來源於擬南芥的重組修復基因mim的製作方法

2023-12-03 13:46:31

專利名稱：來源於擬南芥的重組修復基因mim的製作方法
技術領域：
本發明涉及編碼促進植物細胞中DNA損傷重組修復的蛋白質的DNA。
所有生物的細胞都形成了一系列對抗DNA損傷的有害作用的DNA修復途徑，並由複雜的信號級聯放大引發。植物中的同源重組通過修復損傷的染色體穩定基因組，同時通過產生新基因和新的遺傳連鎖產生遺傳變異性。通過重組修復DNA損傷對於處於外源和內源基因毒性應激下的細胞特別有意義，因為這能消除大量的DNA損傷。目前對引起植物中減數分裂重組和體細胞重組和DNA修復的遺傳組成與分子組成的認識還很有限。為了能用基因技術修飾或改善DNA修復，鑑定參與該途徑或級聯的關鍵蛋白質是必要的。因此，本發明的主要目的在於提供含有一種編碼這種關鍵蛋白質的開放閱讀框的DNA。
在本發明說明書中，所提及的基因被理解為與調節序列有關的DNA編碼序列，它使該編碼序列能轉錄為RNA如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有義RNA或反義RNA。調節序列的實例包括啟動子序列、5』和3』非翻譯序列、內含子和終止序列。
啟動子是指一種起始相關DNA序列轉錄的DNA序列，也可包括作為基因表達調節物的元件，如激活物、增強子或阻抑物。
基因的表達是指其在活細胞中轉錄為RNA或其轉錄隨後翻譯為蛋白質。
術語細胞的轉化是指核酸向宿主細胞中的引入，特別是DNA分子向該細胞基因組中的穩定整合。本發明描述了-含有一種開放閱讀框的DNA，該開放閱讀框編碼特徵在於與SEQID NO:3有30％或更高同一性的胺基酸序列的蛋白質，-該開放閱讀框所編碼的蛋白質，和
-一種聚合酶鏈反應，其中至少一種使用的寡核苷酸包含代表SEQID NO:1的15個或更多鹼基對的核苷酸序列。
本發明特別公開了·含有一種開放閱讀框的DNA，該開放閱讀框編碼一種含有與SMC蛋白家族蛋白質成員的一段對比胺基酸有50％或更高序列同一性的一段100個或更多胺基酸的蛋白質；·DNA，其中該開放閱讀框編碼一種特徵在於SEQ ID NO:3的胺基酸序列的蛋白質；·特徵在於SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列的DNA；·DNA，其中該開放閱讀框編碼一種促進植物細胞中DNA損傷重組修復的蛋白質；·DNA，其中該開放閱讀框編碼一種提供對甲磺酸甲酯(MMS)處理超敏感性的蛋白質；·DNA，其中該開放閱讀框編碼一種提供對X射線、紫外線或絲裂黴素C處理超敏感性的蛋白質；·DNA，其中該開放閱讀框編碼一種蛋白質，該蛋白質含有一個NTP結合區，隨後是第一個捲曲螺旋區，一個絞鏈區或間隔區，和第二個捲曲螺旋區，隨後是具有一個Walker B型NTP結合域的C末端DA盒；和·一種產生所述DNA的方法，其包括-篩查DNA文庫，篩選能與SEQ ID NO:1所示DNA片段雜交的克隆，其中該片段具有至少15個核苷酸的長度；-將雜交的克隆測序；-純化克隆的載體DNA，其含有一種編碼與SEQ ID NO:3有超過40％序列同一性的蛋白質的開放閱讀框；-任選地進一步處理純化的DNA。
根據本發明的DNA含有一種開放閱讀框，其編碼一種特徵在於與SEQ ID NO:3有30％或更高總體同一性的胺基酸序列的蛋白質。藉助於對甲磺酸甲酯(MMS)顯示超敏感性的T-DNA標記的擬南芥突變體，追蹤特徵在於SEQ ID NO:3的蛋白質。該突變體也對X射線、紫外線和絲裂黴素C敏感，這進一步支持了相應的野生型基因參與DNA損傷修復的觀點。最後，發現該突變體對升高的溫度比野生型更敏感。由於這種成倍提高的敏感性，該突變體被稱為mim(對MMS、輻照、絲裂黴素C敏感)。相應的野生型基因被稱為MIM。野生型植物與突變mim基因純合的植物的F1雜種不顯示突變表型，表明為隱性突變。與野生型回交產生的F2幼苗群體的分離表明該突變作為隱性孟德爾性狀而遺傳。
動態編程算法產生不同種類的序列對比。通常存在兩種方法用於序列對比。Needleman和Wunsch及Sellers提出的算法可對比兩種全長序列，假如這些序列的總體對比產生總體序列同一性的百分值。另一方面，Smith-Waterman算法產生局部對比。局部對比用來在選擇評分矩陣和罰區間時對比最相似的序列中的區域對。這使得資料庫搜索能集中於最高度保守的序列區域。這也使得能鑑定序列中的相似結構域。為了用Smith-Waterman算法加速對比，BLAST(基本局部對比搜索工具)和FASTA對序列對比有另外的限制。
在本發明說明書中，序列對比用BLAST常規進行，BLAST是一組相似性搜索程序，用於探查所有可得到的序列資料庫，而不論查詢是蛋白質還是DNA。該搜索工具的BLAST 2.0版(缺口BLAST)已在網際網路上公開(當前http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。與總體對比相反它使用搜索局部的試探性算法，因此能探明共有分離區的序列之間的關係。BLAST搜索中分配的得分有明確的統計學解釋。在本發明範圍內特別有用的是可在局部序列對比中引入缺口的blastp程序和PSI-BLAST程序，這兩種程序都能將胺基酸查詢序列與蛋白質序列資料庫相比較，而blastp變化程序只允許兩種序列的局部對比。優選地將可選參數設置為預設值運行這些程序。
使用可商業獲得的基於眾所周知的序列同一性或相似性探索算法的電腦程式對SEQ ID NO:3的序列對比顯示，具有106個胺基酸長度的一段SEQ ID NO:3顯示與對比的一段粟酒裂殖酵母(S.pombe)rad18基因-SMC(染色體結構保持)蛋白質家族的一個成員一有高達47％的序列同一性。儘管SMC蛋白之間的總體同一性或同源性通常較低，但在SMC蛋白和MIM之間，N端或C端的保守基序顯示明顯的同一性或同源性，MIM與包括也參與DNA修復的RHC18和rad18的一個SMC蛋白新亞家族有最高同一性。
SEQ ID NO:3的總體對比得到低於30％的序列同一性。因此，本發明定義了一種新的蛋白質家族，其成員在總體對比後顯示與SEQ ID NO:3有30％或更高的胺基酸序列同一性。優選地，總體胺基酸序列同一性高於55％，甚至高於70％。最優選的是總體同一性高於90％。
在本發明的一個優選實施方案中，這種新蛋白質家族含有與SMC蛋白家族的蛋白質成員(如SEQ ID NO:3所示蛋白質的一段對比胺基酸)有50％或更高序列同一性的一段100個或更多的胺基酸。
SEQ ID NO:1描述了根據本發明的DNA的一個實例。所編碼的蛋白質的胺基酸序列與SEQ ID NO:3相同。在與釀酒酵母(S.cerevisiae)RHC18胺基酸序列對比後，53個胺基酸的一段顯示與對比的RHC18序列有54％的序列同一性。因此，根據本發明，能定義一種與SMC蛋白相關的蛋白質家族，其成員在一段超過50個胺基酸長度的序列對比後，顯示與SEQ ID NO:3有55％或更高的胺基酸序列同一性。優選地，胺基酸序列同一性高於70％，甚至高於80％。當進行多重序列對比時，某些算法如BLAST除序列同一性之外還可能考慮序列相似性，例如，單個胺基酸的相同淨電荷或相當的疏水性/親水性。因此，它們評價用一種胺基酸代替另一種胺基酸是能保留保持蛋白質結構和功能所必需的物理和化學性質，還是更可能破壞蛋白質的基本結構和功能特徵。通過與相同胺基酸的百分數相比，根據陽性胺基酸的百分數定量這種序列相似性。與序列同一性相比得到的序列相似性的值能有助於在臨界情況下將一種蛋白質分配於正確的蛋白質家族。
能從單子葉植物和雙子葉植物中分離編碼屬於根據本發明的新蛋白質家族的蛋白質的DNA。優選的來源是玉米、甜菜、向日葵、油籽芸苔(winter oilseed rape)、大豆、棉花、小麥、稻、馬鈴薯、花莖甘藍、花椰菜、捲心菜、黃瓜、甜玉米、日本蘿蔔、四季豆、萵苣、甜瓜、胡椒、南瓜、番茄或西瓜。可使用下列普通方法，本領域技術人員通常將其用於具體工作。由至少15個，優選地20-30個，甚至超過100個連續核苷酸組成的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的單鏈片段作為探針，用來篩查DNA文庫，以篩選可與該片段雜交的克隆。雜交因素描述於Sambrook等人，《分子克隆實驗室指南》，冷泉港實驗室出版社，9.47-9.57章和11.45-11.49章，1989。將雜交的克隆測序，並純化含有完整編碼區的克隆的DNA，其編碼一種與SEQ ID NO:3有超過30％總體序列同一性的蛋白質。然後可用多種常規重組DNA技術進一步處理該DNA，如限制酶切消化、連接或聚合酶鏈反應分析。這些基因向突變細胞系mim中的轉化導致MMS、紫外線、溫度抗性的野生型水平和根生長野生型水平的恢復。
SEQ ID NO:1的公開內容使本領域技術人員能設計用於聚合酶鏈反應的寡核苷酸，以從含有一種核苷酸序列的模板中擴增DNA片段，該序列的特徵在於SEQ ID NO:1中15個，優選地20-30個，甚至更多鹼基對的任一連續序列。該核苷酸含有一種代表SEQ ID NO:1的15個，優選地20-30個，或甚至更多鹼基對的核苷酸序列。用至少一種這樣的寡核苷酸進行的聚合酶鏈反應及其擴增產物組成了本發明的另一個實施方案。
用pMIM3』8.1上所含並假定覆蓋T-DNA插入位點的1.6kb限制片段對從野生型和突變(mim)擬南芥中分離的基因組DNA的EcoRⅠSouthern印跡分析證實，在突變(mim)基因組DNA中，雜交的限制性片段實際上含有T-DNA插入。
在用從野生型植物的愈傷組織、懸浮培養細胞或花蕾中提取的RNA進行的Northern印跡分析中，能檢測到與該片段雜交的轉錄物，但用從突變(mim)植物物質中提取的相應RNA樣品則檢測不到雜交片段。MIM cDNA對基因組克隆pMIM3』8.1的4.2kb EcoRⅠ限制片段進行32p隨機引物標記(Feinberg等人，分析生物化學132:6-13,1983)，並如Elledge等人，美國國家科學院院刊88:1731-1735,1991所述用它來篩查擬南芥cDNA文庫。鑑定出代表相同基因的4個部分cDNA克隆；全部都缺乏預測的全長cDNA(～3.7kb)的5』末端。因此，用RT-PCR和5』RACE技術分離丟失的MIM cDNA5』末端。RT-PCR根據已知的基因組DNA序列，為RT-PCR設計下列正向PCR引物(FP):
FP1:5』-CTG GGT CGG GTT CGA TTC TGA G-3』(SEQ IDNO:6)FP2:5』-GGT AAG AGT GCA ATA CTG ACT GC-3』(SEQ IDNO:7)FP3:5』-GCA GCT ATG CCG TTG TCC AAG TAG-3』(SEQ IDNO:8)根據可從部分cDNA克隆獲得的序列信息，設計下列兩種特異反向引物(SP)SP1(反向):5』-AAT GAC TCT GTC CCC TCC AAA TG-3』(SEQ IDNO:9)SP2(反向)5』-ATG TTC GAG GTT ATG AAT CTT TG-3』(SEQ IDNO:10)用Qiagen植物RNeasy試劑盒從活躍分裂的懸浮培養細胞中提取總RNA。根據使用說明書，使用反向引物SP1，在脫氧核苷酸混合物(Boehringer Mannheim)的存在下，用AMV反轉錄酶反轉錄5μm總RNA。用High PCT純化試劑盒(Boehringer Mannheim)純化cDNA產物，隨後使用FP1和SP2引物進行第一輪PCR擴增。1∶20稀釋第一輪的PCR產物，用FP2和SP2再次擴增。凝膠提取該PCR產物，將其克隆到pCR2.1 TA克隆載體(Invitrogen)中。測序和與基因組序列的對比顯示朝向5』末端的1.2kb cDNA仍然缺乏5』末端。
PCR條件包括94℃5分鐘的初始變性步驟，隨後是25個循環的94℃30秒鐘變性、55℃40秒鐘退火和72℃1分鐘延伸，隨後是72℃7分鐘的最後延伸步驟。5』RACE為了鑑定MIM cDNA的丟失的5』部分，使用5』RACE(cDNA末端快速擴增)技術。用反向引物RP1(5』-GAC TCA GTT ATC CTG CGTTCG-3』；SEQ ID NO:11)反轉錄從擬南芥懸浮培養細胞中提取的2.5μg總RNA。在2mM dATP存在下，用末端轉移酶對得到的cDNA 5』末端添加同聚A尾。用加尾寡核苷酸特異的引物(Oligo dT-錨定引物5』-GACCAC GCG TAT CGA TGT CGA CTT TTT TTT TTT TTT TTV-3』；SEQ ID NO:12；Boehringer Mannheim)和反向引物RP2(5』-GGA CAACGG CAT AGC TGC ATC CAG-3』；SEQ ID NO:13)擴增加尾的cDNA。1∶20稀釋PCR產物，並用PCR錨定引物(5』-GAC CAC GCG TATCGA TGT CGA C-3』；SEQ ID NO:14；Boehringer Mannheim)和反向引物RP3(5』-GGC AGC ACG CTG AGT CCC TCT CGC-3』；SEQ IDNO:15)再次擴增。凝膠提取特異的PCR產物，並將其克隆到pCR2.1載體中。
PCR條件包括第一輪的cDNA PCR擴增，其中包括5分鐘的初始變性步驟，隨後是25個循環的94℃30秒鐘變性、35℃40秒鐘退火和72℃40秒鐘延伸，隨後是72℃3分鐘的最後延伸。第二輪PCR的條件與RT-PCR的條件相同。根據使用說明書(Invitrogen,TA-克隆試劑盒)將擴增產物克隆到pCR2.1載體中。實施例3序列分析與對比MIM cDNA(SEQ ID NO:2)含有一個開放閱讀框，其具有橫跨核苷酸位點73-75的起始密碼子和橫跨核苷酸位點3238-3240的終止密碼子。該開放閱讀框能編碼一種預測分子量為121.3kD、理論pI為8.3的1055個胺基酸的蛋白質。與基因組序列的對比顯示有28個內含子。mim突變體中的T-DNA插入到開始於野生型基因組序列核苷酸位點7835處的第22個內含子中。拯救的序列對應於基因組序列位點7804-7835處的內含子序列，其開始標記為PstⅠ限制位點(CTGCAG)。MIM開放閱讀框編碼一種推斷的SMC樣蛋白質(SEQ ID NO:3)，其在氨基末端(胺基酸位點49-56)有一個NTP結合域，隨後是第一個捲曲螺旋區(胺基酸位點184-442)，一個絞鏈區或間隔區(胺基酸位點443-627)，第二個捲曲螺旋區(胺基酸位點628-909)，隨後是被稱為DA盒的也具有WalkerB型NTP結合域的保守基序(胺基酸位點971-1007)。根據Lupas等人，科學252:1162-1164,1991方法分析MIM開放閱讀框的結構組織的捲曲螺旋區，並根據其編碼的蛋白質形成捲曲螺旋的可能性描繪MIM開放閱讀框中的捲曲螺旋區。
用TFASTA程序(Wisconsin Package 9.1版，遺傳計算機集團(GCG),Madison,Wisc.)搜索資料庫後顯示，編碼的蛋白質與粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的rad 18及釀酒酵母中的同源區(RHC 18)有明顯的相似性。得分最高的同源區是粟酒裂殖酵母rad 18和釀酒酵母RHC 18基因(Lehmann等人，1995)，它們顯示與超過1000個胺基酸長度的重疊段有大約25％的同一性。推斷的MIM蛋白與酵母的RAD50基因也有20.6％的總體同一性。應用MIM開放閱讀框氨基端和羧基端序列的系統發育分析(Wisconsin Package 9.1版，遺傳計算機集團(GCG),Madison,Wisc.)證明，編碼的蛋白質不同於屬於SMC的其他蛋白質。資料庫中最緊密相關的是粟酒裂殖酵母rad 18和釀酒酵母RHC 18基因(Lehmann等人，1995)。
應用BLAST程序(Wisconsin Package 9.1版，遺傳計算機集團(GCG),Madison,WI)對SWISSPROT和NCBI資料庫的搜索顯示，在NTP結合位點周圍的一段121個胺基酸中，當與釀酒酵母RHC 18基因相比時有42％的同一性，而在DA盒周圍的一段53個胺基酸中有47％的同一性。與粟酒裂殖酵母rad 18基因的類似對比顯示，在蛋白質氨基端的一段106個胺基酸中有47％的同一性，而在蛋白質羧基端區域周圍的DA盒保守基序的一段53個胺基酸中有54％的同一性。在搜索的資料庫中未發現有來源於高等植物的同源序列。實施例4互補與過量表達實驗互補通過用包含其啟動子和聚腺苷酸化信號的野生型MIM基因轉化突變擬南芥系進行mim突變體的互補。
突變mim擬南芥系含有T-DNA，其包含分別處於nos和CaMV35S啟動子控制下的nptⅡ和bar標記基因。因此用一種新的二元載體p1』hygi6進行轉化，該載體由p1』hygi經多克隆位點的修飾而產生。該載體是p1』barbi的衍生物，證明其在擬南芥轉化中非常有效(Mengiste等人，植物雜誌(Plant J)12:945-948,1997)，並含有潮黴素選擇性標記。p1』hygi能通過下列方法獲得。在p1』barbi中，通過用EcoRⅠ消化質粒並再連接，使含有1』啟動子、bar基因編碼區和CaMV 35S聚腺苷酸化信號的EcoRⅠ片段相對於T-DNA邊界顛倒。在產生的質粒中，1』啟動子(Velten等人，EMBO J 3:2723-2730,1984)指向T-DNA的右邊界。用BamHⅠ和NheⅠ限制酶切消化該質粒，並將bar基因和CaMV 35S聚腺苷酸化信號替換為含有BamHⅠ、HpaⅠ、ClaⅠ、StuⅠ和NheⅠ限制位點的合成多接頭序列。用BamHⅠ和HpaⅠ限制酶切消化產生的質粒，並連接於pROB1(Bilang等人，1991)的BamHⅠ-PvuⅡ片段，其含有與CaMV 35S聚腺苷酸化信號連接的潮黴素B抗性基因hph。產生的二元載體p1』hygi的T-DNA含有處於1』啟動子控制下的潮黴素抗性標記基因和位於標記基因與右邊界序列之間的單克隆位點ClaⅠ、StuⅠ和NheⅠ。向p1』hygi載體的NheⅠ位點插入帶有NheⅠ、SpeⅠ、XhoⅠ和Afl Ⅱ限制位點的寡核苷酸接頭，產生質粒p1』hygi6，用來插入野生型MIM基因。
用SexAⅠ和KpnⅠ限制酶切消化具有MIM基因組克隆3』末端的pBluescript噬菌粒pMIM3』8.1。將酶切的基因組片段插入含有MIM 5』基因組序列的質粒(pMIM5』#1)中，產生pMIM5』#1.2。將pMIM3』8.1中其餘的MIM基因3』末端酶切為KpnⅠ-ApaⅠ片段，並插入pMIM5』1.2中產生質粒pMIM，該質粒含有包括大約2kb上遊序列的MIM基因組序列。用SalⅠ限制酶切消化pMIM，經瓊脂糖凝膠電泳純化含有MIM序列的片段，隨後連接於XhoⅠ酶切並去磷酸化的p1』hygi6的XhoⅠ位點。經直接轉化將得到的構建體引入含有非致癌Ti質粒(pGV3101)的根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)C58CIRifR株中(Van Larebeke等人，自然252:169-170,1974)。利用農桿菌植物介導的基因轉移法(Bechtold等人，C R Acad Sci Paris,Life Sci 316:1194-1199,1993)將含有野生型MIM基因的T-DNA引入mim突變植物中。被引入的植物的種子在含潮黴素的培養基上生長，並篩選轉化子。對自交的潮黴素抗性植物的子代分析其潮黴素抗性的分離。觀察到3∶1分離比的家族用於分離在單基因座處插入了新引入的T-DNA的純合系。用Northern印跡分析法分析獲得的潮黴素抗性系的MIM表達恢復。檢測其MMS、紫外線、溫度抗性野生型水平和根生長野生型水平的恢復。針對mim表型檢查抗潮黴素且具有新引入的T-DNA的17個獨立轉化子的子代。在MMS、紫外線、X射線和MMC敏感性試驗中，這些系中有12個系的表型回復為野生型。也恢復了正常的根生長和耐熱性，這進一步證明mim表型是由MIM基因產物的缺乏引起的。過量表達使用標準克隆技術將用不同方法獲得的MIM cDNA克隆組合為一種載體(pCR2.1,Invitrogen)，使完整MIM cDNA構建於單一DNA片段中。
為了在野生型擬南芥植物中過量表達MIM cDNA，在35S CaMV啟動子和NOS終止信號控制下克隆完整MIM開放閱讀框。用二元載體p1』hygi6.1以相對於CaMV 35S啟動子的有義方向插入含MIM cDNA的NheⅠ-XbaⅠ片段。用該構建體轉化野生型擬南芥植物。研究過量表達MIM蛋白的植物的表型。分析對使用35S∷MIM cDNA構建體產生的16個獨立系進行的Northern印跡分析。與在幼苗中觀察到的MIM表達的野生型水平相比，在選擇的3個系中轉錄水平升高。進一步分析這些系的同源重組活性。實施例5突變體中重組的分析使用一種能顯示染色體內同源重組事件的非選擇性測定系統。該測定系統使用一種破壞的嵌合β-葡糖醛酸糖苷酶(uidA)(GUS)基因(Jefferson等人，EMBO J 6:3901-3907,1987)作為基因組重組底物，其含有直線方向的1213bp重疊GUS序列。該底物被穩定整合於用於重組測定的擬南芥系中，另外被稱為N1DC1。染色體內同源重組後，GUS基因的表達恢復。在對整個植物幼苗組織化學染色後，能評價發生重組事件的細胞。
使mim突變系與重組底物為轉基因的擬南芥C24生態型(N1DC1 11號)系雜交(Swoboda等人，EMBO J 13:481-489,1994)。N1DC1 11號系在單個基因座處含有兩個拷貝的重組底物。使雜交的F1植物自花傳粉。將這些F1植物的子代接種於營養培養基上，選擇具有短根的植物，即mim突變純合的植物，使之生長成熟。在10mgl-1膦絲菌素(ppt)和10mgl-1潮黴素上篩選這些F2植物的子代。ppt抗性純合的系，即mim突變純合的植物，和潮黴素抗性系，即重組底物純合的植物，用於染色體內重組測定。為了比較，也對下列植物測定重組事件(a)野生型(Wassilewskija生態型)，(b)N1DC1 11號系(C24生態型)，和(c)上述相同雜交產生的分離的F3植物，其具有N1DC1 11號系的基因型和突變體(Wassilewskija)的野生型親代生態型，以消除生態型對重組的影響。如Jefferson等人，同上所述進行組織化學(X-gluc)測定。發現突變體(mim)背景的重組頻率比野生型遺傳背景低3.9倍。
序列表110Novartis AG120重組修復基因130S-30568A1401411509815485.9(GB)1511998-07-161509900760.1(GB)1511999-01-1416015170PatentIn Ver.2.1210121110156212DNA213擬南芥400 1gattttcatc agaatctatt tcgatatagt tttcagtatc ttttcttttt cgagttgata 60ccaaactatc aatcgatttc agattctgaa gatattctga catgttgtca tccttcattt 120gtaaaagaca taaagcactt tcttcaatag ttatatcgct ttcagactct atcgaatttt 180cctcttccaa atccacgacg atctttttct tgacagttgt tcgttgctca gcttctttgt 240ttagatctgg ctttggacca ccaacaactt cactggtgtg gacaaatctc gccagaactg 300tttcattagg tcttctaaag cttgctccaa ggttgttgca tgatcgtagt gatggagtga 360tcgagccagt tgatgaagat gatccaggga aaaatttcaa agtgtgagct ctcatgtgac 420caccaagagt tttccccgtt tngaaattgt tttctttgca caccttgnca ggtttttgtt 480ttcctaggan gtgantacat tttggacggt tgaaaaaccc aaaaaaaaaa ctaccaaatt 540tttaggcgtt aaagattttg attgcttttt aatgcggaaa agtgtttgtg aatattatgt 600gattttgaat ccagtggaga tactcatata tatatatagg atgcatgaga gggaggaaca 660caatttctgt tcaaaaggag ttaaccactt aacataagtg tttgttcatt atgttctcac 720atttagttac 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Leu115 120 125Lys Asp Tyr Leu Gly Lys Lys Val Ser Asn Lys Arg Asp Glu Leu Arg130 135 140Glu Leu Val Glu His Phe Asn Ile Asp Val Glu Asn Pro Cys Val Val145 150 155160Met Ser Gln Asp Lys Ala Gly Ser Ser Tyr Ile Leu Glu Cys Lys Gly165 170 175Asn Ser Ser Ser Phe Leu Arg Asn Leu Leu Gln Gln Val Asn Asp Leu180 185 190Leu Gln Ser Ile Tyr Glu His Leu Thr Lys Ala Thr Ala Ile Val Asp195 200 205Glu Leu Glu Asn Thr Ile Lys Pro Ile Glu Lys Glu Ile Ser Glu Leu210 215 220Arg Gly Lys Ile Lys Asn Met Glu Gln Val Glu Glu Ile Ala Gln Arg225 230 235 240Leu Gln Gln Leu Lys Lys Lys Leu Ala Trp Ser Trp Val Tyr Asp Val245 250 255Gly Arg Gln Leu Gln Glu Gln Thr Glu Lys Ile Val Lys Leu Lys Glu260265270Arg Ile Pro Thr Cys Gln Ala Lys Ile Asp Trp Glu Leu Gly Lys Val275 280 285Glu Ser Leu Arg Asp Thr Leu Thr Lys Lys Lys Ala Gln Val Ala Cys
290295300Leu Met Asp Glu Ser Thr Ala Met Lys Arg Glu Ile Glu Ser Phe His305 310 315 320Gln Ser Ala Lys Thr Ala Val Arg Glu Lys Ile Ala Leu Gln Glu Glu325 330 335Phe Asn His Lys Cys Asn Tyr Val Gln Lys Ile Lys Asp Arg Val Arg340 345 350Arg Leu Glu Arg Gln Val G1y Asp Ile Asn Glu Gln Thr Met Lys ASh355 360 365Thr Gln Ala Glu Gln Ser Glu Ile Glu Glu Lys Leu Lys Tyr Leu Glu370 375 380Arg Glu Val Glu Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Arg Leu Lys Glu Glu385 390 395 400Glu Ash Cys Phe Leu Glu Lys Ala Phe Glu Gly Arg Lys Lys Met Glu405 410 415His Ile Glu Asp Met Ile Lys Asn His Gln Lys Arg Gln Arg Phe Ile420 425 430Thr Ser Asn Ile Asn Asp Leu Lys Lys His Gln Thr Asn Lys Val Thr435 440 445Ala Phe Gly Gly Asp Arg Val Ile Asn Leu Leu Gln Ala Ile Glu Arg450 455 460Asn His Arg Arg Phe Arg Lys Pro Pro Ile Gly Pro Ile Gly Ser His465 470 475 480Val Thr Leu Val Asn Gly Asn Lys Trp Ala Ser Ser Val Glu Gln Ala485 490 495Leu Gly Thr Leu Leu Ash Ala Phe Ile Val Thr Asp His Lys Asp Ser500 505 510Leu Thr Leu Arg Gly Cys Ala Asn Glu Ala Asn Tyr Arg Asn Leu Lys515 520 525Ile Ile Ile Tyr Asp Phe Ser Arg Pro Arg Leu Asn Ile Pro Arg His530 535 540Met Val Pro Gln Thr Glu His Pro Thr Ile Phe Ser Val Ile Asp Ser545 550 555 560Asp Ash Pro Thr Phe Leu Asn Val Leu Val Asp Gln Ser Gly Val Glu565 570 575Arg Gln Val Leu Ala Glu Ash Tyr Glu Glu Gly Lys Ala Val Ala Phe580 585 590Gly Lys Arg Leu Ser Asn Leu Lys Glu Val Tyr Thr Leu Asp Gly Tyr595 600 605Lys Met Phe Phe Arg Gly Pro Val Gln Thr Thr Leu Pro Pro Leu Ser610 615 620Arg Arg Pro Ser Arg Leu Cys Ala Ser Phe Asp Asp Gln Ile Lys Asp625 630 635 640Leu Glu Ile Glu Ala Ser Lys Glu Gln Asn Glu Ile Asn Gln Cys Met645 650 655Arg Arg Lys Arg Glu Ala Glu Glu Asn Leu Glu Glu Leu Glu Leu Lys660 665 670Val Arg Gln Leu Lys Lys His Arg Ser Gln Ala Glu Lys Val Leu Thr675 680 685Thr Lys Glu Leu Glu Met His Asp Leu Lys Ash Thr Val Ala Ala Glu690 695 700Ile Glu Ser Leu Pro Ser Ser Ser Val Ash Glu Leu Gln ArG Glu Ile705 710 715 720Met Lys Asp Leu Glu Glu Ile Asp Glu Lys Glu Ala Phe Leu Glu Lys725 730 735Leu Gln Asn Cys Leu Lys Glu Ala Glu Leu Lys Ala Asn Lys Leu Thr740 745 750Ala Leu Phe Glu Asn Met Arg Glu Ser Ala Lys Gly Glu Ile Asp Ala755 760 765Phe Glu Glu Ala Glu Asn Glu Leu Lys Lys Ile Glu Lys Asp Leu Gln770 775 780Ser Ala Glu Ala Glu Lys Ile His Tyr Glu Ash Ile Met Lys Asn Lys785 790 795 800Val Leu Pro Asp Ile Lys Asn Ala Glu Ala Asn Tyr Glu Glu Leu Lys805 810 815Asn Lys Arg Lys Glu Ser Asp Gln Lys Ala Ser Glu Ile Cys Pro Glu820 825 830Ser Glu Ile Glu Ser Leu Gly Pro Trp Asp Gly Ser Thr Pro Glu Gln835 840 845Leu Ser Ala Gln Ile Thr Arg Met Asn Gln Arg Leu His Arg Glu Asn850 855 860Gln Gln Phe Ser Glu Ser Ile Asp Asp Leu Arg Met Met Tyr Glu Ser865 870 875 880Leu Glu Arg Lys Ile Ala Lys Lys Arg Lys Ser Tyr Gln Asp His Arg885 890 895Glu Lys Leu Met Ala Cys Lys Asn Ala Leu Asp Ser Arg Trp Ala Lys900 905 910Phe Gln Arg Asn Ala Ser Leu Leu Arg Arg Gln Leu Thr Trp Gln Phe915 920 925Asn Ala His Leu Gly Lys Lys Gly Ile Ser Gly His Ile Lys Val Ser930 935 940Tyr Glu Asn Lys Thr Leu Ser Ile Glu Val Lys Met Pro Gln Asp Ala945 950 955 960Thr Ser Asn Val Val Arg Asp Thr Lys Gly Leu Ser Gly Gly Glu Arg965 970 975Ser Phe Ser Thr Leu Cys Phe Ala Leu Ala Leu His Glu Met Thr Glu980 985 990Ala Pro Phe Arg Ala Met Asp Glu Phe Asp Val Phe Met Asp Ala Val99510001005Ser Arg Lys Ile Ser Leu Asp Ala Leu Val Asp Phe Ala Ile Gly Glu1010 1015 1020Gly Ser Gln Trp Met Phe Ile Thr Pro His Asp Ile Ser Met Val Lys1025 103010351040Ser His Glu Arg Ile Lys Lys Gln Gln Met Ala Ala Pro Arg Ser104510501055210421121212DNA213人工序列220
223人工序列描述T-DNA寡核苷酸4004ggtttctaca ggacgtaaca t 21210521132212DNA213人工序列220
223人工序列描述T-DNA鄰接32核苷酸
4005ctgcagatct gtttatgtta aagctctttg tg 32210621122212DNA213人工序列220
223人工序列描述FP14006ctgggtcggg ttcgattctg ag22210721123212DNA213人工序列220
223人工序列描述FP24007ggtaagagtg caatactgac tgc 23210821124212DNA213人工序列220
223人工序列描述FP34008gcagctatgc cgttgtccaa gtag 24210921123212DNA213人工序列220
223人工序列描述SP14009aatgactctg tcccctccaa atg2321010
21123212DNA213人工序列220
223人工序列描述SP240010atgttcgagg ttatgaatct ttg232101121121212DNA213人工序列220
223人工序列描述RP140011gactcagtta tcctgcgttc g212101221139212DNA213人工序列220
223人工序列描述Oligo-dT錨定引物40012gaccacgcgt atcgatgtcg actttttttt ttttttttv392101321124212DNA213人工序列220
223人工序列描述RP240013ggacaacggc atagctgcat ccag242101421122212DNA213人工序列220
223人工序列描述PCR錨定引物
40014gaccacgcgt atcgatgtcg ac 222101521124212DNA213人工序列220
223人工序列描述RP340015ggcagcacgc tgagtccctc tcgc2權利要求
1．含有一種開放閱讀框的DNA，該開放閱讀框編碼一種特徵在於與SEQ ID NO:3有30％或更高同一性的胺基酸序列的蛋白質。
2．根據權利要求1的DNA，其含有一種開放閱讀框，該開放閱讀框編碼一種含有與SMC蛋白家族蛋白質成員的一段對比胺基酸有50％或更高序列同一性的一段100個或更多胺基酸的蛋白質。
3．根據權利要求1的DNA，其中該開放閱讀框編碼一種特徵在於SEQID NO:3的胺基酸序列的蛋白質。
4．根據權利要求1的DNA，其特徵在於SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
5．根據權利要求1的DNA，其中該開放閱讀框編碼一種促進植物細胞中DNA損傷重組修復的蛋白質。
6．根據權利要求1的DNA，其中該開放閱讀框編碼一種提供對甲磺酸甲酯(MMS)處理超敏感性的蛋白質。
7．根據權利要求6的DNA，其中該開放閱讀框編碼一種提供對X射線、紫外線或絲裂黴素C處理超敏感性的蛋白質。
8．根據權利要求1的DNA，其中該開放閱讀框編碼一種蛋白質，該蛋白質含有一個NTP結合區，隨後是第一個捲曲螺旋區，一個絞鏈區或間隔區，和第二個捲曲螺旋區，隨後是具有一個Walker B型NTP結合域的C末端DA盒。
9．權利要求1-8中任一項的開放閱讀框所編碼的蛋白質。
10．一種產生根據權利要求1的DNA的方法，其包括-篩查DNA文庫，篩選能與SEQ ID NO:1所示DNA片段雜交的克隆，其中該片段具有至少15個核苷酸的長度；-將雜交的克隆測序；-純化克隆的載體DNA，其含有一種編碼與SEQ ID NO:3有超過40％序列同一性的蛋白質的開放閱讀框；-任選地進一步處理純化的DNA。
11．一種聚合酶鏈反應，其中至少一種使用的寡核苷酸含有代表SEQID NO:1的15個或更多鹼基對的核苷酸序列。
全文摘要
本發明涉及編碼促進植物細胞中DNA損傷重組修復的蛋白質的DNA。該DNA含有一種開放閱讀框,其編碼一種特徵在於與SEQ ID NO:3有30%或更高同一性的胺基酸序列的蛋白質。
文檔編號C12Q1/68GK1309713SQ99808698
公開日2001年8月22日 申請日期1999年7月14日 優先權日1998年7月16日
發明者T·曼吉斯特, J·帕茲科斯基 申請人:辛根塔參與股份公司