改善的脂質體以及其應用的製作方法

2023-11-02 05:16:07 2

專利名稱：改善的脂質體以及其應用的製作方法
改善的脂質體以及其應用本發明涉及分子醫學和藥理學的領域。更具體地說，本發明涉及脂質體以及它們作為治療性化合物的遞送載體的應用。還提供了一種用於製備脂質體的方法。許多化合物的治療效果受到靶細胞對化合物的低攝取的限制。通常，為了使治療 效果最大化，期望將化合物遞送到細胞的細胞質室或細胞核室，其中發生基因轉錄、以及 mRNA翻譯成蛋白質。親脂性化合物，包括許多較小的不帶電荷的化合物，可以滲透穿過細胞 膜並允許細胞相對有效的攝取。然而，對於各種更大和/或帶電荷的化合物，如蛋白質、核 酸、以及高度水溶性帶電荷的有機化合物，藉助於穿過細胞膜的滲透的被動攝取受到限制。已提出多種方法來改善這樣的化合物攝取到細胞中。例如，可以以改進的或前藥 形式來給予藥物，以便轉運到細胞中，然後在細胞內酶轉化成活性形式。然而，應當理解，對 於每種治療性化合物來說，適宜的前藥形式的製備並不都是可能的。可替換地，可以使用吞噬或胞吞的細胞過程，其中含藥物的顆粒被靶細胞吸收。借 助於大多數目前可獲得的藥物遞送顆粒，然而這種方式限於某些細胞類型，例如，吞噬作用 限於單核細胞譜系的細胞以及限於某些其它髓樣細胞，如中性白細胞(嗜中性粒細胞)，而 胞吞作用限於多種其它細胞，連同其它來自間充質譜系的細胞，如血管內皮細胞、上皮細胞 以及成纖維細胞。因此，不同於巨噬細胞和其它細胞(其專門用於清除和處理來自血液的 顆粒)，存在許多種沒有或很少準備好處理含藥物顆粒的細胞。用來增強細胞攝取藥物的又一種方式涉及使用融合顆粒(其用來融合於靶細胞 的表面膜)，將顆粒的內容物釋放到細胞的細胞質室中。已提出滅活和重組的病毒顆粒用 於該目的，尤其在基因治療中，其中較大的核酸鏈被引入到細胞中。由包埋在人工脂質雙層 中的融合促進病毒蛋白質組成的病毒樣顆粒代表另一個實例。然而，安全問題和與生長、分 離、以及滅活病毒成分有關的費用限制了這些方式的廣泛應用。覆蓋所有血管的血管壁的內皮細胞是就處理含藥物顆粒(例如，載藥脂質體)而 言會受到妨礙的細胞的實例。內皮細胞在全身體內平衡和重要疾病(包括(慢性)炎症和 癌症)的病理(生理)學方面具有關鍵作用。它們還是用於藥物遞送的有吸引力的靶細胞 /靶組織，因為它們是由血液轉運的任何化合物完全可進入的。此外，就外觀和功能而言， 內皮的異質性便於組織和疾病特異性藥物遞送方式。內皮細胞是用於癌症治療的有希望的 靶，因為血管生成對於向實體腫瘤供給氧和營養物是至關重要的。此外，在炎性疾病中，它 們引導白血細胞從血液移動到組織中，因此對於疾病的發展是必不可少的。本發明的發明 人觀察到，靶向在TNFa激活的內皮細胞上表達的E-選擇蛋白或VCAM-I的脂質體容易以 可比於巨噬細胞的胞吞能力的量被吞噬。然而，不同於巨噬細胞，內皮細胞並不廣泛地處理 或降解脂質體，因而在泡囊體內累積載藥載體。缺乏脂質體降解和/或去穩定作用會導致 封裝藥物保留在脂質體中，因而導致較差的藥理功效。因此，本發明的一個目的是提供一種基於脂質的藥物遞送載體，與已知遞送載體 相比，其便於改善在靶細胞中的細胞內藥物釋放。具體目標是提供一種基於脂質的藥物遞 送載體，用於在靶細胞(其並不專門清除和/或處理基於脂質的顆粒)中進行有效的細胞 內藥物釋放，如內皮細胞和上皮細胞、肌細胞、腦細胞、神經細胞、皮膚細胞、毛細胞、祖細胞的子集、和周細胞以及並不專門處理遞送載體的所有其它細胞。利用區別a)由靶細胞攝取的脂質體和b)在靶細胞中釋放來自脂質體的藥物的方法，本發明的發明人令人驚訝地發現，在「經典」或「傳統」脂質體的雙層(即由脂雙層包圍 的含水室)中加入合成的衍生自吡啶鐺的兩親物(或兩親分子，親水脂分子)會產生基於 脂質的遞送載體，其可以確保在並不專門處理基於脂質的顆粒的細胞中有效的細胞內藥物 遞送。僅包含雙層的脂質體，其中雙層包含一種或多種合成的衍生自吡啶鐺的兩親物，基於 總脂質含量，其量為2至25mol%，發現是足夠穩定的。因此，本發明提供了一種包括至少一 個封閉含水內室(或區室)的脂雙層的脂質體，其中所述脂雙層包含至少一種合成的衍生 自吡啶鐺的兩親物，基於脂質體的總脂質含量，所述兩親物的量為2至25mol%。在本領域已知，術語「脂質體」是指由磷脂雙層膜封閉(密封，包圍)的含水室。磷 脂分子由細長的非極性(疏水)結構和在一端的極性(親水))結構構成。當分散在水中 時，它們自發形成雙層膜，還稱作薄片，其由脂質分子的兩個單層片層構成，其中它們的非 極性(疏水)表面彼此面對並且它們的極性(親水)表面面向含水介質。兩親物是一種由具有連接於水不溶性烴鏈的極性水溶性基團的分子構成的化合 物。吡啶鐺是指吡啶的陽離子形式。這可以是由於環中的氮的質子化或由於取代基加入到 環中的氮上，通常藉助於烷基化。在吡啶的氮原子上的孤對電子並沒有被非定域，因此吡啶 可以容易地被質子化。如在本文中所使用的，措辭「衍生自吡啶鐺」是指在其極性基團中具 有吡啶鐺部分的任何兩親物。合成的衍生自吡啶鐺的兩親物在本領域是已知的。用於本發明特別感興趣 的是合成的衍生自吡啶鐺的兩親物的組，其被SynvoIux專利技術，SAINT (Synthetic， Amphiphilic, INTeractive)涵蓋。參見例如歐洲專利EP0755924-B1。在本發明的一種實施 方式中，至少一種合成的衍生自吡啶鐺的兩親物選自具有通式(I)的SAINT化合物的組 其中隊是(C1-C5)烷基、芳(烷基)或烷基基團，其具有陽離子官能團，如 或R1是(C「C5亞烷基)R5，其中R5是具有通式I的結構(除了 R1)；X是滷化物抗衡離子，選自Cl_、r、Br_;R3是氫以及R2和R4是相同或不同的並且選自包括支鏈或直鏈(Cltl-C2tl)烷基、單 或多不飽和(Cltl-C2tl)鏈烯基、0 = C-O-烷基的組、
或芳(烷基)，或RjPR4是氫以及R3是-CH (R5)2，其中R5包括(C10-C20)烷基、單或多不飽和 (C10-C20)鏈烯基、ο = C-O-烷基、 或芳烷基。在另外的實施方式中，結合有如上文所定義的SAINT分子，其中放棄的是具有通式I的化合物，其中R1是CH3、R2和R4是氫、R3是(C16H33) 2CH 並且X是所有提及的抗衡離子，並且否認的是這樣的化合物，其中R1是CH3、R2和R4是 C16H33-O-C(O)、R3是氫以及X是所有提及的抗衡離子。根據本發明的包括SAINT分子的脂質體還稱作「SAINT-o-somes」。本發明的具體 實施方式使用SAINT-18(氯化1-甲基-4-(順(或順式)-9_ 二油基)甲基-吡啶鐺)和 /或SAINT-12(氯化1-甲基_4-( 二十五烷-13-基)-吡啶鐺)。在本領域中還未描述或建議在傳統脂質體中結合合成的衍生自吡啶鐺的兩親物， 如SAINT。相反，SAINT分子迄今已用於非脂質體遞送載體(稱作「lipoplexes (陽離子脂 質體)」)，用於向哺乳動物細胞遞送大分子如核酸或蛋白質。EP-A-0755924例如披露了 大分子與SAINT的絡合，可選地以與輔助脂質的1 1混合物，以形成尺寸高達數ym的 lipoplex顆粒。在形成的lipoplex中，在SAINT與大分子之間僅存在非共價相互作用。在顆 粒表面上的陽離子兩親物對於帶負電荷的細胞表面具有高親和力。而EP-A-0755924的導 言部分簡單提到「由磷脂的雙層構成的脂質體」，必須強調的是，在EP-A-0755924中披露的 發明顯然並不涉及這樣的脂質體。相反，它涉及lipoplexes，其結構組織由Oberle等人使 用原子力顯微鏡(2000，Biophysical Journal 79 (3)，1447-1454)詳細地加以研究。Oberle 等人的圖7說明了，包含SAINT的lipoplexes，如例如在EP-A-0755924中所披露的，由纏繞 成若干層的兩親物的DNA構成，其隨後合併成較大的複合物。值得注意的是，一些DNA 「伸 出」lipoplex並且未被屏蔽自環境，如當結合在包含SAINT的脂質體的內室中時的情況，如 在本發明中所披露的。Rejman 等人(Biochimicaet Biophysica Acte 1660(2004)41-52)、 Zuhorn 等人(Biochmica etBiophysica Acta 1560 (2002) 25-36)、Van de Woude 等人 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, pp. 1160-1165,1997)以及 W02006/043809 同樣披露了 lipoplexes而不是包含含水內室的脂質體。相反，本發明涉及脂質體，其包括由脂雙層包圍的含水內部空間，其中結合有一種 或多種合成的衍生自吡啶鐺的兩親物。不希望受任何理論的約束，兩親物的陽離子吡啶鐺 首基的性能使脂質體脂雙層變得較少剛性的並更易於與細胞內、胞內體膜脂質進行脂質混合(例如，融合)，從而促進封裝化合物的細胞內釋放。如下文所說明的，對於僅任何陽離子兩親物並沒有觀測到這種效應，因為具有類似量的DOTAP (N-[1-(2，3- 二油醯氧基)]-N，N， N-三甲基銨丙烷)，一種眾所周知的陽離子脂質體轉染試劑，的脂質體呈現較差的性能。根據本發明的脂質體具有一種或多種衍生自吡啶鐺的兩親物。脂質體的確切組成 將取決於它們要使用的特殊環境。本領域普通技術人員將發現，確定適宜的脂質組成是一 種常規事情。關於脂質體的一般信息可以例如在Lasic，D.D. 「liposomes from physics toapplication」，Elsevier Science B. V. Amsterdam, 1993 (ISBN0444895485)中找到。在本發明的脂質體中的衍生自吡啶鐺的兩親物的相對量可以變化，但是基於脂質 體的其它脂質成分的總量通常高達約5-25mol%。這可以確保，脂質體在靶細胞之外(例 如，在血流中)是穩定的，同時它便於在與靶細胞膜混合或融合以後其封裝內容物的有效 的細胞內釋放。當使用相對於其它脂質包含5-20mol %，優選10-20mol %，如11、12、13、14、 15、16、17、18、19或20mol%的衍生自吡啶鐺的兩親物的脂質體時，獲得了很好的結果。具 體實施方式包括這樣的脂質體，其包含10-20mol%的SAINT分子，如10、11、12、14、15、17、 19 或 20mol% 的 SAINT-18 或 SAINT-12。在一種實施方式中，本發明的脂質體，除至少一種衍生自吡啶鐺的兩親物以外，基 本上由單一類型的脂質構成。在一種優選的實施方式中，脂質體包含兩種或更多種脂質的 混合物，其優先選自由甘油磷脂、鞘脂質以及膽固醇組成的組。可以使用天然存在和/或合 成的脂質。事實上，可以與至少一種衍生自吡啶鐺的兩親物聯合使用任何類型的形成脂質 體的脂質或分子，以形成根據本發明的脂質體。構成本發明的脂質體的脂質包括磷脂醯膽 鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂酸、神經節苷脂、糖脂、磷脂醯甘油、以及膽固醇。磷脂醯膽鹼優選 包括二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼(POPC)以及二 硬脂醯磷脂醯膽鹼。磷脂醯乙醇胺優選包括二肉豆蔻醯磷脂醯乙醇胺、二棕櫚醯磷脂醯乙 醇胺、以及二硬脂醯磷脂醯乙醇胺。磷脂酸優選包括二肉豆蔻醯磷脂酸、二棕櫚醯磷脂酸、 二硬脂醯磷脂酸、以及雙十六烷基磷酸。神經節苷脂優選包括神經節苷脂GM1、神經節苷脂 ⑶la、以及神經節苷脂GTlb。糖脂優選包括半乳糖苷神經醯胺、葡糖神經醯胺、乳糖神經醯 胺、磷脂、以及紅細胞糖苷脂。磷脂醯甘油優選包括二肉豆蔻醯磷脂醯甘油、二棕櫚醯磷脂 醯甘油、以及二硬脂醯磷脂醯甘油。體內研究表明，網狀內皮系統的細胞可以快速地從循環中除去常規的脂質體，即 存在於多個器官中的組織靜息巨噬細胞，尤其是脾臟和肝臟。當使用立體穩定的脂質體時 可以減小這種相互作用，其中立體穩定的脂質體可以通過在脂質體的脂雙層內插入單唾液 醯神經節苷脂(GMl)或聚(乙二醇)(PEG)衍生的脂質加以製備。塗布有惰性聚合物的這 樣的脂質體在它們的血液循環半衰期(在人類中為數天，相對於常規脂質體的數分鐘)方 面呈現出顯著的改善。具有細胞特異性識別性能的立體穩定的免疫脂質體經常是通過將抗體結合於PEG 鏈的遠端來製備。利用PEG鏈作為脂質體與抗體之間的接頭導致增強的抗體_抗原識別和 結合，因為抗體並沒有受到PEG的立體屏障活性的屏蔽。已開發了若干種共價偶合方法，用 於在PEG末端連接(衍生)抗體。它們利用功能化的PEG脂質，其具有化學反應性端基如 醯胼、N-(3』_(吡啶二硫基)丙酸酯、馬來醯亞胺、琥珀醯、對硝基苯基羰基或氰尿醯氯。因 此，在本發明的一種實施方式中，衍生(例如，PEG化)磷脂可以用來改善脂質體配方的體內循環時間，和/或用來便於蛋白質偶聯到脂質體表面。在一個具體方面中，本發明的脂質體包含相對量為1 1至2 l(mol%)的磷脂醯膽鹼和膽固醇的混合物，可選地以與一種 或多種天然或合成脂質(例如PEG化的磷脂)的混合物。脂質體本身可以通過任何常規方法，包括薄膜方法、逆相蒸發法、乙醇注入法、以 及脫水_再水合方法來製備。因此，本發明提供了一種用於製備根據本發明的脂質體的方 法，包括將常規脂質與合適量的至少一種合成的衍生自吡啶鐺的兩親物混合，並且按照常 規程序(步驟)來製備脂質體。還提供了可通過本發明的方法獲得的脂質體。例如，上述脂質的混合物，已從其除去溶劑，可以通過使用均化器加以乳化，凍幹， 然後融化，以獲得多層脂質體。可替換地，可以通過逆相蒸發法來製備單層脂質體(Szoka and Papahadjopoulos, 1978，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 :4194_4198)。還可以通過聲處 理或擠壓來製備單層泡囊(小泡)。在受控的溫度(如由脂質的熔點確定的)下，通常利用 浴式聲處理器(bath—type sonifier) Bransontip sonifier 來進對於聲處理。在脂質體製備以後，在形成期間還未確定尺寸的脂質體可以通過擠壓來確定尺 寸，以獲得脂質體尺寸的期望的尺寸範圍和相對狹窄的分布。脂質體的顆粒大小可以通過 超聲波輻射法、擠壓法、French壓製法、均勻化方法或任何其它合適的常規方法來控制。可以通過生物膜擠出機來進行擠壓，如Lipex生物膜擠出機(Lipex Biomembrane Extruder) (Northern Lipids Inc, Vancouver, British Columbia,力口拿大)。在擠壓過濾 器中規定的孔徑可以產生特定尺寸的單層脂質體囊泡。約200-400nm的尺寸範圍將使得可 以藉助於通過常規過濾器(例如，0.22微米過濾器)的過濾來對脂質體懸浮液進行殺菌。 可以在高通量的基礎上進行過濾滅菌法。脂質體還可以藉助於通過非對稱陶瓷過濾器，如 Ceraflow Microfilter (商業上可獲自 Norton Company,Worcester,Mass.)的擠壓來形成。對於治療應用，優選的是，根據本發明的脂質體具有高達約300nm的尺寸(即，直 徑)。在一種實施方式中，脂質體尺寸在約20至250nm，優選30-200nm之間的範圍內，如 50、60、75、100、120、135、150或18011111。各種各樣的脂質體可以用於本發明(包括少層囊泡 或多層囊泡)，但優選地脂質體是小單層囊泡(SUV)，其具有約30至約300納米(nm)，最優 選50至150nm的外徑。本發明的脂質體可以包括一種或多種其它有益成分，例如用於將脂質體靶向特定 細胞的物質(介質，劑，means)。將藥物部位特異性遞送至患病細胞可以導致增加的治療效 果並且導致顯著減少的毒性。通過抗體結合的脂質體或免疫脂質體進行的藥物靶向代表這 樣的一種技術，其已應用於靶向藥物作用的特異性部位如腦、肺、癌細胞、HIV感染的細胞或 免疫系統的細胞。脂質體靶向物質(靶向介質，靶向裝置)或靶向配體在本領域是已知的， 並且包括蛋白質、肽，如抗體或其片段，其對於特定靶細胞的表面抗原或對於特定的細胞內 室(如線粒體)具有特異性。在它們的表面提供有靶向抗體的脂質體在本領域被稱作免疫 脂質體。經常通過單克隆抗體與它們的特異性抗原的高親和力結合來介導部位特異性靶 向。美國專利第5，258，499號披露了遞送載體配方(劑型)，其包括封裝在其上連接有蛋白 質激素(配體)如白細胞介素_2的脂質體囊泡內的活性劑。配體能夠顯示對於特定細胞受 體的親和力，導致封裝的活性劑遞送到靶細胞中，在治療病症如免疫系統紊亂時能夠將活 性劑遞送到特定的細胞群體。在一種優選的實施方式中，攜帶靶向部分的脂質體，例如，配 體，被靶細胞內化。在又一種實施方式中，靶向部分是配體，其與酪氨酸激酶受體如，例如，EGFR、HER2、HER3、HER4、PD-GFR、VEGFR、bFGFR 或 IGFR 受體特異性地相互作用。在又一種 實施方式中，靶向部分與生長因子受體、血管生長因子受體、轉鐵蛋白受體、清除劑受體、細 胞粘附分子、或維生素受體特異性地相互作用。示例性的細胞特異性配體包括RGD肽、NGR 肽、ATWLPI3R 肽、APRPG 肽、SMSIARL 肽、TAASGVRSMH 肽、LTLRWVGLMS 肽、CDSDSDITWDQLWDLMK 肽、GPLPLR肽、HWGF肽、重組VEGF、抗體和單克隆抗體、雙特異性抗體以及單鏈片段，其是相 對於例如E選擇蛋白、VCAM-I、內皮糖蛋白(endogl in)、MHCII、VEGF :VEGFR複合物、α ν β 3、 moc-31、cd-90、以及其它細胞靶表位。另外的受體特異性配體如轉鐵蛋白、載脂蛋白E^L 鐵蛋白、修飾白蛋白等。在一種實施方式中，脂質體包括至少一種靶向配體，其經由接頭分子結合於 加入脂質體脂雙層中的SAINT分子。關於示例性的SAINT-接頭-配體分子，參見 W02006/043811。優選地，根據本發明的脂質體包括未修飾的(即，不包括靶向物質)SAINT 分子以及經由接頭其上結合有至少一種細胞或細胞器特異性配體的SAINT分子。考慮到位阻，修飾與未修飾SAINT分子的相對量優選小於5%，更優選小於1 %， 如大約0. 1 %。例如，製備了這樣的脂質體，其包含35. 8mol %的P0PC、40mol %的膽固醇、 4mol% 的PEG-DSPE、20mol% 的 SAINT C18 以及0. 2mol% 的 SAINT C18-接頭作為雙層成分。如上所述，本發明的脂質體包括內部空間，其可以用來將一種或多種感興趣的分 子，例如生物活性化合物，遞送到靶細胞。對於本發明來說，術語「生物活性化合物」旨在涵 蓋所有天然存在或合成的化合物，其能夠誘發生物反應或對生物系統，尤其是組織、細胞以 及細胞器，具有有益或有害的效應，包括細胞毒性。這些化合物旨在包括所有種類的藥物， 其包括抗生素藥物、抗菌藥物、抗病毒藥物、抗真菌藥物、抗炎藥物、抗增生藥物和抗腫瘤藥 物，以及作為療法發展的細胞內信號轉導的任何抑制劑，如MAPK或SAPK抑制劑；激素，包括 肽類激素和類固醇激素；基因，重組核酸，寡核苷酸或編碼所有或部分哺乳動物基因的其它 核酸，包括定製的小幹擾RNA(還稱作短幹擾RNA或siRNA)以及特別基因改造的短RNA分 子，其在調節基因表達中可以有效地沉默微小RNA的作用，如antagomirs，一種病毒基因或 來自微生物的基因；抗原；酶；營養物；以及最特別是任何生物活性化合物，其藉助於穿過 感興趣的靶細胞的細胞膜的被動滲透被低效吸收。在一個方面，脂質體在其內室中包括生 物活性化合物，其具有中性或陽性淨電荷，例如蛋白質物質。本發明的另一方面涉及包括根據本發明的脂質體的組合物。通常，本發明的脂質 體組合物在貯藏期間是相當穩定的，例如，如在本發明的脂質體內實體的初始加載一段時 間以後通過在脂質體外側釋放的或仍然保持在脂質體內的截留實體的百分比所測得的。例 如，在4°C下本發明的脂質體組合物在至少6個月是穩定的，例如，在初始加載實體6個月以 後小於10%的截留實體被釋放。在一種實施方式中，在4°C下本發明的脂質體組合物在至 少兩年是穩定的，例如，在初始加載實體兩年以後小於20%的截留實體被釋放。根據本發明的另一種實施方式，本發明的脂質體組合物可以提供為藥物組合物， 其包含本發明的脂質體組合物和載體，例如，藥用載體。藥用載體的實例是生理鹽水、等滲 葡萄糖、等滲蔗糖、林格氏液、以及Hanks液。可以添加緩衝物質以提供最適合於貯存穩定 性的PH值。例如，約6. 0至約7. 5之間的pH，更優選約6. 5的pH是最適合於脂質體膜脂的 穩定性，並便於截留實體的極好保留。通常以2-20mM濃度的組氨酸、羥基乙基哌嗪-乙基磺 酸酯(或鹽)(HEPES)、嗎啉基-乙基磺酸酯(或鹽)(MES)、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、以及檸檬酸鹽是典型的緩衝物質。其它適宜的載體包括，例如，水、緩衝水溶液、0. 4% NaCUO. 3%甘氨酸等。可以添加蛋白質、碳水化合物、或聚合物穩定劑以及張性調節劑，例如，明膠、白蛋 白、葡聚糖、或聚乙烯吡咯烷酮。藉助於葡萄糖或更加惰性的化合物如乳糖、蔗糖、甘露醇、 或糊精，可以將組合物的張性調節至0. 25-0. 35mol/kg的生理水平。可以通過常規的眾所 周知的殺菌技術，例如，通過過濾，來對這些組合物進行殺菌。所得到的水溶液可以包裝以 供使用或在無菌條件下過濾並凍幹，在給予以前將凍幹的製劑結合於無菌水介質。根據需要，藥物脂質體組合物還可以包含其它藥用輔助物質，以接近生理條件， 如PH調節劑和緩衝劑、張性調節劑等，例如，乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。 另外，脂質體懸浮液可以包括脂質保護劑，其保護脂質以在存儲期間避免自由基和脂質 過氧化損傷。親脂性自由基猝滅劑，如α-生育酚和水溶性鐵特異性螯合劑，如鐵草胺 (ferrioxamine),是適宜的。在液體藥物製劑中本發明的脂質體的濃度可以差別很大，即通常從按重量計小於 約0. 05%或至少約2-10%至高達30至50%，並且將主要通過液體容積、粘度等並按照所選 擇的特定給藥方式來選擇。例如，可以增加濃度以降低與治療有關的液體負荷。在患有動脈 粥樣硬化相關的充血性心力衰竭或重度高血壓的患者中，這可以是特別期望的。可替換地， 由刺激性脂質構成的脂質體藥物組合物可以被稀釋至低濃度，以減少在給藥部位的炎症。給予的脂質體藥物組合物的量將取決於若干因素，例如截留在脂質體內的特定的 治療性實體、待治療的疾病狀態、所使用的脂質體類型、和/或臨床醫生的判斷。通常，給予 的藥物脂質體組合物的量將足以遞送治療有效劑量的特定的治療性實體。為遞送治療有效劑量所必要的藥物脂質體組合物的量可以通過在藥物試驗 領域中常見的常規體外和體內方法來確定。參見，例如，D. B. Budman, A. H. Calvert, Ε. K. Rowinsky ( ), Handbook ofAnticancer Drug Development，Lffff，2003。禾中 治療性實體的治療有效劑量對於本領域技術人員來說是眾所周知的；並且根據本發明，與 通過給予相同量的在常規脂質體配方(並不包含至少一種合成的衍生自吡啶鐺的兩親物) 中的治療性實體所獲得的活性相比，經由本發明的藥物脂質體組合物遞送的治療性實體可 以提供至少相同、或2倍、4倍、或10倍更高的活性。通常，用於本發明的脂質體藥物組合 物的劑量在約0. 005至約500mg的治療性實體/公斤體重的範圍內，最經常，在約0. 1至約 IOOmg治療性實體/kg體重或靶向器官重量的範圍內。在一種實施方式中，本發明的藥物脂質體組合物被製備成局部劑或注射劑，作為 液體溶液或懸浮液。然而，還可以製備固體形式，其在注射以前適合於在液體載體中的溶液 或懸浮液。還可以按照本領域已知的方法，將組合物配製成腸溶片或凝膠膠囊。本發明的脂質體組合物可以以醫學上可以接受的任何方式給予，其可以取決於待 治療的病症或疾病。可能的給予途徑包括注射，通過胃腸道外途徑如肌內、皮下、靜脈內、動 脈內、腹腔內、關節內、硬膜內、鞘內、或其它途徑，以及口服、鼻、眼、直腸、陰道、局部、或肺， 例如，通過吸入。為了將根據本發明配製的脂質體藥物遞送到中樞神經系統的腫瘤，將脂質 體直接緩慢、持續顱內輸注到腫瘤中(對流增強遞送，或CED)是特別有利的。參見Saito 等人，Cancer Research, vol. 64, p. 2572-2579, 2004 ；Mamot, et al. , J. Neuro-Oncology, vol. 68,ρ. 1-9，2004。還可以將組合物直接施加於組織表面。緩釋、ρΗ依賴性釋放、或其它 特定化學或環境條件介導的釋放給予也明確地包括在本發明中，例如，通過這樣的方式如長效製劑注射、或可侵蝕植入物。期望在其靜脈內給予的情況下，平均顆粒直徑是400nm或更小。這是因為顆粒直 徑超過400nm的脂質體通過肝臟、脾臟以及類似的網狀內皮系統和肺而清除。還提供了一種用於促進生物活性化合物遞送到靶細胞(其並不專門用於清除和 處理來自血液的顆粒)的方法，包括靜脈內給予根據本發明的脂質體，該脂質體包含所述 生物活性化合物。另一方面涉及根據本發明的脂質體作為遞送載體，以體外或體內將感興 趣的物質引入靶細胞(其並不專門用於清除和/或處理基於脂質的顆粒)的應用。優選 地，所述靶細胞選自由內皮細胞、上皮細胞、肌細胞、腦細胞、神經細胞、皮膚細胞、毛細胞、 祖細胞的亞類(亞群)、以及周細胞組成的組。更優選地，靶細胞是內皮細胞。本發明的脂 質體和基於脂質體的遞送方法例如可以促進生物活性化合物(靶向)遞送到內皮細胞，例 如TNFa激活的內皮細胞。因此，如本文披露的脂質體被有利地用作藥物遞送載體。還提供了根據本發明的脂質體在用於製備治療癌症、慢性炎症、組織再生/修復、 糖尿病或代謝性疾病相關的細胞功能異常的藥物中的應用，上述脂質體包含至少一種生物 活性化合物，該生物活性化合物是在它的內部空間中和/或被插入脂雙層和/或共價或以 其它方式連接於脂質體成分之一。在一種實施方式中，提供有EPCAM靶向物質並封裝抑制細胞生長化合物的脂質 體用來製備治療癌症的藥物。在另一種實施方式中，提供有E選擇蛋白靶向物質並包含 P38MAPK抑制劑的脂質體用來製備治療腎小球腎炎或reuma的藥物。


圖IA 通過使用雙放射性標記的常規脂質體，即沒有合成的衍生自吡啶鐺的兩親 物並且除不可降解的[3H]膽固醇油基醚以外還包含可代謝降解的酯膽固醇[14C]油酸酯， 研究了在靶向E選擇蛋白(HES)或VCAM-I (VCAM)的HUVEC中抗E選擇蛋白免疫脂質體的 細胞內處理。在適當代謝的情況下，在胞吞以後，膽固醇酯被水解並且釋放的[14C]油酸將 從細胞釋放到培養基中。[3H]膽固醇油基醚將保持締合的，因此3H/14C比率是脂質體降解 的方便的度量[5]。如圖A所示，3H/14C比率在長期溫育以後並沒有變化，這表明缺乏膽固 醇-[14C]油酸酯的水解。甚至24h溫育也沒有導致雙標記的抗E選擇蛋白免疫脂質體的任 何顯著水解。在圖B中，比較了通過HUVEC的免疫脂質體的降解和通過IC21細胞(腹膜巨 噬細胞)的類似脂質體的降解。結果表明，相同的脂質體可以被特化細胞有效地降解。在 溶酶體降解的抑制劑(氯喹，NH4Cl)存在的條件下的溫育表明降解是溶酶體的(數據未示 出)。圖2 用抗E選擇蛋白免疫脂質體(沒有合成的衍生自吡啶鐺的兩親物)，其螢光 標記有脂雙層標記DiI JiTNFa激活的HUVEC溫育24h。脂質體已累積在不同的細胞內囊 泡中，同時沒有跡象表明螢光標記在細胞膜上的再分布，即，在被內皮細胞胞吞以後，脂質 體未被降解。圖3 如在一般方法中所描述的來製備根據本發明的脂質體，其包含指定量的合 成的衍生自吡啶鐺的兩親物(在這種情況下為SAINT-18)或參比陽離子兩親物D0TAP。在 指定的時期，在4°C和氬氣下，存儲脂質體。在指定時間通過動態光散射，利用Mcomp型380 亞微米顆粒分析器以容積稱重模式來分析脂質體顆粒大小。數據表示為單值(對於一個脂質體製劑)，或2至5個獨立的脂質體製劑的平均值士sd。圖4 如在一般方法中所描述的，製備脂質體。在沒有(圖A)或存在(圖B)10% (ν/ν)血清的情況下，將脂質體保持在37°C的恆溫水浴中或在室溫(20°C )的實驗臺上。在 指定時間，通過動態光散射，使用Mcomp型380亞微米顆粒分析器以容積稱重模式來分析 顆粒大小。數據表示為3或4個獨立的脂質體製劑的平均值士sd。圖5 如描述的，用增加量的衍生自吡啶鐺的兩親物來製備脂質體。當用O至 20mol%的SAINT C18來配製雙層時，脂質體是完全尺寸穩定的。在高於約20至25mol %衍 生自吡啶鐺的兩親物的情況下，脂質體開始降低它們的尺寸穩定性。圖6:作為pH值的函數，鈣黃綠素釋放自脂質體。用標準螢光計監測脂質體的 螢光，同時在96孔板中在具有指定pH的緩衝液中進行溫育。鈣黃綠素釋放涉及在用 Triton-XlOO處理後測得的脂質體的總螢光。數據表示為與沒有SAINT或DOTAP的脂質體 (3至4個獨立實驗的平均值士sd)相比的相對釋放。圖7 鈣黃綠素釋放自在pH 7. 4和pH 5下用20mol %的SAINT或DOTAP配製的脂 質體。用標準螢光計，在96孔板中，並在具有指定pH的緩衝液中，監測脂質體的螢光。鈣 黃綠素釋放涉及在用Triton-XlOO處理以後測得的脂質體的總螢光。數據表示為與沒有 SAINT或DOTAP的脂質體(3至4個獨立實驗的平均值士 sd)相比的相對釋放。與pH 7.4 相比，*p < 0. 005 ；與包含20mol% SAINT的脂質體相比，#p IOmol % SAINT 的脂質體，會導致增加的鈣黃綠素釋放(圖8)。接著，研究了從脂質體的體外鈣黃綠素 釋放。用TNFa激活內皮細胞，HUVEC，然後 用(a)用20mol % SAINT配製的抗E選擇蛋白免疫脂質體、(b)沒有SAINT的對照抗E選擇 蛋白免疫脂質體或(c)用20mol% SAINT配製的脂質體(沒有抗E選擇蛋白)進行溫育。 圖9顯然表明，用SAINT配製的免疫脂質體溫育的細胞顯示最多的鈣黃綠素螢光，這表明從 由細胞吸收的SAINT脂質體優先細胞內釋放螢光團。抗E選擇蛋白免疫脂質體的攝取並不 受到SAINT加入的影響(通過FACS使用DiI作為標記加以確定，參見圖10)，因此在圖9A和圖9B中吸收的脂質體量是類似的。用SAINT配製但沒有細胞靶向物質的脂質體在較低程度上被吸收(圖9C)。用脂質體進行的短期溫育證實了圖9的結果，上述脂質體用作為脂質標記的DiI 和作為封裝標記的鈣黃綠素進行雙標記。用TNF α激活4h的HUVEC被沒有SAINT或配製 有20mol% SAINT的抗E選擇蛋白免疫脂質體溫育5、15、30或60分鐘。在用沒有SAINT的 脂質體溫育的細胞中，在所有時間點觀測到主要是紅色螢光。相反，在用配製有SAINT的脂 質體溫育的細胞中，在早期時間點，除了紅色螢光外還觀測到黃色螢光。黃色螢光表明鈣黃 綠素的釋放，其螢光共處於脂質體。在30和60分鐘，還有可見的綠色螢光，這表明與脂質 體本身相比，脂質體內容物的不同的細胞內途徑(數據未示出)。利用FACS (半)量化了脂質體的攝取以及封裝鈣黃綠素從脂質體的釋放。TNF α激 活的HUVEC對E選擇蛋白靶向脂質體的攝取可比於用20mol% SAINT配製的脂質體和沒有 SAINT的脂質體，如通過測量脂質體DiI的平均螢光強度(任意單位)所確定的(圖10A)。 然而，與沒有SAINT的脂質體相比，從配製有20mol% SAINT的E選擇蛋白靶向脂質體的鈣 黃綠素釋放是8-10倍更高(圖10B)。用20mol % SAINT配製的並且包含特異性siRNA的E選擇蛋白靶向脂質體在下調 靶基因方面是非常有效的(圖11和圖12)。在TNFa激活的腎小球內皮細胞中，用20mol% SAINT配製的並且包含相對於白細胞介素_8 (IL-8)的siRNA的E選擇蛋白靶向脂質體可抑 制IL-8表達幾乎60%，同時未配製有SAINT的脂質體或包含對照(不規則的)siRNA的脂 質體則沒有影響(圖11)。這也適用於VE-鈣粘著蛋白的表達，在來自小鼠的內皮細胞系 中，使用用20mol% SAINT配製的E選擇蛋白靶向脂質體，其可以被有效地抑制大於60%。參考文獻(I)Bevilacqua MP, Pober JS, Mendrick DL, Cotran RS, GimbroneMA. Jr. Identification of an inducible endothelial-leukocyte adhesion molecule. Proc Natl Acad Sci USA. 1987 ；84 :9238_9242·(2)Derksen J, Scherphof G. An improved method for the covalentcoupling of proteins to liposomes. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes. 1985 ； 814 :151-155.(3)Kamps JA, Swart PJ, Morselt HW et al. Preparation andcharacterization of conjugates of (modified)human serum albumin andliposomes :drug carriers with an intrinsic anti-HIV activity. Biochim BiophysActa. 1996 ； 1278 183-190.(4)Peterson GL. A simplification of the protein assay method ofLowry et al. which is more generally applicable. Anal Biochem. 1977 ；83 346-356.(5) Bottcher CJF, Van Gent CM, Pries C. A rapid and sensitive sub-micro phosphorus determination. Anal Chim Acta. 1961 ；24 :203_204·
權利要求
一種包括至少一個封閉內部含水室的脂雙層的脂質體，其中，所述脂雙層包括基於所述脂質體的總脂質含量以高達25mol％的量的至少一種合成的衍生自吡啶鎓的兩親物。
2.根據權利要求1所述的脂質體，其中，所述衍生自吡啶鐺的兩親物的總量為2至 25mol %，優選 5 至 20mol %。
3.根據權利要求2所述的脂質體，其中，所述衍生自吡啶鐺的兩親物的總量為 10-20mol%。
4.根據權利要求1或2所述的脂質體，具有約30至約300納米(nm)，最優選50至 150nm的外徑。
5.根據前述權利要求中任一項所述的脂質體，其中，所述至少一種合成的衍生自吡啶 鐺的兩親物是Saint分子，優選地為選自在歐洲專利EP0755924中所要求的那些Saint分子。
6.根據權利要求4所述的脂質體，包括Saint-18(氯化1-甲基-4-(順-9- 二油基) 甲基_吡啶鐺)和/或Saint-12 (氯化1-甲基-4- ( 二十五烷_13_基)-吡啶鐺)。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的脂質體，所述脂質體被空間上穩定化，優選通過 在所述脂雙層內插入單唾液醯神經節苷脂(GMl)和/或聚(乙二醇)(PEG)衍生的脂質被 空間上穩定化。
8.根據前述權利要求中任一項所述的脂質體，包括在它的表面上的至少一種靶向物 質，所述靶向物質能夠識別並結合於特定靶細胞的表面分子或靶細胞的細胞內室。
9.根據權利要求8所述的脂質體，其中，所述靶向物質對於靶細胞的表面具有特異性， 所述靶細胞並不專門用於清除和處理顆粒，優選內皮細胞。
10.根據權利要求7至9中任一項所述的脂質體，其中，所述靶向物質是RGD肽基序、抗 E選擇蛋白抗體或抗VCAM-I抗體。
11.根據權利要求7至10中任一項所述的脂質體，其中，所述至少一種靶向物質經由接 頭分子而結合於插入到所述脂雙層中的Saint分子。
12.根據前述權利要求中任一項所述的脂質體，包括在它的內室中的和/或與它的脂 雙層相關的至少一種生物活性化合物。
13.根據權利要求12所述的脂質體，其中，所述生物活性化合物選自由抗生素藥物、抗 菌藥物、抗病毒藥物、抗真菌藥物、抗炎藥物、抗增生藥物以及抗腫瘤藥物；激素；核酸，包 括基因、重組核酸、寡核苷酸、SiRNA、病毒基因或來自微生物的基因；以及抗原組成的組。
14.一種用於製備根據權利要求1至13中任一項所述的脂質體的方法，包括將常規脂 質與適量的至少一種合成的衍生自吡啶鐺的兩親物混合，並按照常規程序來製備脂質體。
15.一種藥物組合物，包括根據權利要求12或13所述的脂質體和藥用載體。
16.根據權利要求1-13中任一項所述的脂質體作為遞送載體以將感興趣的物質體外 或體內引入到靶細胞中的應用，其中所述靶細胞並不專門用於清除和/或處理基於脂質的 顆粒，尤其是其中所述靶細胞選自由內皮細胞、上皮細胞、肌細胞、腦細胞、神經細胞、皮膚 細胞、毛細胞、祖細胞的亞類、以及周細胞組成的組。
17.根據權利要求1-13中任一項所述的脂質體作為藥物遞送載體的應用。
18.根據權利要求12或13所述的脂質體在治療癌症、慢性炎症、動脈粥樣硬化、組織再 生/修復、糖尿病或代謝性疾病相關的細胞功能異常中的應用。
全文摘要
本發明涉及分子醫學和藥理學的領域。更具體地說，本發明涉及脂質體以及它們作為用於治療性化合物的遞送載體的應用。提供了一種包括至少一個脂雙層的脂質體，該脂雙層封閉內室，其中所述脂雙層包括至少一種合成的衍生自吡啶鎓的兩親物，例如Saint分子。
文檔編號A61K9/127GK101848703SQ200880114802
公開日2010年9月29日 申請日期2008年9月5日 優先權日2007年9月7日
發明者喬安娜·埃娃·阿德裡安, 格裡耶傑·莫爾瑪, 約翰內斯·阿德裡安烏斯·安東尼厄斯·瑪麗亞·坎普斯, 馬塞爾·赫爾曼·約瑟夫·勒伊特斯 申請人:辛沃魯克斯Ip有限公司