Mmp9作為卵巢癌的診斷標記物的用途的製作方法

2023-11-03 02:09:17

專利名稱：：Mmp9作為卵巢癌的診斷標記物的用途的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物醫學
技術領域：
。具體地說，本發明涉及一種提高樣本分類準確性的方法、以及一種用於檢測樣本中匪P-9蛋白的試劑盒。
背景技術：
：上皮性卵巢癌(印ithelialovariancancer,E0C)在所有女性癌症死亡原因中排名第五位。美國癌症學會預計2008年將會新增21650個卵巢癌病例，同時大約有15520例病患將死於該疾病(www.cancer,org)。E0C的高死亡率都是發生在起始階段，因為大部分婦女在診斷時已是晚期(stage111/IV)，其中15_20%的病人有5年的存活率(1)。相比較而言，被準確診斷為stageI的小部分病人，超過90%只5年的存活率(2)。當前E0C檢測的候選策略是建立在生物化學腫瘤標誌物的基礎之上，例如CA125和通過超聲或者卵巢的都卜勒顯像得到的生物物理標記物。不幸的是，利用這些策略進行早期E0C檢測的陽性預測值(PPV)—致性小於10%(3，4)。通過利用CA125複雜算法(complexlongitudinalalgorithms)(5-7)、串聯測試(sequentialtesting)(8，9)和全新生物標記物(10)的應用，在對上皮性卵巢癌(E0C)早期診斷中得到了一定的提高。所以，現在仍非常需要繼續發展新的循環生物標誌物對卵巢癌進行早期診斷。
發明內容本發明部分地基於以下發現卵巢癌患者血清中的匪P-9含量明顯高於健康受試者血清中的匪P-9含量，並且具有統計學顯著性，可用作卵巢癌的診斷標誌物。因此，本發明提供了以下實施方案。[實施方案1]一種診斷受試者中的卵巢癌的方法，包括檢測來自受試者的樣本中的匪P-9含量，對所述MMP-9含量進行分析，和根據分析結果確定所述受試者是否患有卵巢癌。[實施方案2]—種提高樣本分類準確性的方法，包括檢測所述樣本中的匪P-9含量，對所述匪P-9含量進行分析，和根據所述分析結果，對樣本進行分類。[實施方案3]—種對受試者的卵巢癌進行診斷、預後評估、治療效果監測或病程監測的方法，包括檢測受試者血液樣本中匪P-9的表達。[實施方案4]權利要求1-3之任一項的方法，其中所述樣本選自由尿液、腦脊液、唾液和眼淚所構成的組。[實施方案5]權利要求1-3之任一項的方法，其中所述樣本為血液樣本。[實施方案6]權利要求1-3之任一項的方法，其中所述樣本為血清樣本。[實施方案7]權利要求l-6之任一項的方法，其中所述檢測採用ELISA或定量Westernblot進行。[實施方案8]權利要求1-7之任一項的方法，其中所述檢測採用匪P-9的特異結合劑進行。[實施方案9]權利要求8的方法，其中所述匪P-9的特異結合劑為匪P-9的抗體或其MMP-9結合片段。[實施方案10]權利要求8的方法，其中所述匪P-9的抗體為單克隆抗體。[實施方案11]權利要求8的方法，其中所述匪P-9的抗體為多克隆抗體。[實施方案12]權利要求1-11之任一項的方法，其中所述分析包括繪製ROC曲線，其中以匪P-9為變量，根據不同的閾值繪製出R0C曲線，並計算曲線下面積AUC，並且按照期望的靈敏度和特異性進行判斷。[實施方案13]權利要求1-11之任一項的方法，其中所述分析包括將所述匪P-9含量與來自健康受試者的參比值進行比較，如果明顯高於所述參比值則確定所述受試者患有卵巢癌。[實施方案14]用於實施權利要求1-13之任一項的方法的試劑盒，其包含匪P-9的特異結合劑。[實施方案15]權利要求14的試劑盒，還包含能夠結合匪P-9的標記抗體。[實施方案16]權利要求14-15之任一項的試劑盒，其中所述匪P-9的特異結合劑為MMP-9的抗體或其MMP-9結合片段。[實施方案17]權利要求16的試劑盒，其中所述匪P-9的抗體為單克隆抗體。[實施方案18]權利要求16的試劑盒，其中所述匪P-9的抗體為多克隆抗體。[實施方案19]權利要求15-18之任一項的試劑盒，其中所述標記抗體被辣根過氧化物酶或者螢光標記。[實施方案20]權利要求14-19之任一項的試劑盒，還包含包含已知量匪P-9溶液的標準樣；以及用於檢測的抗體標記物，其可以與抗體結合形成偶聯物。[實施方案21]權利要求20的試劑盒，其中所述抗體標記物為辣根過氧化物酶或者螢光物質。[實施方案22]權利要求14-21之任一項的試劑盒，還包含任選的攜帶工具，其空間任選地被劃分為限定空間的組分；任選的選自由顯色劑、酶抑制劑、緩衝液、穩定劑、稀釋劑、洗滌試劑構成的組的輔助試劑；和任選的說明書。[實施方案23]權利要求14-22之任一項的試劑盒，其中所述匪P-9的特異結合劑被固定於固相載體上。[實施方案24]匪P-9的特異結合劑在製備用於診斷卵巢癌的試劑中的用途。[實施方案25]權利要求24的用途，其中所述匪P-9的特異結合劑為匪P-9的抗體或其MMP-9結合片段。[實施方案26]權利要求25的用途，其中所述匪P-9的抗體為單克隆抗體。[實施方案27]權利要求25的用途，其中所述MMP-9的抗體為多克隆抗體。5[實施方案28]MMP-9作為卵巢癌診斷標誌物的用途。[實施方案29]—種提高樣本分類準確性的方法，其包括測定樣本中匪P-9的含量，和匪P-9的含量在時間上的變化；以匪P-9含量在時間上的變化為變量，根據不同的閾值對癌症診斷的靈敏度和特異性繪製出R0C曲線，並計算曲線下面積AUC;按照AUC值、靈敏度和特異性對樣本進行分類。研究表明，採用本發明的方法及試劑盒對個體的樣本中蛋白匪P-9進行聯合檢測，可以有效提高癌症診斷的靈敏度、特異性和準確率，並且可以推廣至許多疾病的診斷、預後評估、治療效果評估及病程監測。圖1是對患者血清樣本進行匪P-9檢測的R0C曲線界面。其中，specificity是指特異性，sensitivity是指靈敏度。具體實施方式術語本文所用的術語"匪P-9"是指基質金屬蛋白酶_9(MatrixMetalloproteinase-9)，其含義是本領域公知的。本文中使用的術語"受試者"，指任意哺乳動物，例如，小鼠、大鼠、兔子、狗、牛，特別是靈長類動物，如人。在本發明的某些優選實施方式中，"受試者"是人。在本文中，術語"受試者"和"個體"有時可互換使用。本文中使用的術語"血液樣本"，指來自受試者的血液的樣本，例如全血、血漿或者血清樣本。本文中使用的術語"匪P-9的特異結合劑"，指能夠特異結合匪P-9的試劑，例如匪P-9的抗體、結合配體(如Aptmer)等。本文中使用的術語"特異結合"指本發明的特異結合劑專一性地結合匪P-9抗原。例如，通常情況下，匪P-9抗體結合匪P-9抗原的親和力是結合匪P-9抗原之外的非特異抗原(例如，BSA、酪蛋白)的親和力的至少2倍。匪P-9抗體的"匪P-9結合片段"是指匪P-9抗體的一個或多個片段，其保留結合匪P-9抗原的能力，例如Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv片段。已經表明通過全長抗體的片段可以實施抗體的抗原結合功能。抗體的"匪P-9結合片段"包括(i)Fab片段，其是由V。V^C^和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，其是含有在鉸鏈區通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和Q^結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的V^和VH結構域組成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341:544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(CDR)。此外，儘管FV片段的兩個結構域VL和VH由不同的基因編碼，它們可以經重組方法通過合成的接頭連接，所述接頭使得VL和VH成為一條蛋白質鏈，其中VL和VH區配對形成單價分子(稱作單鏈Fv(scFv);見，例如，Bird等人(1988)Science242:423-426;和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。文中所用術語"單克隆抗體"指單一分子成分的抗體分子的製備物。單克隆抗體成分顯示出對特定表位的單一結合特異性和親和性。因此，術語"單克隆抗體"指顯示出單一結合特異性的抗體。在一個實施方案中，通過雜交瘤產生人單克隆抗體，所述雜交瘤包括從轉基因非人動物，例如，轉基因小鼠中獲得的、與永生化細胞融合的B細胞，所述動物的基因組包含人重鏈轉基因和輕鏈轉基因。抗體的製備是本領域公知的，本領域技術人員可以容易地製備匪P-9的抗體。文中所用術語"標記抗體"指通過標記分子進行標記的抗體，例如由螢光團、化學發光物質、辣根過氧化物酶等標記的抗體。本文所用的術語"任選"(optional,optionally)表示"可有可無"或"非必需"等含義。例如，"任選的攜帶工具"是指可以有該攜帶工具，也可以沒有該攜帶工具。這可以由本領域技術人員根據情況進行選擇。i式劑盒在一個優選實施方案中，本發明的ELISA使用試劑盒完成，這樣可以實現快捷操作，從而避免常規實驗檢測的繁瑣。本發明的優選的ELISA試劑盒包括匪P-9檢測試劑盒。為提高疾病診斷的靈敏度、特異性和準確率，優選使用匪P-9檢測試劑盒，其可以分別或同時測得兩組檢測結果，以達到快捷功效。在一個優選實施方案中，本發明的匪P-9檢測試劑盒至少包含(1)能夠結合匪P-9的抗體；以及(2)當匪P-9結合於(1)中限定的抗體時，能夠結合於匪P-9的標記抗體。上述試劑盒還可包含(3)由含有已知量匪P-9的溶液組成的標準樣，該標準樣可以來源於基因工程菌表達、動物或人的體液；以及(4)用於檢測的抗體標記物，例如，作為報告方法的酶標籤比如辣根過氧化物酶，或者螢光標記，其可以與抗體結合形成偶聯物。更優選地，試劑盒還可進一步包括下述物品中的至少之一(5)攜帶工具，其空間劃分為可以收容一種或多種容器、96孔板或板條等的限定空間，該容器例如是藥瓶、試管和類似物，每樣容器都可含有一個單獨的用於本發明方法的組分；(6)輔助試劑，比如，顯色劑、酶抑制劑、緩衝液、穩定劑、稀釋劑、洗滌試劑以及類似物；(7)說明書，其可以寫在瓶子、試管和類似物上，或者寫在一張單獨的紙上，或者在容器的外部或內部；也可以是多媒體的形式，比如CD、電腦光碟、錄像等等。優選抗體可以固定於固相載體上，形成捕獲抗體。捕獲抗體在操作上特別方便。所含抗體包括任何能夠結合匪P-9的抗體片段，並且可以是重組體、嵌合抗體、人源化抗體和鼠源性抗體。所述抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，優選單克隆抗體。優選抗體偶聯物能夠用ELISA閱讀機，比如，酶標儀進行光度測定。樣本本發明所用樣本可以包含多種形式，比如全血、血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液、或眼淚。其中優選血清。樣本製備可根據普通方法比如離心等進行，例如，參見如下文獻Young，D.S.&Bermes，E.W.〃Specimencollectionandprocessing〃inTietzTextbookofClinicalChemistry2ndEdition"Eds.Burtis，C.A.&Ashwood，E.R.，Saunders(1994);MethodsinEnzymology，H.VanV皿akisandJ.J丄angone(Eds)，1981，72(B);PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays,PTijssen，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,R.J.BurdenandP.H.VanKnippenberg(Eds)，Elsevier，1985;IntroductiontoRadioimmunoassayandRelatedTechniques,T.Chard，ibid，3rdEdition,1987;MethodsinEnzymology，H.VanVunakisandJ.J.Langone(Eds)1981，74(C)。柃測l方法本發明可以使用ELISA或其它蛋白定量技術對個體的樣本進行蛋白MMP-9的檢測。優選地，可以採用匪P-9的特異結合劑，例如MMP-9的抗體進行檢測。在一個優選實施方式中，匪P-9的抗體被固定在固相載體上，例如作為捕獲抗體使用。酶聯免疫吸附劑測定(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)是分子生物學領域常用的蛋白質含量分析方法，其可用於測定抗原，也可用於測定抗體。根據試劑的來源、樣本的性狀以及檢測的具體條件，本發明可以採用多種不同類型，比如雙抗體夾心法、雙位點一步法、間接法測抗體、競爭法、捕獲法測IgM抗體、以及應用親和素和生物素的ELISA等。定量Westernblot也是分子生物學領域常用的蛋白質含量分析方法。還可以採用通過化學方法測定匪P-9酶的活性程度的定量分析如明膠原位酶譜(gelatinzymogr即hy)或螢光法檢測。ROC曲線在用ELISA檢測出樣本中MMP-9的濃度後，可用數學分析方法對測得的樣本中匪P-9濃度進行統計學處理，在此基礎上獲得具有樣本分類意義的分級標準。這樣的數學方法優選由計算機完成，比如用這些數據繪製ROC曲線，從而對個體的樣本進行分類。例如，可以將個體分為癌症或健康，治療反應好和壞，預測存活期長和短等。ROC曲線全稱為受試者工作特徵曲線(receiveroperatorcharacteristiccurve)，又稱為接收者操作特性曲線，主要用於臨床生化診斷試驗。ROC曲線是反映真陽性率(靈敏度，又稱敏感性，sensitivity)和假陽性率(1_特異性，specificity)連續變量的綜合指標，是用構圖法揭示靈敏度和特異性的相互關係。它通過設定一系列不同的分界值(閾值或臨界值，cut-offvalue,是劃分診斷試驗結果正常與異常的界值)作為連續變量，從而計算出一系列靈敏度和特異性，再以靈敏度為縱坐標、l-特異性為橫坐標繪製的曲線，曲線下面積(AUC)越大，診斷準確性越高。在R0C曲線上，最靠近坐標圖左上方的點為靈敏度和特異性均較高的臨界值。ROC曲線AUC值在1.0禾P0.5之間。在AUC>0.5的情況下，AUC越接近於1，說明診斷效果越好。AUC在0.50.7時有較低準確性，AUC在0.70.9時有一定準確性，AUC在0.9以上時有較高準確性。ROC曲線的評價方法與傳統的評價方法不同，根據實際情況，允許有中間狀態，可以把試驗結果分為多個有序分類，比如正常、大致正常、可疑、大致異常和異常五個等級。上述有序分類，對於疾病的診斷而言，可分為陰性、不確定、陽性。進一步地，對於癌症診斷而言，可分為癌症、健康。在一個實施方式中，本發明提高樣本分類準確性的方法，可以包括如下步驟(1)分別測定樣本中蛋白匪P-9的含量；(2)以匪P-9蛋白含量的比值為變量，根據不同的閾值對癌症診斷的靈敏度和特異性繪製出ROC曲線，並計算曲線下面積AUC;以及(3)按照期望的靈敏度和特異性，對測定樣本進行分類(癌症或健康)。ROC曲線的繪製可以使用現有技術中的軟體或系統，比如MedCalc9.2.0.1醫學統計軟體、SPSS9.0、ROCPOWER.SAS、DESIGNROC.FOR、MULTIREADER_POWER.SAS、CREATE_ROC.SAS、GBSTATV10.0(DynamicMicrosystems,Inc.SilverSpring,MD，USA)等等。[畫]縛翩亂予脂亂驗效果備薩薩則本發明還提供了一種用於卵巢癌的診斷、預後評估、治療效果監測或病程監測的聯合測試試劑盒，其至少包含(l)能夠結合匪P-9的抗體；以及(2)當匪P-9結合於(1)中限定的抗體時，能夠結合於匪P-9的標記抗體。在一個優選實施方式中，本發明提供了一種對受試者的卵巢癌進行診斷、預後評估、治療效果監測或病程監測的方法，包括檢測受試者血液樣本中匪P-9的表達量和匪P-9的含量在時間上的變化(如，不同癌症發展時期，治療前和治療後等)。本發明還提供了一種提高樣本分類準確性的方法，其包括測定樣本中匪P-9的含量，和匪P-9的含量在時間上的變化(如，不同癌症發展時期，治療前和治療後等)；以匪P-9蛋白含量在時間上的變化為變量，根據不同的閾值對癌症診斷的靈敏度和特異性繪製出R0C曲線，並計算曲線下面積AUC;按照AUC值、靈敏度和特異性對樣本進行分類。例如，可以將個體分為癌症或健康，治療反應好和壞，預測存活期長和短等。在一個優選實施方式中，例如，可以將匪P-9含量與來自健康受試者的參比值進行比較，如果明顯高於所述參比值則確定所述受試者患有卵巢癌。以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本發明而不用於限定本發明的範圍。實施例1以下以個體的血清為樣本進行卵巢癌診斷為例，對本發明作進一步詳細說明。樣本的採集在浙江大學醫學院一附院隨機採取37例50-60歲卵巢癌患者的血清lmL;作為陽性對照，另採取12例50-60歲健康志願者的正常血樣lmL，進行匪P-9濃度測試。測匪P-9含暈ELISA分析_運用了R&DSystems公司開發的定量MMP-9免疫測定試劑盒(cat抑MP900)。該ELISA試劑盒主要是用來測定血清樣品總的畫P-9(92kDapro-and82kDaactiveforms)。ELISA分析可根據說明書操作。利用MMP-9驗證的血清樣品都是由中國遺傳資源庫和國家人口計生委科學技術研究所(IRB批准)的腫瘤庫所提供。利用DynamicMicrosystems公司開發的GBSTAT統計包來分析ROC曲線。並且使用Bio-Rad680型酶標儀(美國)進行ELISA操作，包括1、取出冷藏儲存的試劑盒，放置，恢復溫度至室溫(20_25°C)。計算要檢測的標本總數和質控數。每個標本需要一個抗原包被孔。每次實驗都要做陽性對照、陰性對照和校準品。確定需要的微孔數量。當板條溫度至室溫時，打開板條的保護袋，拿出抗原包被的微孔板條。本次實驗不需要使用的試劑條應放入這個可重新密封的袋子，密封，重新存放在2-8°C。2、依次在微孔板上加入20iiL的標準液、對照液和血清樣本。此過程務必在三十分鐘內完成。3、在每個微孔中加入100i！L的捕獲液，用移液器在孔中反覆吹打進行混勻。4、用微孔板蓋蓋好板，在室溫下(18_25°C)進行溫育55-65分鐘。5、按下述步驟手工洗板3次A、劇烈搖動並倒掉板中的液體；B、在孔中加滿洗液。保證孔中無殘餘氣泡。C、再重複前兩步驟兩次。D、搖動並去除孔中的洗液。把板翻轉，在紙巾上輕拍，以便能拍幹所有洗液。觀察微孔板，確保無殘留的洗液。6、在酶標抗體複合物的瓶子裡加入7mL的再生緩衝液，存放於室溫下待用。7、按照同樣的次序把稀釋好的酶複合物加lOOyL到微孔板上8、用微孔板蓋蓋好板，在室溫下(18-28°C)進行溫育55-65分鐘。9、配製底物，在底物緩衝液中加入一片底物固體，30-60分鐘後溶解，強烈搖晃，使溶液完全混合。10、按照步驟5中A至IJD的方法進行洗板。11、以同樣的速度和次序把底物液加100iiL到每孔中。12、微孔板在室溫下(18-28°C)進行溫育55-65分鐘。13、以同樣的速度和次序在每個孔中加入100iiL的終止液。加了終止液後應輕輕敲打微孔板，確保樣品全部混勻。14、設置酶標儀的檢測波長在405nm處。檢測每個孔的OD值。應在加了終止液的15鍾之內進行讀數。15、用一線性校準曲線"Y=mx+b"來分析匪P-9的結果。16、通過標準曲線來讀出血清樣本和對照液中匪P-9的濃度。題經上述步驟，得到的檢測結果如表1所示。由表1可以看出，匪P-9的濃度與卵巢癌症狀有密切的相關性，即卵巢癌患者血清中匪P-9蛋白的含量明顯高於健康志願者血清中的含量。ROC曲線繪製使用GBSTATV10.0(DynamicMicrosystems,Inc.SilverSpring，MDUSA)系統，以MMP-9蛋白含量為變量，根據不同的閾值對癌症診斷的靈敏度和特異性繪製出R0C曲線，並計算曲線下面積AUC;繪製出ROC曲線並計算曲線下面積(AUC)，如圖l所示。我們最近對37個卵巢癌病人和12個正常對照，用免疫酶標的辦法對匪P9在診斷卵巢癌的敏感性和精確性作了一個分析，發現它的敏感率為87%、特異性為83%、精確率為86%，這些指標都超過了目前卵巢癌的診斷標記物CA125，尤其在特異性方面，遠遠超過了CA125。因此我們認為匪P9作為卵巢癌的診斷標記物具有很大的開發價值。我們利用R&DSystems公司開發的MMP-9免疫測定試劑盒，比較了37個卵巢癌病人和12個正常個體的血清表達情況。正常個體血清平均表達水平是1.68+-30.06，而卵巢癌病人的平均表達水平為72.77+-72.17。TTestPvalue是1.02837E_05。麗P-9的ROC曲線分析結果如圖1所示。圖1顯示，ROC曲線的AUC為0.92。當匪P-9濃度的閾值為27.46(ng/mL)時，診斷卵巢癌的敏感率為87%、特異性為83%、精確率為86%。tableseeoriginaldocumentpage12tableseeoriginaldocumentpage13本文中所涉及的參考文獻，包括專利文件、學術論文、出版物等，均以引用的方式將其全部內容包括在本文中。應當理解，在不偏離本發明的精神和範圍的情況下，本領域的普通技術人員可以在形式和細節上對其做出各種改變和改進，而這些均被認為落入了本發明的保護範圍。參考文獻[l]Greenlee，R.T.，Hill-Harmon，M.B.，Murray,T.，Thun，M.，Cancerstatistics,2001.CACancerJClin2001，51，15—36.[2]Young，R.C.，Walton,L.A.，Ellenberg，S.S.，Homesley，H.D.，etal.，AdjuvanttherapyinstageIandstageIIepithelialovariancancer.Resultsoftwoprospectiverandomizedtrials.NEnglJMed1990，322，1021-1027.[3]vanNagell，J.R.，Jr.，DePriest，P.D.，Reedy，M.B.，Gallion，H.H.，etal.，Theefficacyoftransvaginalsonographicscreeninginasymptomaticwomenatriskforovariancancer.GynecolOncol2000，77，350—356.[4]Kyrgiou，M.，Tsoumpou，I.，Martin-Hirsch，P.，Arbyn，M.，etal.，Ovariancancerscreening.AnticancerRes2006，26，4793—4801.[5]Skates,S.J.，Xu，F.J.，Yu，Y.H.，Sjovall，K.，etal.，Towardanoptimalalgorithmfororariancancerscreeningwithlongitudinaltumormarkers.Cancer1995，76，2004-2010.[6]Zhang，Z.，Barnhill，S.D.，Zhang，H.，Xu，F.，etal.，Combinationofmultipleserummarkersusinganartificialneuralnetworktoimprovespecificityindiscriminatingmalignantfrombenignpelvicmasses.GynecolOncol1999,73，56-61.[7]McIntosh，M.W.，Urban,N.，Karlan，B.，Generatinglongitudinalscreeningalgorithmsusinghovelbiomarkersfordisease.CancerEpidemiolBiomarkersPrev2002，11，159-166.[8]Berek，J.S.，Bast，R.C.，Jr.，Ovariancancerscreening.Theuseofserialcomplementarytumormarkerstoimprovesensitivityandspecificityforearlydetection.Cancer1995，76，2092-2096.[9]Jacobs,I.J.，Skates,S.J.，MacDonald，N.，Menon，U.，etal.，Screeningforovariancancer:apilotrandomisedcontrolledtrial丄ancet1999，353，1207—1210.[10]Kim，J.H.，Skates,S.J.，Uede，T.，Wong，K.K.，etal.，Osteopontinasapotentialdiagnosticbiomarkerforovariancancer.Jama2002，287，1671—1679.權利要求一種診斷受試者中的卵巢癌的方法，包括檢測來自受試者的樣本中的MMP-9含量，對所述MMP-9含量進行分析，和根據分析結果確定所述受試者是否患有卵巢癌。2.—種提高樣本分類準確性的方法，包括檢測所述樣本中的匪P-9含量，對所述MMP-9含量進行分析，和根據所述分析結果，對樣本進行分類。3.—種對受試者的卵巢癌進行診斷、預後評估、治療效果監測或病程監測的方法，包括檢測受試者血液樣本中匪P-9的表達。4.權利要求1-3之任一項的方法，其中所述樣本選自由尿液、腦脊液、唾液和眼淚所構成的組。5.權利要求l-3之任一項的方法，其中所述樣本為血液樣本。6.權利要求l-3之任一項的方法，其中所述樣本為血清樣本。7.權利要求1-6之任一項的方法，其中所述檢測採用ELISA或定量Westernblot進行。8.權利要求1-7之任一項的方法，其中所述檢測採用匪P-9的特異結合劑進行。9.權利要求8的方法，其中所述MMP-9的特異結合劑為匪p-9的抗體或其MMP-9結合片段。10.權利要求8的方法，其中所述MMP-9的抗體為單克隆抗體。11.權利要求8的方法，其中所述MMP-9的抗體為多克隆抗體。12.權利要求1-11之任一項的方法，其中所述分析包括繪製R0C曲線，其中以匪P-9為變量，根據不同的閾值繪製出R0C曲線，並計算曲線下面積AUC，並且按照期望的靈敏度和特異性進行判斷。13.權利要求1-11之任一項的方法，其中所述分析包括將所述匪P-9含量與來自健康受試者的參比值進行比較，如果明顯高於所述參比值則確定所述受試者患有卵巢癌。14.用於實施權利要求l-13之任一項的方法的試劑盒，其包含匪P-9的特異結合劑。15.權利要求14的試劑盒，還包含能夠結合匪P-9的標記抗體。16.權利要求14-15之任一項的試劑盒，其中所述匪P-9的特異結合劑為匪P-9的抗體或其MMP-9結合片段。17.權利要求16的試劑盒，其中所述MMP-9的抗體為單克隆抗體。18.權利要求16的試劑盒，其中所述MMP-9的抗體為多克隆抗體。19.權利要求15-18之任一項的試劑盒，其中所述標記抗體被辣根過氧化物酶或者螢光標記。20.權利要求14-19之任一項的試劑盒，還包含包含已知量匪P-9溶液的標準樣；以及用於檢測的抗體標記物，其可以與抗體結合形成偶聯物。21.權利要求20的試劑盒，其中所述抗體標記物為辣根過氧化物酶或者螢光物質。22.權利要求14-21之任一項的試劑盒，還包含任選的攜帶工具，其空間任選地被劃分為限定空間的組分；任選的選自由顯色劑、酶抑制劑、緩衝液、穩定劑、稀釋劑、洗滌試劑構成的組的輔助試劑；和任選的說明書。23.權利要求14-22之任一項的試劑盒，其中所述匪P-9的特異結合劑被固定於固相載體上。24.匪P-9的特異結合劑在製備用於診斷卵巢癌的試劑中的用途。25.權利要求24的用途，其中所述匪P-9的特異結合劑為匪P-9的抗體或其匪P-9結合片段。26.權利要求25的用途，其中所述匪P-9的抗體為單克隆抗體。27.權利要求25的用途，其中所述匪P-9的抗體為多克隆抗體。28.匪P-9作為卵巢癌診斷標誌物的用途。29.—種提高樣本分類準確性的方法，其包括測定樣本中匪P-9的含量，和匪P-9的含量在時間上的變化；以MMP-9含量在時間上的變化為變量，根據不同的閾值對癌症診斷的靈敏度和特異性繪製出R0C曲線，並計算曲線下面積AUC;按照AUC值、靈敏度和特異性對樣本進行分類。全文摘要本發明提供了一種診斷受試者中的卵巢癌的方法，包括檢測來自受試者的樣本中的MMP-9含量，對所述MMP-9含量進行分析，和根據分析結果確定所述受試者是否患有卵巢癌。本發明還提供了用於卵巢癌診斷的試劑盒。文檔編號G01N33/577GK101738478SQ200810182038公開日2010年6月16日申請日期2008年11月27日優先權日2008年11月27日發明者林標揚申請人:浙江大學