庫中肽可以是約1至約25個胺基酸長度。甚至更理想的文庫中肽可以是約1至約20個胺基酸長度。甚至更理想的文庫中肽可以是約2至約15個胺基酸長度。甚至更理想的文庫中肽可以是約2至約10個胺基酸長度。特別理想的文庫中肽可以是約2至約8個胺基酸長度。
在一種實施方式中，肽長度約為一至六個胺基酸長。最初的建模研究，包括長程分子動力學模擬，表明可將多達六個胺基酸殘基插入環部分的中心而不會對分子穩定性產生消極影響。這六個胺基酸可能編碼對靶蛋白質或核酸具有結合親和力和特異性的相互作用的結構域。
本領域技術人員可以選擇在文庫內的肽中各位置上發生多少胺基酸取代。類似地，使用者可以選擇任一胺基酸組合將其置於文庫肽中的給定位置。例如，熟練技術人員可以選擇將任何類別或類型的胺基酸置於給定位置。這樣的一類胺基酸可以，例如，是一類遺傳編碼的L-胺基酸、天然存在的非遺傳編碼L-胺基酸、合成的L-胺基酸、遺傳編碼胺基酸的D-對映異構體、天然存在的非遺傳編碼胺基酸的D-對映異構體、或合成的D-胺基酸。其它的胺基酸類別包括親水胺基酸、疏水胺基酸、類半胱氨酸胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、極性胺基酸、芳香族胺基酸、非極性胺基酸或脂肪族胺基酸。上文給出了胺基酸類別及類型的進一步例子。
之後將所選擇的肽文庫文檔用作向對接程序的輸入，該對接程序(docking program)將各肽與靶蛋白質或核酸上的搜索範圍擬合。可用一些分子對接程序，例如，Molecular Simulations Inc(MSI)的程序LigandFitTM。該對接程序提供為各種肽類型提供擬合得分。輸出文檔可以根據肽擬合得分分級排序。最高得分肽是潛在最適於與輸入靶蛋白質或核酸相互作用的。
在一種實施方式中，該方法包括附圖13中所概括的幾個步驟。一個步驟是定義一個搜索範圍1302。這一搜索範圍是所選擇的位於靶蛋白質上肽可與之相互作用的相互作用位點。本發明的相互作用肽結構域可與搜索範圍相互作用。搜索範圍可以是，例如，結合位點、抗原識別位點、活性位點、抑制劑結合位點等。
該方法中可以包括的另一個步驟是定義肽的大小1304。如此處所述，肽可以具有各種長度。例如，肽可以是約1至約30個胺基酸長。
該方法中可以包括的附加步驟是為肽的胺基酸序列中各位置定義胺基酸類別1306。如此處所提供的，本領域技術人員肽的胺基酸序列各位置可以具有獨特的化學和物理特性。因此，具有相關物理結構、或具有特定化學特性、或具有特定溶解特性的胺基酸可形成該類別。
在另一步驟中，胺基酸的每個成員可以被重複取代或置於肽中指定位置以產生一個輸出文庫文檔1308。這一輸出文庫文檔包含輸出肽序列集合，每個都具有一個獨特肽序列。
該方法中可以包括的附加步驟是將輸出文庫文檔傳輸給分子對接程序1310。該分子對接程序能將輸出肽序列集合各成員與搜索範圍擬合併隨之產生靶蛋白質-肽序列擬合得分。這樣的靶蛋白質-肽序列擬合得分是對給定肽將與該搜索範圍內發生多好的相互作用、結合或擬合的一個度量。具有高靶蛋白質-肽序列擬合得分的肽通常將很好地與靶蛋白質或靶核酸中所選擇位點發生相互作用、結合或擬合。
在該方法的另一步驟中，輸出肽序列集合可根據靶蛋白質-肽序列擬合得分進行分級1312。這一分級允許對哪個肽將最有效地與靶蛋白質或靶核酸上的所選擇位點發生相互作用、結合或擬合作出即時的評估。
該方法中可以包括的附加步驟是展示輸出肽序列集合各成員及其關聯靶蛋白質-肽序列擬合得分1314。輸出肽序列集合中至少一部分能夠與靶蛋白質穩定相互作用。因此，本領域技術人員可以選擇列出所有輸出肽序列。
或者，除了列出所有可能的肽序列及其關聯擬合得分，當輸入百分比時可以只顯示高端得分值肽的百分數。或者，程序可以隨機選擇所有可能肽的某個特定百分比以寫出最終的結構文檔。這一百分數的選擇可以限制輸出文庫文檔的大小和/或文庫複雜性。
在另一實施方式中，本發明提供用於產生肽序列的系統(參見附圖14)。這一系統可以包括處理器1402。處理器可以連接存儲器1404和/或顯示器1406。該系統還可包括能夠在處理器上執行以產生肽序列的肽序列製備組件1408。輸出標籤或類別組件1410能在處理器上執行以顯示肽序列製備組件所用的各胺基酸殘基類別。該系統還可包括能夠在處理器上執行以展示肽序列的輸出肽序列組件1412。
個人計算機(PC)中的處理器，例如微處理器是響應並處理驅動計算裝置基本指令的邏輯電路。計算裝置包括個人計算機、膝上型電腦、通常用途的計算機等。存儲器電子儲存計算裝置可理解的指令和數據的地方。常規操作中，存儲器通常包含作業系統、應用程式和數據。存儲器的種類包括隨機存儲器(RAM)、只讀存儲器(ROM)、可編程存儲器(PROM)和可擦可編程ROM(EPROM)以及儲存設備例如硬碟驅動器和軟盤。顯示器是計算機向計算機使用者顯示文本以及常顯示圖形的輸出裝置。顯示器的例子包括印表機、顯示器等。
在一種實施方式中，類別輸出組件能顯示肽序列製備組件所用的各胺基酸類別殘基。
在另一實施方式中，本發明提供一種帶有與能指導機械完成某方法相關內容的機讀介質。該方法可以是上述方法之一。
在機讀介質上完成的方法也可以是附圖15中闡明的包括下述步驟的方法。在該方法的一個步驟中包括接收搜索範圍1502。如上所述，搜索範圍可以為靶位上的原子提供坐標集合，肽集合能以不同親和力與該靶位結合。
在另一步驟中，該方法可以包括接收肽長度參數的步驟1504。這一肽長度參數可以是對肽中所含胺基酸數量的定義。
一個可被包括的附加步驟涉及接收定義的、用於沿肽長各位置擬合分析的胺基酸結構類別1506。該步驟中，使用者可以定義將何種胺基酸類型和類別置於肽序列的預期位置。
在另一步驟中，該方法可以包括生成包括輸出肽序列集合的輸出文庫文檔1508。該輸出肽序列是含有來自各定義的沿肽長各位置胺基酸結構類別的的肽序列集合。
可包括在該方法中的一個附加步驟包括隨後的翻譯和旋轉肽內各位置胺基酸結構類別1510的各成員。該翻譯和旋轉的完成與搜索範圍有關以隨之產生帶有靶位-肽序列擬合得分的肽序列。
在另一步驟中，該方法可以包括根據靶位-肽序列擬合得分將肽序列分級1512。如上所述，這一分級允許對哪個肽將最有效地與靶蛋白質或靶核酸上的所選擇位點發生相互作用、結合或擬合作出即時的評估。
可包括在該方法中的一個附加步驟包括顯示一個選擇的靶位-肽序列擬合得分百分比和關聯肽序列1514。
該方法還可包括用靶位-肽序列擬合得分和關聯肽序列構建理想的肽結構1516。
可包括在該方法中的一個附加步驟包括顯示用於輸出肽序列的標記和/或儲存搜索範圍。
一個用此處所述的篩選程序以牛胰蛋白酶作為靶蛋白質而選擇出的肽相互作用的結構域例子是YKLKY(SEQ ID NO18)。該相互作用的結構域肽被置於SEQ ID NO11肽骨架中以產生一個具有SEQ IDNO22(CPSQPTYPGDPYKLKY GPVEDLIRFYDNLQQWLNCVTAAC)的肽(也叫做SAP-2)。該文庫程序選擇出的肽與牛胰蛋白酶結合良好。作為比較，將來自牛胰蛋白酶抑制劑的天然肽(PYRIRF，分子中殘基561至566，SEQ ID NO15)插入SEQ ID NO11肽骨架以產生SEQ IDNO21(CPSQPTYPGDPPYRIRFGPVEDLIRFYDNLQQWLN CVTAAC)(也叫做SAP-1)。該具有SEQ ID NO22的文庫選擇肽與具有SEQ ID NO21的天然選擇肽相比具有略低的牛胰蛋白酶結合親和力。然而，將肽SEQ IDNO15或18插入SEQ ID NO11肽骨架產生比不帶插入的肽骨架更穩定的肽基試劑。因此，本發明的方法也可用於產生非常穩定的肽基試劑。
在一種實施方式中，肽相互作用的結構域具有抗原識別特異性。這一抗原識別肽相互作用的結構域可被構建進或附著於肽骨架上以產生具抗原識別能力的肽基試劑。含有肽相互作用的結構域的抗原識別元素是插入肽骨架中選擇性插入位點的短肽。以肽骨架不會喪失穩定性來選擇該插入位點。由於這樣的肽相互作用的結構域的穩定插入使抗原識別肽的構型熵相對於自由肽來說降低了，從而對抗原識別肽的結合特異性和親和力產生積極影響。肽骨架內的一個適宜插入位點的例子是具SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列肽的環部分中。一個理想的插入位點位於脯氨酸-11殘基和甘氨酸-12殘基之間。
本發明的抗原識別肽相互作用的結構域可用本發明的肽文庫搜索程序或通過鑑定現有抗體的抗原結合結構域進行鑑定。也可通過常規方法製備抗體以鑑定有用的抗原結合肽相互作用的結構域。
多克隆抗體的製備是本領域技術人員熟知的。參見，例如，Green等人在ImmunochemicalProtocols(Manson，ed.)中第1～5頁(HumanaPress)的Production of Polyclonal Antisera；Coligan等人在CurrentProtocols in Immunology，2.4.1部分中的Production of PolyclonalAntisera in Rabbits，Rats Mice and Hamsters，它們在此引做參考。
同樣地，單克隆抗體的製備也是常規的。參見，例如，Kohler Milstein，Nature，256495(1975)；Coligan等人，sections 2.5.1～2.6.7；和Harlow等人，AtibodiesA Laboratory Manual中第726頁(Cold Spring Harbor Pub.(1988))，它們在此引做參考。單克隆抗體可通過多種已經良好建立的技術自雜交瘤中分離和純化。這樣的分離技術包括蛋白質-A瓊脂糖親和層析、大小排阻層析、和離子交換層析。參見，例如，Coligan等人，2.7.1～2.7.12部分和2.9.1～2.9.3部分；Barnes等人，在Methods in Molecular Biology，第10卷第79～104頁(Humana Press(1992)的Purification of Immunoglobulin G(IgG)。
編碼肽基試劑的重組表達編碼本發明的肽骨架、肽基試劑和抗原識別肽的核酸可用於這些肽的重組表達。一般，可通過將核酸導入適宜在特定類型宿主細胞中使用的表達載體中進行本發明肽編碼核酸的重組表達。
可將本發明的核酸導入並在任一宿主生物中表達，例如，在原核或真核宿主細胞中都可以。宿主細胞的例子包括細菌細胞、酵母細胞、培養的昆蟲細胞系、以及培養的哺乳動物細胞系。優選，選擇以本領域技術人員想要的方式加工和翻譯後修飾初生肽的重組宿主細胞系統。如果翻譯後處理不挑剔的話，則可以選擇任一便利的宿主生物。為了表達並分離大量的本發明肽骨架、肽基試劑和抗原識別肽，理想的是使用原核生物，例如，大腸桿菌。因此，本發明提供含有本發明表達載體的宿主細胞。
可將要導入的核酸置於表達盒內在感興趣生物體中表達。該表達盒含有與本發明核酸連接的轉錄起始區。表達盒優選還帶有多個用於將核酸插入使其在不同轉錄調控元件控制下的限制位點。該表達盒此外還包含選擇性標記基因。若需要正確起始轉錄和/或對初級RNA轉錄物進行正確加工可將合適的控制元件例如增強子/啟動子、拼接點、多腺苷酸化信號等放在基因編碼附近。或者，本發明表達載體中所用編碼區可包含內源性增強子/啟動子、拼接點、插入序列、多腺苷酸化信號等、或內源與外源控制元件的組合。
優選載體中的核酸受適宜啟動子或宿主細胞中用於轉錄的調控元件的控制並與之可操作性連接。載體可以是在多個宿主中有功能的雙功能表達載體。轉錄盒通常包括在生物體中有功能的5′-3′轉錄方向、啟動子、轉錄和翻譯起始區、感興趣的DNA序列、以及轉錄和翻譯終止區。終止區可以是天然對應轉錄起始區的、可以是天然對應感興趣DNA序列的、或可以是衍生自其它來源的。
重組核酸在原核和真核細胞中的有效表達通常需要指導得到的轉錄物的有效終止和多聚醯苷酸化的調控元件。轉錄終止信號通常位於多腺苷酸化信號下遊且長數百個核苷酸。此處所用術語「多聚A位點」或「多聚A序列」表示指導轉錄終止和初始RNA轉錄物多聚醯苷酸化的核酸序列。由於不帶多聚A尾巴的轉錄物不穩定並迅速被降解，重組轉錄物需要進行有效的多聚醯苷酸化。
可用本領域技術人員已知的方法將編碼本發明肽骨架、肽基試劑和抗原識別肽的核酸導入細菌宿主細胞中。例如，可通過常用的轉化方法，例如用氯化鈣或電擊處理，將這樣的核酸導入細菌細胞。如果要在真核宿主細胞中表達本發明的肽骨架、肽基試劑和抗原識別肽，則可通過許多方法將編碼這些肽的核酸導入真核細胞，包括磷酸鈣共沉澱、原生質體融合、電擊法等方法。當真核宿主細胞為酵母細胞時，可通過醋酸鋰或電擊處理宿主細胞來影響轉化。
因此，本發明的一個方面是提供含有編碼本發明肽骨架、肽基試劑和抗原識別肽的核酸的表達載體和宿主細胞。本領域可獲得的表達載體範圍廣泛。可以在其它地方找到有關不同表達載體及其使用方法的說明，美國專利No.5,604,118、5,583,023、5,432,082、5,266,490、5,063,158、4,966,841、4,806,472、4,801,537和Goedel等人，GeneExpression Technology，Methods of Enzymology，第185卷，AcademicPress，San Diego(1989)。可輔助用於本發明製備及用途方面的重組DNA和分子克隆技術描述於Sambrook等人，Molecular CloningALaboratory Manual Vol.1-3，Cold Spring Harbor laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.(2001)；Ausubel(ed.)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley和Sons，Inc..(1994)；T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；和by T.J.Silhavy，M.L.Berman，and L.W.Enquist的Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.(1984)。
診斷和治療方法本發明的肽基試劑可用作治療方法或診斷方法或儀器的基礎。該具有抗原識別相互作用的結構域的肽基試劑可替代抗體。具有酶催化位點或酶活性位點為相互作用的結構域的肽基試劑可替代酶。具有抑制劑為相互作用的結構域的肽基試劑可替代抑制劑使用。因此，本發明所提供的肽基試劑其利用是非常廣泛的。
尤其可將這樣的肽基試劑用於任一本領域技術人員已知的檢測感興趣核酸或蛋白質的步驟。例如，本發明的肽基試劑可用於任意分子生物學檢測步驟，包括任何酶檢測、抑制檢測或免疫檢測。生物物理檢測步驟可與這些步驟結合使用，或根據本領域技術人員的指示分別使用。這樣的步驟包括，例如，表明等離子共振技術、螢光、側流技術。這些步驟形成檢測和鑑定測試樣品中靶蛋白質和核酸的強勁有效方法。
在一種實施方式中，本發明提供一種檢測測試樣品中靶蛋白質或核酸的方法，包括將肽基試劑與測試樣品接觸並檢測肽基試劑是否與測試樣品中的靶蛋白質或核酸結合。當肽基試劑具有抗原識別肽為其相互作用的結構域時，在某溫度及足以發生抗原-抗體相互反應的條件下實施檢測方法一段時間。這樣的溫度、時間和條件可由本領域技術人員很容易的決定。例如，可在約4℃至42℃下將肽基試劑與含有蛋白質或核酸提取物的樣品在適宜的緩衝液中溫育約5分鐘至24小時。之後測定或檢測肽基試劑與蛋白質或核酸之間所形成的複合物的存在及量，例如，通過測定或檢測與肽基試劑附著的標記。
本發明的肽基試劑可適應任何本領域技術人員已知的免疫檢測。例如，可將肽基試劑用於例如那些涉及放射免疫檢測、ELISA、或免疫螢光檢測的方法。因此，例如，適於使用本發明肽基試劑的免疫檢測包括那些在美國專利No.3,791,932；3,817837；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876中所述的。
在肽基試劑與蛋白質或核酸之間的複合物形成的檢測或測定包括檢測標記、報告分子或其它可檢測部分。這樣的標記、報告分子或可檢測部分可與肽基試劑或靶蛋白質或核酸的池結合。
可用於當前方法的測試樣品包括，例如，來人體或動物的生理液體和樣品、食物樣、水、土壤、以及採自工作區、工作檯、架、食品儲存區、動物或禽類圍欄、或採自皮膚、毛髮或動物體表面的樣品。這樣的應用包括人體疾病狀態檢測。
本發明的檢測儀器包括與固相支持物穩定結合或連接的肽基試劑。該固體可以是本領域技術人員已知的任何應用支持物。例如，該固相支持物可以是珠粒、過濾器、微量滴定盤、或生物感應晶片。
本發明還包括含有帶有一種本肽基試劑的裝置或容器的試劑和試劑盒。試劑或試劑盒可以包括帶有肽基試劑的生物傳感器、或試管、微量滴定板或其它用於實施檢測方法的物體。為便於測試或使方法或裝置更加便利，試劑盒可設計包含與測試、方法或裝置相關的對照樣品。試劑盒還可包含實施本發明方法的溶液，例如，稀釋測試樣品的溶液、溫育測試樣品與生物傳感器或檢測裝置的溶液、以及將未結合的測試樣品洗滌除去的溶液。試劑盒還可含有在與樣品接觸前或接觸中用於與生物傳感器或檢測裝置接觸的阻斷劑。理想的對照物和其它溶液是無菌的，且不含對與肽基試劑結合產生幹擾的物質。
本發明試劑盒中還可提供檢測形成於肽基試劑與靶蛋白質或核酸之間的複合物的標記或報告分子。這樣的標記或報告分子可與生物傳感器、檢測裝置或肽基試劑分開包裝。
標記的肽基試劑本發明還提供標記的肽基試劑。可使用的標記包括放射性核、螢光標記、化學發光標記、比色染料、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、酶亞單位、金屬離子、顆粒等。常用作報告分子或標記的放射性同位素包括32P、125I及131I。常用作報告分子或標記的酶包括，例如鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶和葡糖氧化酶。常用的螢光報告分子或標記包括，例如，染料例如異硫氰酸螢光素(FITC)、螢光素、羅丹明、異硫氰酸羅丹明B(RITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)、4，4′-二異硫氰基茋-2，2′-二磺酸(DIDS)。參見，例如，美國專利No.3,766,162、3,791,932、3,817,837、和4,233,402。其它的常用標記或報告分子類型包括德克薩斯紅(Texas red)、藻紅素、7-羥基香豆素、魯米諾、NADPH等。
可用於檢測和定量標記存在的各種的技術依賴於標記的性質。對於螢光標記，可以得到大量不同的螢光計和螢光顯微鏡。對於化學發光標記，可以得到發光計或薄膜。產生螢光、化學發光或有色產物的酶可用於螢光、發光、分光光度或可視化檢測。這樣的標記可用於此處所述的免疫檢測和雜交檢測。
將標記附著於肽和/或核酸的許多方法都是本領域技術人員已知的。已報導的將標記附著於核酸的方法的例子，例如，Leary等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1983)804045；Renz和Kurz，Nucl.AcidRes.(1984)123435；Richardson和Gumport，Nucl.Acid Res.(1983)116167；Smith等人，Nucl.Acid Res.(1985)132399；和Meinkoth和Wahl，Anal，Biochem.(1984)138267。可經羧基、巰基、氨基、或肼其它官能度將標記結合於肽基試劑而不會對肽的功能或肽與靶的結合產生有害影響。
通過以下實施例得以進一步描述本發明。
實施例該實施例描述肽骨架自一個稱作鳥胰多肽的小而穩定肽的產生，以及設計和構建DNA序列以製備該新肽。還描述了用於發現可插入親體肽骨架以產生特異抗原結合元件的肽序列的電腦程式。提供了一個實施例顯示可以製備與牛胰蛋白酶結合的重組模塊式抗原識別分子。
材料和方法細菌生長條件及培養根據Miller(1972)所述完成。除非另外指明，本研究中完成的所有方法都根據Maniatis等人(1982)或Sambrook等人(1989)所述進行；包瓊脂糖凝膠電泳和限制性內切酶消化。所有PCR反應中所用的VentTMDNA聚合酶購自New England Biolabs，並與所提供的緩衝液使用。由Genosys，Inc.用Applied Biosystems，Inc.的自動測序儀完成DNA測序(Sanger等人，1977)。由Genosys，Inc.合成DNA寡核苷酸。根據Bradford的方法(1976)用牛血清清蛋白(BSA)為標準測定蛋白質濃度。根據Siegel和Monty(1966)用BioRad，Inc.的7×250mm BioSelect SEC-125柱完成分析凝膠過濾試驗。所有細菌菌株均購自New England Biolabs，Inc.。蛋白質SDS PAGE凝膠根據Laemmli(1970)進行製備、運行和處理。除特別指明外，化學試劑和層析樹脂來自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。
分子建模分子建模用了兩個可視化程序，Swiss PDB Viewer(Guex和Peitsch，1997)和Rasmol(Sayle和Milner-White，1995)。用CompaqPC，Windows 2000以及Silicon Graphics，Inc.的Octane UNIX工作站完成模型工作。此外，在Octane上使用Molecular Simulations，Inc.的Cerius2分子堆積。用於起始建模研究的三維結構文檔下載自蛋白質資料庫(Protein Databank)(文檔1PPT.ENT)。進行幾輪連續的胺基酸缺失和取代以將野生型APP分子轉化為適合診斷應用的模塊肽。
之後用GROMOS 96力場將最終模型能量最低化，以及用SYBYL力場進行幾輪分子力學幾何優化(Clark等人，1989)。之後對最終最低化/優化的模型進行不良相互作用和扭力幾何學分析。最終定下來的蛋白質以及三維模型命名為SAP。對於合成的(基於同源性建模)抗體肽來說這是短的。SAP是可向其中插入特異性的6-mer結合序列的親體分子。
基因設計、構建及克隆用標準遺傳密碼反向翻譯最終的SAP胺基酸序列。根據大腸桿菌偏好選擇密碼子，這意味著為某一特定胺基酸所選擇的最終密碼子是大腸桿菌中該胺基酸最常、或第二常用的密碼子。全長結構基因為111bp(包括終止密碼子)。為建立該基因序列，合成了10個跨越編碼區的單鏈寡核苷酸。寡核苷酸長度範圍是18至28個核苷酸。每個寡核苷酸相互互補，這樣當與結合伴侶雜交時，所獲得的片段含有中央雙鏈區，其各末端為一段單鏈8核苷酸區。寡核苷酸序列示於表3。
基因構建包括三個獨立步驟。首先，將5μg各寡核苷酸及其互補結合伴侶(對於5個獨立的反應)混合於10mM Tris-HCl(pH7.2)、10mM NaCl中，終體積為10μL。特異寡核苷酸雜交是(參見表3)(1a和1b)、(2a和2b)、(3a和3b)、(4a和4b)、和(5a和5b)。95℃水浴加熱混合物10分鐘。關閉熱源，讓整個水浴經5小時冷卻至室溫。其次，混合這五個「慢速冷卻」反應各自的等分量(10μL)(終體積50μL)。將試管於45℃加熱10分鐘，之後置於冰浴中。將T4 DNA連接酶和緩衝液(New England Biolabs)加入試管，於16℃溫育反應(終體積60μL)20小時。第三，用兩個與結構基因5′和3′最末端互補的PCR引物(表3、6a和6b)從片段混合物中選擇全長結構基因。這確保只有全長基因產物能被擴增。用1μL連接混合物完成如下PCR反應95℃1分鐘；49℃1分鐘；72℃30秒。於Techne Progene PCR儀中完成30個該程序循環。最後一個PCR循環之後再於72℃溫育10分鐘。用DNA瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR反應產物。
PCR反應產物經Promega的DNA Wizard PCR純化試劑盒純化製備用於克隆。首先，在ATP存在下用T4 DNA聚合酶處理DNA片段以確保形成完全雙鏈末端。根據New England Biolabs，Inc.的用法說明書完成該反應。用Promega的DNA Wizard PCR純化試劑盒再次純化DNA。其次，DNA用Nde I和Bam HI消化並經乙醇沉澱純化。將最終的DNA重懸於少量10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA中。
克隆載體，pET11a(Novagen)，經Nde I和Bam HI消化並用Promega的DNA純化試劑盒純化。該消化產生包含與DNA片段適合的末端的線性載體。該組合確保片段定向、符合讀框的克隆。將載體與插入物以大約1∶15的摩爾比混合併於16℃在T4 DNA連接酶存在下連接20小時(總反應體積為20μL)。用5μL連接反應物轉化感受態JM109細菌。在LB/60μg/mL氨苄青黴素瓊脂平板上生長後，選擇單個克隆，用Promega的小量製備DNA分離試劑盒經小量製備方法從克隆純化質粒DNA。經DNA凝膠電泳、限制性內切酶消化、以及最後的DNA測序評估分離的質粒。質粒結構命名為pSAPe。
純化SAP表達策略在整個表達系統中使用Novagen的T7 RNA聚合酶。包含表達質粒結構的BL21(DE3)細胞37℃下於補加有0.5％葡萄糖和自1％接種物的60μg/mL氨苄青黴素的Luria液體培養基中生長。細胞A595值達0.8時(接種後大約3小時內)加入IPTG至終濃度為0.5mM。細胞在收穫前再生長5個小時。典型地，每升得到5g細胞。
細胞於10,000×g下離心10分鐘成塊並重懸於一體積的10mMTris-HCl，pH8.0。將細胞如上述再次離心並於-70℃冷凍至少2小時。將冷凍塊重懸於二倍體積的10mM Tris-HCI，pH8.0。於French Press(一次，20,000psi)中裂解混合物。獲得的抽提物經12,000×g下離心20分鐘而澄清，於20mM Tris-HCl(pH7.4)、100mM NaCl、1mM EDTA(緩衝液I)中透析上清液。透析物用緩衝液I稀釋至終濃度2.5mg/mL，稱作級分I。隨後的所有層析步驟於室溫下10mMTris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA中完成。
將級分I加於5cm×1.8cc2Mono-Q離子交換柱。結合材料使用如下梯度僅緩衝液，40mLs；接著是100mM NaCl，40mLs；和由100mM至500mM NaCl的線性梯度，200mLs。約50％APP肽(及突變體)經梯度從柱中洗脫出來。級分中的蛋白質含量用SDS PAGE可視化，併集中含APP的級分，於10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA中透析，並經半透膜(Amicon)壓力過濾濃縮至10mg/mL。最終的濃縮收集物稱作級分II。
將級分II加於Sephadex G-75柱(110cm×7.6cc2)。收集經SDSPAGE可視化鑑定的峰級分。G75收集物稱作級分III。該級分包含同源APP肽並被用於下述試驗。
生產SAP-2
以大腸桿菌密碼子用法將牛胰蛋白酶抑制劑識別序列的一部分(PYRIRF，分子中殘基561至566，SEQ ID NO15)轉換成DNA序列5′-CCGTATCGCATCCGCTTT(SEQ ID NO16)。用上述方法產生帶有Sma I位點側翼的雙鏈序列5′-CCCGGGCCGTATCGCATCCGCTTTCCCGGGSEQID NO17GGGCCCGGCATAGCGTAGGCGAAAGGGCCC-5′SEQ ID NO17雙鏈DNA用Sma I消化並克隆進經Sma I消化的去磷酸化pSAPe。DNA測序驗證重組克隆。如上所述表達純化SAP-2(SEQ ID NO21)肽。
新肽發現編寫FORTRAN 90程序以產生退化肽文庫。該編碼允許使用者選擇肽長度(1～6胺基酸)、各位置可發生多少胺基酸取代(0至20)、以及使用者是否想隨機選擇所有可能肽的某個確定百分數以寫出最終的結構文檔。這一最終特徵用於限制文檔大小和文庫複雜性。程序，稱作MKPEPS，輸出的是單一文檔，它包含蛋白質中所有非氫原子的XYZ坐標。之後將肽文庫文檔作為向對接程序的輸入(使用MSI程序LigandFit，儘管任何可獲得的分子對接程序都可以)。對接程序將各肽與基於靶蛋白質的搜索範圍進行擬合併輸出擬合得分。輸出文檔是分級排序的，且最高得分肽潛在為最強的結合物。對牛胰蛋白酶運行一個這樣的肽文庫。將最高得分肽，YKLKY(SEQ ID NO18)，轉換成DNA序列TATAAACTGAAGTAT(SEQ ID NO19)。添加Sma I側翼序列，並如上所述製備得到具下述結構的雙鏈。
5′-CCCGGGTATAAACTGAAGTATCCCGGGSEQ ID NO20GGGCCCATATTTGACTTCATAGGGCCC-5′將插入物經Sma I消化後克隆進經Sma I消化的去磷酸化pSAPe。DNA測序證實克隆。如上所述表達純化SAP-3。
熱量測定用MicroCal，Inc.的VP-ITC儀器完成等溫滴定量熱(ITC)。向1.4mL攪拌反應細胞注射5μL抑制劑溶液(在濃度範圍0.5mM至2.0mM下)實施滴定。APP和APP衍生物在細胞中的濃度範圍是50至80μM。抑制劑和酶都溶於20mM二甲基胂酸鈉(pH 5.5-7.0)、40mMNaCl，或20mM Tris-HCl(pH 7.0-7.5)、40mM NaCl。滴定在20℃和40℃下進行。滴定的典型試驗條件是持續注射10秒、注射間歇240秒，共注射40次。為校準稀釋熱和混合熱，進行抑制劑向緩衝液的空白滴定。
獨立的一套多個結合位點是最常見的結合試驗評估模型。根據(Freire等人，1990)檢測總熱量分析液Q=VH[[L]+1+[M]nK-(1+[M]nK-[L]K)2+4K[L]2K]]]>其中Q為總熱量，V為細胞體積，ΔH為焓，M為大分子濃度(細胞中的結合伴侶)，n為結合化學計量，L為配體濃度(注射器中的結合伴侶)，以及K為結合常數。用Origin version 5(MieroCal，Inc.)將數據與該模型擬合。
結合常數以下列關係式與van′t Hoff焓相關(lnKT)P=HVHRT2]]>其中定義，K=e-GRT]]>結合自由能以下式與結合焓相關ΔG＝ΔH-TΔS或根據Gibbs-Helmholtz方程引入熱容數據
Gbind(T0)=H(T0)-T0[(H(T)-G(T))T+Gpln(T0T)]]]>其中ΔG為Gibbs結合自由能，T0為參比溫度，以及ΔCp為熱容。根據兩個不同穩定下的量熱測定焓算出ΔCp值GP=HT2-HT1T2-T1=ST2-ST1ln(T2T1)]]>通過測定兩種已知電離焓的不同緩衝液中的結合表觀焓，可以測定結合事件中轉化的淨質子數ΔHapp＝ΔHcor+nΔHlonlz其中ΔHcor是所測pH下的實際結合熱。其符號表示質子的轉移方向。
表面等離子共振用BiaCore，Inc.的BiaCore-X表面等離子共振(SPR)儀測定牛胰蛋白酶和SAP-1或SAP-2間相互作用。以10μl每分鐘的流速用50mM N-羥基琥珀醯亞胺、0.2M N-乙基-N′-(二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺激活羧甲基葡聚糖傳感器晶片(CM-5)10分鐘。巰基偶聯劑PDEA(2-(2-pyridinyldithio)ethaneamine hydrochloride)以80mM濃度、10μl每分鐘的流速通過激活表面5分鐘。濃度為50ng/μL的SAP-1或SAP-2以10μl每分鐘的流速與激活表面偶聯10分鐘。50mM l-半胱氨酸、1M NaCl以10μl每分鐘的流速流過傳感器表面5分鐘使最終表面失活。緩衝液改為磷酸緩衝鹽溶液(PBS)且濃度範圍為1至100nM的牛胰蛋白酶以20μl每分鐘的流速流過傳感器表面。
對於這一類型的反應，A+B←→AB，其中A為自由流動的配體以及B為固定配體，SPR信號(R)的改變是與複合物AB的形成(結合相)或解離(解離相)成比例的。因此對於結合相傳感器反應為(Morton等人，1995)
R(t)=ckacka+kdRmax(1-e-(cka+kd)t)+Rb]]>如果結合物質中的所有結合位點被佔用，Rmax是測量的應答，c為配體濃度，Rb為配體注射的基線信號的改變。解離相可根據下式計算R(t)=R0e-kdt]]>其中R0為解離開始時的SPR信號。FFT慣例分別使結合等溫線中的結合與解離部分變得平滑。用Microcal，Inc.的Origin完成最終的動力學分析(O′Shannessy等人，1993)。
化學變性通過在尿素存在下在Shimadzu RF5301螢光計中經內源色氨酸螢光(Lakowicz，1983)測定蛋白質的解摺疊完成對蛋白質穩定性的測定。激發和發射波長分別為295nm和340nm。激發和發射單色計縫隙都設為1.5nm。將持續增加量的尿素(濃度範圍為0至6.8M)與蛋白質(20μM)混合，將樣品於室溫下溫育10小時以確保達到解摺疊平衡。根據下述關係式(Pace等人，1989)將相對螢光轉換為自由能值G=-RTln[(yf-yiyi-yu)]]]>其中yf和yu分別為完全摺疊和完全解摺疊DST的相對螢光值，yi為解摺疊中間產物的相對螢光值，T為絕對溫度，以及R為氣體常數。將關係式ΔG對[尿素]的線性回歸和外推用於檢測無變性劑存在下的自由能值(ΔGH20)。類似地，解摺疊蛋白質(Fu)級分可以根據以下關係式從螢光數據算出(Pace等人，1989)FU=(yf-yiyf-yu)]]>結果為以人工改造(engineer)可用於診斷應用的分子，SAP建模產生若干個胺基酸改變。產生的第一個改變是用Trp取代Tyr27。這可以幫助重新堆積疏水核心並提供一個有用的內源光譜探針。將Gly1變成Met-Cys。這一變化使分子得以經重組方法產生，其中必需一個起始Met以在大腸桿菌中進行轉錄/翻譯。人工產生Cys殘基以與添加於位置30的第二個Cys(替換Val30)形成一個穩定的二硫鍵。用Pro替換Asp11以形成一個對螺旋間環結構域更穩定的紐結，並作為向DNA序列中導入特異Sma I位點的一個途徑。類似地，可以將Alal2改成Gly以使DNA序列內的Sma I位點完整。刪除序列RHRY，因為該序列涉及APP受體結合。在序列末端添加兩個丙氨酸以正確間隔並定向末端半胱氨酸殘基。這一最後的Cys用於將SAP肽螯合併正確定向於作為診斷儀器一部分的金或其它固相支持物或表面。
原來的野生型APP序列和最終的SAP胺基酸序列如下所示。改變的殘基以粗體字顯示。SAP長為35個殘基。
SEQ ID NO1 -Wt APPGPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRYSEQ ID NO14 -SAP CPSQPTYPGD PGPVEDLIRF YDNLQQWLNC VTAAC保留的胺基酸中有許多形成與肽的關鍵接觸並在保持肽的穩定性和構象中起作用。附圖1示出SAP胺基酸序列以及大腸桿菌密碼子偏好的DNA序列。在位於環區中心的殘基P11和G12間產生所有插入。這與在核苷酸36和37間的插入對應。
為合成該結構基因，製備一雙鏈DNA序列。為便於克隆進表達載體，將側翼限制性酶切位點引入到DNA序列中。最終的SAP結構基因雙鏈DNA序列示於附圖2。表3所示的寡核苷酸1～6用於構建附圖2所示的DNA序列，其中各寡核苷酸對各有一個A和B成員。
表3用於基因構建和PCR反應的寡核苷酸對1～6

SAP的最終GROMOS能量最低化結構示於附圖3～5。胺基酸變化未導致結構不穩定，增加的色氨酸加強了螺旋界面核心的疏水性。附圖5以空間填充形式示出三個半胱氨酸。Cys2和Cys31之間形成一個二硫鍵。如將在以下顯示的，該二硫鍵大大提高SAP相對於野生型APP的穩定性。SAP肽，以及SAP-1和SAP-2突變體有效表達並純化自大腸桿菌。典型的產量(未優化)約為15～25mg/L。
用等溫滴定量熱法(ITC)測定了SAP、SAP-1、和SAP-2結合牛胰蛋白酶的能力。附圖6清楚表明，SAP不具備對胰蛋白酶的天然結合親和力。在所有試驗條件下，未檢測到結合。而另一方面如附圖7所示，SAP-1顯示出對胰蛋白酶的顯著結合特異性。
分析附圖7的結合等溫線得到以下熱動力學參數化學計量0.975+/-0.02ΔH(kcal/mol) -26.1+/-1.45ΔS(cal mol-1K-1) -11.6+/-2.2Ka(M-1) 1.65×106+/-4.5×104溫度(K) 293
該結果表明，SAP-1和胰蛋白酶間的相互作用是由焓驅動的，也即，ΔH為負。正如ΔS為負值所證明的，該反應不是由熵促成的。然而，由於焓項的數量級大於熵項，TΔS，因此整體自由能(ΔG)為負。在更高的溫度下進行結合反應得到以下熱動力學參數化學計量0.99+/-0.03ΔH(kcal/mol) -15.4+/-2.05ΔS(cal mol-1K-1) -21.1+/-1.8Ka(M-1) 2.40×106+/-3.7×104溫度(K) 303該結合反應由焓促成，不由熵促成，以及由總體能量促成。這使ΔCp為-0.51kcal/mol K，表明結合反應燃燒少量的可靠近表面區域(ΔASA)。這些結果顯示，可單純通過在環區結構域中央插入六個胺基酸來使SAP分子成為有功能的結合試劑。從任意肽組合都可用於改變或變更結合特異性這一意義上來說，SAP試劑是模塊式的。試劑的整體結構不改變(親體骨架)，這使它成為廣泛診斷檢測中的一個相當有用的組分。SAP結構的保守性對於純化也是一個幫助，它將保存期、以及與在側流診斷檢測中將材料與支持物和珠粒表面相連有關的化學特性標準化。
牛胰蛋白酶和SAP-2間的相互作用示於附圖8。插入肽，YKLKYSEQ ID NO18)，顯示與胰蛋白酶的結合，儘管其親和力略低於衍生自牛胰蛋白酶抑制劑的肽。仍可用MKPEPS電腦程式(生成由使用者定義的肽文庫結構文檔)和自動分子對接重新設計結合序列。因此可結合SAP肽與建模軟體得到無限數量的新穎抗原(或分析物)結合試劑。圖8所示的ITC等溫線可用於得到以下SAP-2和胰蛋白酶結合的熱動力學參數。
化學計量0.995+/-0.06ΔH(kcal/mol) -31.2+/-2.30ΔS(cal mol-1K-1) -16.2+/-1.22Ka(M-1) 6.4×105+/-5.3×103
概念的驗證是用MKPEPS-SAP系統、以適度高的親和常數、不經任何對插入肽序列的任何優化就可以產生焓驅動的結合反應。通過用MKPEPS產生的簇集於YKLKY(SEQ ID NO18)(或其它前導肽插入序列)周圍的序列完成靶向對接反應有可能提高平衡親和常數。也可能利用對於出自科技或專利文獻的肽的SAP系統，或使用象噬菌體展示這樣的分子技術。
不同緩衝液中SAP-1和SAP-2與牛胰蛋白酶抑制劑結合的量熱分析表明，對於SAP-1未發生質子轉移而導致結合(n＝0.01)，對於SAP-2結合從蛋白質向肽轉移了一個質子(n＝1.12)。
在含尿素的情況下檢測SAP的穩定性，如附圖9所示。解摺疊曲線對應-3.1kcal/mol的天然自由能以及2.5M尿素的m1/2值。這些數字將用作與SAP環插入突變體的比較依據。解摺疊曲線顯示，未發生如許多胰多肽所證實的二聚化現象(例如-Kanazawa和Hamaguchi，1986；Chang等人，1980；Noelken等人，1980)。因此，有可能野生型肽中的一個或若干個突變導致產生完全單體的肽。對有用的類抗體診斷試劑來說，這是一個重要的觀測現象和必需要求。類抗體試劑與聚苯乙烯或金珠或側流檢測中的捕捉帶偶聯是單體的並不是傾向於多聚化的，這很重要。
令人驚奇的是，SAP-1比SAP穩定2.0kcal/mol。建模不立即顯示自由能變化的結構原因。為了完全理解這一現象，現在正在對該肽進行結晶嘗試(Wood等人，1977)。但是，由環插入提供的穩定性使SAP-1更適宜作診斷工作。如附圖10所示，SAP-1具有-5.1kcal/mol的天然自由能和和4.0M尿素中相應的m1/2值。
當尿素存在時SAP-2發生解摺疊這證明了類似的穩定化現象。附圖11示出受尿素濃度影響產生的解摺疊級分。等溫線分析再次表明SAP-2以相對SAP(0.1kcal/mol相對SAP-1)為2.1kcal/mol的天然狀態穩定的。SAP-2解摺疊反應的m1/2是4.05M尿素。試驗參照的自由能關係式在SAP、SAP-1和SAP-2建模中僅得到定性反映。插入序列中的六個胺基酸出現在上限。分子建模中不明顯的短期效應例如溶解反應或許促進肽的穩定性。這樣的穩定性在如此大小的肽中是不常見。
SAP-1和SAP-2與結合牛胰蛋白酶的結合動力學反映出ITC試驗所闡述的熱動力學關係。附圖12示出牛胰蛋白酶結合於SAP-1或SAP-2表面的結合等溫線。SAP-1/胰蛋白酶反應的動力學速率常數為1.3×105(ka)和1.7×10-2(kd)。SAP-2和胰蛋白酶相互作用的動力學速率常數為8.2×104(ka)和6.9×10-2(kd)。結合等溫線清楚的顯示，SAP-1和SAP-2可經C-末端半胱氨酸巰基以仍可影響結合的方式被正確導向於某個表面。
肽文庫MKPEPS程序在生成用作分子對接程序輸入的肽文庫方面是非常多樣的。該文庫的範圍可以從完全隨機和完全指定，到靶向和部分指定。該隨機因素允許試驗人員對所有或選定的肽序列空間區域進行採樣。該指定因素通過從全部生成的文庫(選擇因素)中取每個第i個(ith)肽來減少最終文庫中的肽總數挑選因素。這減少了對接計算時間。對MKPEPS文庫的仔細篩選和對自動對接搜索範圍標準的選擇是有利的i)縮減整體計算時間，ii)提高得到有意義目標的可能性(也就是，提高對接得分與試驗平衡親和常數的相關性)，以及iii)降低對象噬菌體展示這樣的大量勞動的依賴性。
MKPEPS程序的設計標準和流程示於表4。
表4.
MKPEPS程序流程圖。
1)主程序是一個稱作mkpeps的shell腳本。它可以用幾個分類符(specifiers)運行。它們都和以下4個版本匹配i)mkpeps Runs @mkpepsii)mkpeps class Runs @outtagsiii)mkpeps peps Runs @outpepsiv)mkpeps help 輸出幫助信息2)有三個用Fortran代碼程序編譯的主程序@mkpeps 根據使用者說明生成一個csd肽文檔@outtags 輸出@mkpeps所用殘基的可能標籤/類別@outpeps 輸出所有20個胺基酸的簡寫
3)代碼目錄包含以下文檔(第一欄列出各程序行數)59 classtags.f233 initaa.f101 initpeps.f101 libpeps.f23 mkpeps.f42 outaa.f229 outpep.f12 outpeps.f12 outtags.f46 ran3.f403 setup.f24 aa.h9 peps.h4 tags.h12 98＝＝TOTAL4)@mkpeps流程圖表mkpeps----initpeps [在共用模塊中將肽初始化]--initaa [從etc/aa20.sd讀取aa結構；鑑定 骨架原子並保存於共用模塊； 翻譯和旋轉aa′s s.t.並以N為原 點、NCC在x-z平面內； 在共用模塊中將信息初始化]--setup-- | [提供aa使用者界面以設置aa文 | 庫] | --classtags [在共用模塊中設置aa標記]--outaa [輸出outaa.sd，其包含已翻譯和旋 轉的aa′s]--libpeps | [構建文庫並將其輸出至一個輸出 | 文檔]
 | --outpep [構建既定序列的肽結構]5)@outtags流程圖表outtags----classtags [在共用模塊中建立aa標記]-outtags輸出aa標記6)@outpeps流程圖表Outpeps----initpeps[在共用模塊中將肽初始化]-Outpeps 輸出類別7)所有程序的共用模塊為aaI(在aa.h中) 包括aa殘基的所有整數變量aaC(在aa.h中) 包括aa殘基的所有特徵變量aaR(在aa.h中) 包括aa原子的三維位置pepback(在aa.h中) 包括aa殘基的骨架信息peps(在peps.h中) 包括所有aa’s的單字母名稱、三字母名稱及全稱8)在tags.h中發布與類別/標籤相關的變量，儘管為了確保陣列大小一致而將變量通過子程序。
結論該項工作已經表明，有可能人工重造鳥胰多肽以生產可作為潛在的抗體替代物而用於免疫組織化學診斷檢測的模塊式結合試劑。向結構中引入胺基酸改變以提高分子穩定性並提供附加功能。設計、合成了該新肽的基因序列，並將其在大腸桿菌表達系統中使用以生產肽。產生了SAP系統的兩個突變體。第一個突變體包含衍生自牛胰蛋白酶抑制劑的六個胺基酸插入。該分子與牛胰蛋白酶結合。第二個突變體包含用自動肽文庫結構形成和分子對接的重新發現的五胺基酸序列。該分子也與牛胰蛋白酶結合。SAP分子非常穩定，這是部分因為重堆積的疏水核心和增加的二硫鍵。因此，由於可將多至六個胺基酸插入親體分子的柔性環部分，可用SAP系統生成無限數量的結合試劑。
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權利要求
1.穩定的分離肽，其含有與SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一具有至少90％同一性的胺基酸序列。
2.穩定的分離肽，其含有SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列。
3.權利要求1或2的穩定分離肽，其中肽具有聚脯氨酸螺旋、短環區以及α螺旋，且其中肽發生摺疊以使聚脯氨酸螺旋與α螺旋產生疏水相互作用。
4.權利要求1或2的穩定分離肽，其中肽比具有SEQ ID NO1的肽更穩定。
5.權利要求1或2的穩定分離肽，其中肽含有與SEQ ID NO11或14具有至少90％同一性的胺基酸序列。
6.穩定的分離肽，其含有SEQ ID NO11或14。
7.權利要求6的穩定分離肽，其中肽具有聚脯氨酸螺旋、短環區以及α螺旋，且其中肽發生摺疊以使聚脯氨酸螺旋與α螺旋產生疏水相互作用。
8.權利要求6的穩定分離肽，其中肽發生摺疊並經二硫鍵進一步穩定。
9.權利要求6的穩定分離肽，其中肽比具有SEQ ID NO1的肽更穩定。
10.分離的核酸，其編碼含有與SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一具有至少90％同一性的胺基酸序列的穩定肽。
11.權利要求10的分離的核酸，其中肽含有與SEQ ID NO11或14具有至少90％同一性的胺基酸序列。
12.分離的核酸，其編碼含有胺基酸序列SEQ ID NO11或14的穩定肽。
13.權利要求12的核酸，其中核酸含有SEQ ID NO12或13。
14.含有肽骨架和相互作用的結構域的肽基試劑，其中肽骨架含有與SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一具有至少90％同一性的胺基酸序列。
15.含有肽骨架和相互作用的結構域的肽基試劑，其中肽骨架含有SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列。
16.權利要求14或15的肽基試劑，其中肽骨架具有聚脯氨酸螺旋、短環區和α螺旋，且其中肽骨架發生摺疊以使聚脯氨酸螺旋與α螺旋產生疏水相互作用。
17.權利要求14或15的肽基試劑，其中肽骨架比具有SEQ IDNO1的肽更穩定。
18.權利要求14或15的肽基試劑，其中肽基試劑比不具有相互作用的結構域的肽骨架更穩定。
19.權利要求14或15的肽基試劑，其中相互作用的結構域是結合結構域、抑制劑結構域、抗原識別肽、接頭、標記、固相支持物或酶活性位點。
20.權利要求14或15的肽基試劑，其中相互作用的結構域是含有SEQ ID NO18的肽。
21.權利要求14或15的肽基試劑，其中肽骨架含有與SEQ IDNO11或14具有至少90％同一性的胺基酸序列。
22.含有肽骨架和相互作用的結構域的肽基試劑，其中肽骨架含有SEQ ID NO11或14。
23.權利要求22的肽基試劑，其中肽骨架具有聚脯氨酸螺旋、短環區和α螺旋，且其中肽骨架發生摺疊以使聚脯氨酸螺旋與α螺旋產生疏水相互作用。
24.權利要求22的肽基試劑，其中肽骨架發生摺疊並經二硫鍵進一步穩定。
25.權利要求22的肽基試劑，其中肽骨架比具有SEQ ID NO1的肽更穩定。
26.權利要求22的肽基試劑，其中肽基試劑比不具有相互作用的結構域的肽骨架更穩定。
27.權利要求22的肽基試劑，其中相互作用的結構域是結合結構域、抑制劑結構域、抗原識別肽、接頭、標記、固相支持物或酶活性位點。
28.權利要求22的肽基試劑，其中相互作用的結構域是含有SEQID NO18的肽。
29.一種方法，包括(a)定義搜索範圍，它含有靶蛋白上肽可與之相互作用的相互作用位點；(b)為該肽定義大小；(c)為該肽的胺基酸序列中各位置定義胺基酸類別；(d)用已定義的胺基酸類別中的各成員取代該肽序列胺基酸序列的各位置以生成包括輸出肽序列集合的輸出文庫文檔；(e)將輸出文庫文檔傳輸給分子對接程序以使各輸出肽序列集合成員與搜索範圍擬合併產生靶蛋白質-肽序列擬合得分；(f)根據靶蛋白質-肽序列擬合得分將輸出肽序列集合分級；(g)展示各輸出肽序列集合及其關聯的靶蛋白質-肽序列擬合得分；其中，一部分輸出肽序列集合能夠與靶蛋白質穩定相互作用。
30.權利要求29的方法，其中搜索範圍含有靶蛋白質中各非氫原子的x-、y-、和z-坐標。
31.權利要求29的方法，其中具有較高靶蛋白質-肽序列擬合得分的輸出肽序列能潛在地以較高的親和力與靶蛋白質結合。
32.權利要求29的方法，其進一步包括接受輸入百分數選擇以將輸出肽序列集合限制在一個確定的百分數；其中輸入百分數選擇可以限制輸出文庫文檔的大小和文庫的複雜性。
33.權利要求29的方法，其中各胺基酸類別各自包括任一遺傳編碼的L-胺基酸、天然存在的非遺傳編碼L-胺基酸、合成的L-胺基酸、遺傳編碼胺基酸的D-對映異構體、天然存在的非遺傳編碼胺基酸的D-對映異構體、或合成的D-胺基酸。
34.權利要求29的方法，其中各胺基酸類別各自包括任一親水胺基酸、疏水胺基酸、類半胱氨酸胺基酸、酸性胺基酸、鹼性胺基酸、極性胺基酸、芳香族胺基酸、非極性胺基酸或脂肪族胺基酸。
35.權利要求29的方法，其中靶蛋白質為牛胰蛋白酶且輸出肽序列之一為YKLKY(SEQ ID NO18)。
36.產生肽序列的系統，包括(a)處理器；(b)與處理器相連的存儲器；(c)與處理器相連的顯示器；(d)能夠在處理器上執行以產生肽序列的肽序列製備組件；(e)能夠在處理器上執行以展示肽序列製備組件所用的備胺基酸殘基類別的類別輸出組件；和(f)能夠在處理器上執行以展示肽序列的肽序列輸出組件。
37.如權利要求36中所述的系統，其中顯示器是印表機。
38.如權利要求36中所述的系統，其中類別輸出組件能顯示肽序列製備組件所用的各胺基酸殘基類別。
39.一種機讀介質，它帶有與能夠指導機器完成方法的相關的內容，該方法包括(a)接收包含靶位上原子坐標集合的搜索範圍，肽集合能以不同的親和力與該靶位結合；(b)接收包括許多胺基酸的肽長度參數；(c)接收定義的、用於沿肽長各位置的擬合的待分析的胺基酸結構類別；(d)生成含有輸出肽序列集合的輸出文庫文檔，該輸出肽序列集合，其包括定義的、沿肽長各位置的胺基酸結構類別的各胺基酸；(e)繼而翻譯和旋轉與搜索範圍相關的肽內各位置上的胺基酸結構類別中的各成員，以隨之產生帶有靶位-肽序列擬合得分的肽序列；(f)根據靶位-肽序列擬合得分將肽序列分級；和(g)顯示所選擇的具有相關肽序列的靶位-肽序列擬合得分百分比。
40.如權利要求39所述的機讀介質，進一步包括顯示輸出肽序列的標記。
41.如權利要求39所述的機讀介質，進一步包括儲存搜索範圍。
全文摘要
本發明提供可以向其中引入一個或若干個相互作用的結構域的穩定肽骨架。這樣的相互作用的結構域可以是特異結合結構域、抑制劑結構域、接頭、標記、固相支持物、反應位點、催化位點、有用的化學實體、及試劑。相互作用的結構域向肽骨架的附著或整合產生肽基試劑。本發明還提供產生可用作相互作用的結構域的肽文庫的方法。
文檔編號C07K14/435GK1606564SQ02825658
公開日2005年4月13日 申請日期2002年9月13日 優先權日2001年12月20日
發明者S·奎爾克 申請人:金伯利-克拉克環球有限公司