核桃葉提取物的製備及其在改善記憶、抗腫瘤領域的應用前景的製作方法

2023-12-03 10:03:36 2

專利名稱：核桃葉提取物的製備及其在改善記憶、抗腫瘤領域的應用前景的製作方法
技術領域：
本發明是關於核桃葉提取物的製備及其在改善記憶、抗腫瘤領域的應用前景的發
明，屬於天然藥物領域。
背景技術：
核桃，在國際市場上它與扁桃、腰果、榛子一起，並列為世界四大乾果。它的足跡幾 乎遍及世界各地，主要分布在美洲、歐洲和亞洲很多地方。核桃在國外，人稱"大力士食品"、 "營養豐富的堅果"、"益智果";在國內享有"萬歲子"、"長壽果"、"養人之寶"的美稱。其卓 著的健腦效果和豐富的營養價值，已經為越來越多的人所推崇。 核桃的藥用價值很高，中醫應用廣泛。祖國醫學認為核桃性溫、味甘、無毒，有健 胃、補血、潤肺、養神等功效。《神農本草經》將核桃列為久服輕身益氣、延年益壽的上品。唐 代孟詵著《食療本草》中記述，吃核桃仁可以開胃，通潤血脈，使骨肉細膩。宋代劉翰等著《開 寶本草》中記述，核桃仁"食之令肥健，潤肌，黑鬚髮，多食利小水，去五痔。"明代李時珍著
《本草綱目》記述，核桃仁有"補氣養血，潤燥化痰，益命門，處三焦，溫肺潤腸，治虛寒喘咳， 腰腳重疼，心腹疝痛，血痢腸風"等功效。 現代醫學研究認為，核桃中的磷脂，對腦神經有良好保健作用。核桃油含有不飽和 脂肪酸，有防治動脈硬化的功效。核桃仁中含有鋅、錳、鉻等人體不可缺少的微量元素。人 體在衰老過程中鋅、錳含量日漸降低，鉻有促進葡萄糖利用、膽固醇代謝和保護心血管的功 能。核桃仁的鎮咳平喘作用也十分明顯，冬季，對慢性氣管炎和哮喘病患者療效極佳。民間 常用於清熱、解毒、抗癌、鎮痛等疾病的治療。目前國內外對核桃的研究主要是對其植物形態分類、栽培、山核桃仁營養價值等 的研究，但對於其化學成分的提取分離及藥理作用等的研究報導還比較少。關於核桃提取 物的作用，絕大部分報導是關於其在抑菌方面的功效。專利200710056996. 8曾報導了核桃 殼提取物的製備及其在強心和心腦血管領域藥物製劑的應用，該發明是核桃殼的乙醇提取 物，並根據其藥理活性研究表明，核桃殼提取物具有一定的強心及改善心肌供血等活性，有 可能研製成為具有多種藥理活性低毒高效的天然中藥的心腦血管病治療新藥。取有效量的 提取物與藥用輔料混合製成多種不同藥物組合物的各種口服製劑。而關於核桃葉的系統溶 劑微波提取法以及其在改善記憶和抗腫瘤方面的運用在本發明完成之前沒有報導。

發明內容
本發明的目的之一是提供了一種核桃葉有效成分的提取分離方法。 本發明的目的之二是提供了以核桃葉提取物為原料研製片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒
劑、口服液等。 本發明的目的之三是提供了以核桃葉活性成分為主要藥用成分用於生產提高記 憶、抗腫瘤的保健品或藥品。
本發明的技術解決方案如下 採集的核桃葉子用乙醇浸泡過夜，用微波加熱提取，旋轉蒸發儀回收乙醇得褐色 黏稠物；葉子再加乙醇浸泡過夜，回收乙醇濃縮液，合併兩次的乙醇濃縮液留存備用。將總 濃縮液懸浮於適量水中，充分震蕩混勻後分別採用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃 取。先用石油醚萃取，旋轉蒸發儀回收石油醚萃取層留存；餘下液體用氯仿萃取，旋轉蒸發 儀回收氯仿層；再以乙酸乙酯萃取，旋轉蒸發儀回收乙酸乙酯層；餘下液體用水飽和正丁 醇萃取，旋轉蒸發儀回收正丁醇層。餘下水層離心後取水層旋轉蒸發儀回收留存。得石油 醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物5種提取物，將其在真空乾燥箱中減壓乾燥，粉碎， 即得到本發明所說的核桃葉提取物。 本發明的核桃葉提取物具有用於製備改善記憶和抗腫瘤的藥物和保健品的應用
前景。按照藥劑學的方法，可以將本發明的核桃葉提取物製備成作為改善記憶和抗腫瘤的
藥物或保健品，口服製劑或保健品選自片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液等。 本發明所得到的提取物具有製備改善記憶和抗腫瘤的藥物和保健品的應用前景，
可以通過以下的藥效試驗得到證實。 核桃提取液對腫瘤細胞的抑制作用 摘要將上述過程得到的核桃葉提取物採用MTI法觀察其對腫瘤SGC-7901增殖的
抑制作用，並採用光學顯微鏡和電鏡方法觀察乙酸乙酯提取物SGC-7901細胞凋亡的誘導
作用。結果核桃乙酸乙酯提取物抗腫瘤作用最強，並且能夠誘導腫瘤細胞凋亡。 目的採用MTI法觀察其對腫瘤SGC-7901增殖的抑制作用，為核桃葉提取物開發抗
腫瘤藥物提供理論依據。 方法步驟l.各稱取2mg的上述5種提取物，水層直接用lml RP-MI1640溶解備用； 石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物溶解於200iU二甲基亞碸中，旋渦震蕩，全部溶解 後，加入800 iURPMI 1640培養液旋渦震蕩混勻。將上述藥物16000r/min離心後0. 22iim
濾膜過濾除菌後放置於4t:冰箱保存備用。 2.細胞培養方法將胃癌SGC-7901細胞接種於含10X新生小牛血清、100U/ml青黴 素和100U/ml鏈黴素的PPMI1640培養液中，37"C培養，長滿後0. 08%胰蛋白酶消化傳代培養。 3. MTT法觀察山核桃提取物對腫瘤細胞增殖的抑制作用 用含10% FBS的1640培養液培養的胃癌細胞SGC-7901以7X103/孔接種於96 孔板，37t: 5% C02的培養箱中培養3h後，分別加入上述配製的藥物，加入量分別為2、4、6、 8和10iU，每劑量組6復孔，不加任何藥物的為對照。繼續培養48h後，觀察細胞形態的變 化。加入MTT孵育4h，棄去上清液，加入DMS0 150 y L震蕩10min， 570nm處測OD值。RJ(細 胞增殖抑制率)=[(對照組A值-用藥組A值)/對照組A值X100% ]。
4.乙酸乙酯提取物誘導SGC-7901細胞凋亡的觀察 光學顯微鏡觀察在6孔培養板中放入清洗乾淨的蓋玻片，紫外線照射滅菌。每孔 接種SGC-7901細胞，4h後分別加入上述配製好的乙酸乙酯提取物96 y 1/ml，不加任何藥物 的為對照，繼續培養24h，取出蓋玻片上細胞進行蘇木素-伊紅染色，光鏡下觀察細胞形態 變化。②透射電鏡觀在100ml培養瓶中接種SGC-7901細胞，4h後加入上述配製好的乙酸 乙酯提取物，濃度和對照組設立同上。處理24h後收集細胞，加2. 5%的戊二醛固定30min後，加1%四氧化鋨固定lh，包埋後超薄切片，透射電鏡下觀察細胞形態變化。
試驗結果 1.核桃的不同提取物均能抑制SGC-7901細胞的增殖；隨著藥物濃度的增加，其生 長抑制作用增強，呈量效關係；其中，乙酸乙酯提取物的抑制作用最強，隨著加入藥物濃度 的增加，其對SGC-7901細胞生長抑制率提高(同對照比較P〈0.05);氯仿提取物的作用次 之(同對照比較P 0. 05)。

圖1是本發明的實驗用藥比較圖。 2.乙酸乙酯提取物誘導SGC-7901細胞凋亡乙酸乙酯提取物處理SGC-7901細胞，
HE染色後，光學顯微鏡下觀察，多數細胞體積變小，變形，細胞核固縮，但細胞膜完整。而對
照組SGC-7901細胞形態學無明顯變化。電子顯微鏡下可見，凋亡細胞體積變小，細胞核變
小。染色質濃縮並凝結成塊，細胞核碎裂，細胞呈典型的凋亡現象。而對照組SGC-7901細
胞形態學無明顯變化。 圖2是本發明的實驗對比結果 A :對照組(透射電鏡。3700X) B :用藥組(透射電鏡。3700X)胃癌細胞可見細胞核的染色質高度凝聚、固縮、碎 裂。 結論核桃葉提取物均能抑制SGC-7901細胞的增殖；隨著藥物濃度的增加，其生 長抑制作用增強，呈量效關係；其中，乙酸乙酯提取物的抑制作用最強；再通過乙酸乙酯提 取物誘導SGC-7901細胞凋亡的觀察，在光學顯微鏡下觀察，多數細胞體積變小，變形，細胞 核固縮，電子顯微鏡下可見，凋亡細胞體積變小，細胞核變小。染色質濃縮並凝結成塊，細胞 核碎裂，細胞呈典型的凋亡現象。 核桃葉提取液對衰老模型小鼠記憶力的影響
目的觀察核桃葉提取液對小鼠記憶功能的影響. 方法取健康小鼠，雌雄各半，適應環境1周後按體重隨機分為空白對照組、模型 組、維生素E組和核桃葉提取液大、中、小劑量組.每日給予除空白對照組外的其他各組小 鼠皮下注射半乳糖0. 12g/kg，給予空白對照組小鼠皮下注射50ml/kg生理鹽水。同時每日 分別灌胃給予核桃葉水提取液大、中、小劑量組小鼠核桃葉水提取液12、6、3g/kg，灌胃給予 維生素E組小鼠維生素E100mg/kg，模型組和空白對照組每日灌胃給予100ml/kg蒸餾水，連 續30d。於第31日起利用Morris水迷宮視頻分析系統和Dig Behv動物行為分析系統軟體 測試記憶能力。 結果與模型組比較，核桃葉提取液各劑量組小鼠搜索站臺的潛伏期均明顯縮短， 而穿越站臺的次數則明顯增加。 結論本研究結果表明，各劑量核桃葉提取液組小鼠在早期搜索站臺潛伏期均明顯 縮短，增加小鼠穿越站臺的次數，提示核桃葉水提取液可明顯改善衰老模型小鼠空間位置 覺和方向覺(空間定位)，改善記憶功能。
權利要求
一種核桃葉提取物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟採集的核桃葉子用乙醇浸泡過夜，用微波加熱提取，旋轉蒸發儀回收乙醇得褐色黏稠物；葉子再加乙醇浸泡過夜，回收乙醇濃縮液，合併兩次的乙醇濃縮液留存備用。將總濃縮液懸浮於適量水中，充分震蕩混勻後分別採用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取。先用石油醚萃取，旋轉蒸發儀回收石油醚萃取層留存；餘下液體用氯仿萃取，旋轉蒸發儀回收氯仿層；再以乙酸乙酯萃取，旋轉蒸發儀回收乙酸乙酯層；餘下液體用水飽和正丁醇萃取，旋轉蒸發儀回收正丁醇層。餘下水層離心後取水層旋轉蒸發儀回收留存。得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物5種提取物，將其在真空乾燥箱中減壓乾燥，粉碎，即得到本發明所說的核桃葉提取物。
2 根據權利要求1所述的採集的核桃葉子用乙醇浸泡過夜，其特徵在於，乙醇的濃度 為70% _80%，所用的量為核桃葉8-10倍的量。
3. 根據權利要求1所述的用微波加熱提取，其特徵在於微波的功率為300W，溫度為 8(TC，提取時間為0. 5h。
4. 根據權利要求1所述的葉子再加乙醇浸泡過夜，其特徵在於乙醇的濃度為85%，所 用的量為核桃葉3-5倍的量。
5. 根據權利要求1所述的濃縮液分別採用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取， 其特徵在於，每一種溶劑萃取的次數為三次，每次加入溶劑的量均為100ml。
6. 以核桃葉提取物為主要有效成分主要用於改善記憶、抗腫瘤藥物或保健產品之中。
全文摘要
本發明公開了一種核桃提取物的製備及其在改善記憶、抗腫瘤領域的應用前景。核桃葉用乙醇浸泡過夜，用微波加熱提取，旋轉蒸發儀回收乙醇得褐色黏稠物；葉子再加乙醇浸泡過夜，回收乙醇濃縮液，合併兩次的乙醇濃縮液留存備用。將總濃縮液懸浮於適量水中，充分震蕩混勻後分別採用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取、減壓乾燥，粉碎，得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物5種提取物。該提取物有效成分可用於生產改善記憶、抗腫瘤藥物或保健品。
文檔編號A61K127/00GK101757097SQ20081016296
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月11日 優先權日2008年12月11日
發明者吳菁, 陳群 申請人:湖州來色生物基因工程有限公司;吳菁