臘梅屬植物抗偽狂犬病毒的用途的製作方法

2023-11-10 09:35:07

本發明具體涉及臘梅屬植物及其提取物在製備針對偽狂犬病毒的藥物的應用，所述的臘梅屬植物包括柳葉臘梅、浙江臘梅和山臘梅，屬於製藥
技術領域：
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背景技術：
：1.臘梅柳葉臘梅、山臘梅和浙江臘梅同屬蠟梅科臘梅屬植物，我國特產，主要分布於我國亞熱帶季風溼潤氣候區域的鄂、湘、川、渝、貴、豫、浙、贛、皖等省。蠟梅屬柳葉蠟梅(chimonanthussalicifoliuss.y.hu)、浙江蠟梅(chimonanthuszhejiangensism.c.liu)或山臘梅(chimonanthusnitensoliv.)等為畲族民間習用藥,從北宋年間起其乾燥葉就作為服用的食涼茶，近千年來用於治療和預防感冒。現代研究又有進展，其中，山臘梅提取物製備的顆粒製劑，有良好治療/預防感冒功效，已在市場銷售；柳葉蠟梅和浙江臘梅已載入2005和2015年的《浙江省中藥炮製規範》，主要成分為揮髮油，含有1.8-桉葉素、β-蒎烯、α-萜品烯醇、芳樟烯、欖香醇等40多種成分。傳統用途：性味微苦，辛，涼，歸肺、脾、胃經，用於治療感受風寒而引起肚脹、肚痛腹瀉，因飲食不當引起的消化不良、腹部脹痛和小兒疳積等症狀。浙江臘梅為臘梅科臘梅屬常綠灌木，產於浙江。群體遺傳學研究發現浙江臘梅和山臘梅相對近緣，山臘梅在湖南、福建、廣西貴州等地均有分布，而浙江臘梅未見分布，浙江臘梅僅分布於浙江龍泉，因此，結合形態、分子及地理分布特徵，我們認為浙江蠟梅是山蠟梅分布區的最東邊界的一個群體，可能只是山蠟梅的一種生態型(ecotype)，而不是獨立的分類單位。山臘梅(chimonanthusnitens)為常綠灌木，又稱之為毛山茶、巖馬桑(《新華本草綱要》)、亮葉臘梅(《經濟植物手冊》)、香風茶(《安徽中草藥》)、野臘梅(《雲南中藥資源名錄》)。產於安徽、浙江、江蘇、江西、福建、湖北、湖南、廣西、雲南、貴州和陝西等省區。民間使用歷史悠久，具有防治感冒、痰喘、咳嗽、慢性支氣管炎、細菌感染、發熱疼痛、炎症、蚊蟲叮咬及高血壓、高血脂等作用，亦有抗腫瘤、防治心腦血管疾病、改善微循環和抗衰老、抗氧化等作用，另外還具有調節人體機能、增強體質、提高機體免疫力、減少體脂、減肥等保健功能。該植物主產於江西德興大茅山區、婺源懷玉山區、安徽徽州齊雲山一帶，在浙江、福建、陝西等省亦有分布，資源較豐富。山臘梅揮髮油中主要成分是烯烴、醇類和烷酸類物質，分別為脫氫香橙烯、△-杜松烯、e-環氧金合歡烯、石竹烯、(-)-氧化石竹烯、α-杜松醇(7.08％)、(+)-匙葉桉油烯醇、杉木醇、十六烷酸。欖香烯等倍半萜類合物具有較好的抗腫瘤活性，黃酮類成分具有防治心腦血管疾病、改善微循環和抗衰老等多種功效。山臘梅藥片的溫熱蒸發物可抑制病毒，山臘梅揮髮油可抑制和殺滅病毒。1982年，《江西省藥品標準》就記載了「山臘梅片」和「山臘梅衝劑」，作為防治感冒和流行性感冒製劑在臨床上應用，市售良好。與山臘梅同屬的柳葉蠟梅和浙江臘梅雖在民間使用普遍，但在市場上還未有適合的製劑。藥理研究中柳葉蠟梅未見抗偽狂犬病毒的研究文獻報導。co2超臨界萃取技術具有低溫、快速、效率高、無汙染、提取物純度高、易分離等優點，適用於揮髮油的提取。賀建雲採用超臨界co2萃取小試設備，不加夾帶劑提取柳葉蠟梅中物質，總收率為3.68％，但未見超臨界二氧化碳萃取柳葉蠟梅物質的應用報導。本發明在已有研究的基礎上，採用新的未見報導的提取方案，優化已有製備柳葉臘梅提取物的工藝條件、參數以及研究柳葉臘梅新提取物的新用途；研究適合柳葉蠟梅提取物的軟膠囊、滴丸等製劑；為柳葉蠟梅提取物用於感染偽狂犬病毒的殺滅、治療和預防，提供有益支持。2.偽狂犬病偽狂犬病(porcinepseudorabies)是由偽狂犬病毒(pseudorabiesvirus，prv)引起的發生在多種家畜和野生動物體內的一種急性傳染病。發熱、奇癢、腦脊髓炎是主要的發病症狀。成年豬主要表現為隱形感染，妊娠母豬感染後主要表現為流產、死胎和呼吸系統疾病症狀，無奇癢。新生豬仔感染後除了出現神經症狀外還可侵害消化系統。本病呈世界性分布。豬是該病毒的主要宿主、長期儲存者和排毒者，也是重要的病毒傳播者。豬偽狂犬病毒給豬養殖業造成的損害僅次於豬瘟，每年會有數十億美元的經濟損失。1960年以後該病已遍及全世界50多個國家。我國目前有20多個省市發現了該病，並且呈現不斷蔓延擴大的趨勢。目前針對該病沒有特效藥，只能用疫苗進行預防，一旦該病在集約化豬場開始流行將會對豬養殖業造成重大經濟損害。另外，偽狂犬病毒也會感染雞、貓、狗、牛等動物，而現有疫苗只對豬感染有預防作用，所以，開發針對該病的有效藥迫切而急需。本發明中的臘梅提取物，不僅可以直接體外殺滅偽狂犬病毒，也可阻斷該病毒侵染細胞和抑制病毒在細胞中複製擴增，其中殺滅率可達99％以上，阻斷率和抑制率接近50％，具有潛在的開發為偽狂犬病毒消毒劑和體內用藥製劑的價值。技術實現要素：發明概述本發明要解決的技術問題是提供一種新的抗偽狂犬病毒的藥物，具體而言，本發明提供了一種臘梅屬植物、臘梅屬植物提取物在製備抗偽狂犬病毒的藥物中的應用。所述的臘梅科臘梅屬植物包括：柳葉蠟梅或浙江臘梅或山臘梅。在本發明的具體實施方案中，所述的提取物為以下一種或多種：(1)水提物；(2)醇水混合提取物；(3)水蒸氣蒸餾揮髮油；(4)超臨界二氧化碳萃取。本發明第二方面提供了上述臘梅屬植物提取物的製備方法。本發明第三方面公開含有臘梅屬植物提取物的製劑，所述的藥物與藥學上接受的輔料製成藥劑學上接受的口服製劑。本發明第四方面公開了浙江臘梅提取物用於(1)治療家畜、家禽和伴侶動物、野生動物、鳥類的細菌與病毒等微生物感染的疾病；(2)畜牧飼料與添加劑；(3)消殺劑。發明詳述本發明第一方面提供了一種臘梅屬植物、臘梅屬植物提取物在製備抗偽狂犬病毒的藥物中的應用。本發明中所述的藥材或原藥材是指臘梅屬植物，具體包括柳葉臘梅、浙江臘梅、山臘梅。本發明中所述的生藥也是指臘梅屬植物，具體包括柳葉臘梅、浙江臘梅、山臘梅。本發明的臘梅屬植物包括臘梅屬植物的鮮品或幹品；臘梅屬植物的藥用部位選自臘梅屬植物的全株、地上部分、地下部分、莖、莖皮、花、葉、種子或任意組合；優選的藥用部位選自臘梅屬植物的地上部分、莖、莖皮、葉或任意組合；更優選的藥用部位選自臘梅屬植物的莖或葉；最優選的藥用部位選自臘梅屬植物的葉。本發明的第二方面提供了臘梅屬植物提取物的製備方法。在本發明的具體實施方案中，所述的臘梅屬植物提取物為以下用水提、醇提、水蒸氣蒸餾及超臨界二氧化碳提取一種或多種：(1)水提物；(2)醇提物；(3)水蒸氣蒸餾揮髮油；(4)超臨界二氧化碳提取物。為了加快提取速度，提高提取收率，可以對臘梅屬原藥材進行粉碎，粉碎後的平均粒徑優選10-80目，更優先是20-65目，最優選是30-50目。本發明提供的提取物的第一種製備方法：所述提取物是按照包括如下步驟製備：原藥材臘梅屬植物加入溶劑提取，過濾並濃縮濾液，乾燥獲得。所述的溶劑：本領域常用的溶劑均可以用於本發明。優選溶劑水和c1-c5的醇類。c1-c5的醇類選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇或其混合物。選自水、無水乙醇、乙醇水溶液；更優選溶劑選自乙醇水溶液。乙醇或乙醇水溶液和其他溶劑相比，具有低毒，防腐，汙染小，價格低等優點，更適合於本發明應用於醫藥產品工業化大生產。乙醇水溶液的濃度(乙醇水溶液中含有的乙醇的體積百分比)：優選30％-100％的乙醇水溶液，更優選50％-95％的乙醇水溶液，進一步優選優選60％-80％的乙醇水溶液，最優選75％的乙醇水溶液。溶劑的量是指提取每公斤原藥材所用的溶劑量，即提取每公斤藥材計使用溶劑的重量(單位kg)或體積(單位l)。溶劑用量是原藥材用量的2-30倍；更優選5-16倍；進一步優選6-15倍；最優選8-10倍。提取的溫度：優選是室溫到溶劑回流的溫度；更優選是40℃-溶劑回流的溫度；進一步優選是50℃-溶劑回流的溫度；最優選是溶劑回流的溫度。提取的次數：可以是1～5次；優選是2～3次。提取的時間：每次0.5～5小時；優選每次0.5～3小時；更優選每次1～3小時。濃縮的溫度：可以是55～90℃；優選62～80℃；更優選65～75℃。濃縮後稠膏的相對密度為1.1～1.5，優選1.2～1.4。在本發明的一個具體實施方案中，所述的提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經水提取並獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經3-30倍的水提取並獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經5-16倍的水提取並獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經8-16倍的水提取並獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經乙醇提取並獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經3-30倍的30％-100％的乙醇水溶液提取並獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經3-30倍的50％-95％的乙醇水溶液提取並獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經3-30倍的65％-80％的乙醇水溶液提取並獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經5-15倍的30％-100％的乙醇水溶液提取並獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經5-15倍的50％-95％的乙醇水溶液提取並獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經5-15倍的60％-80％的乙醇水溶液提取並獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經8-10倍的30％-100％的乙醇水溶液提取並獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經8-10倍的50％-95％的乙醇水溶液提取並獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是柳葉臘梅或浙江臘梅或山臘梅經8-10倍的60％-80％的乙醇水溶液提取並獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是按照包括如下步驟製備：原藥材加入5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的水、無水乙醇、乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小時(包括0.5～3小時，包括1～3小時)，過濾並濃縮濾液，乾燥獲得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是按照包括如下步驟製備：原藥材加入5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的水、無水乙醇、乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小時(包括0.5～3小時，包括1～3小時)，過濾並合併提取液，經濃縮至相對密度為1.1～1.5(包括1.2～1.4)的稠膏，減壓乾燥，即得。在本發明的一個具體實施方案中，所述提取物是按照包括如下步驟製備：原藥材加5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的30～99％的乙醇水溶液回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小時(包括0.5～3小時，包括1～3小時)，過濾並合併提取液，60～90℃(包括65～75℃)濃縮至相對密度為1.1～1.5(包括1.2～1.4)的稠膏，減壓乾燥，即得。本發明提供的提取物的第二種製備方法：所述提取物是原藥材臘梅屬植物經水蒸氣蒸餾並獲得的水蒸氣蒸餾揮髮油。本發明提供的提取物的第三種製備方法：所述提取物是原藥材經超臨界二氧化碳提取並獲得。本發明的超臨界提取物，其特徵在於，所述提取物是原藥材臘梅屬植物經二氧化碳超臨界提取，在分離釜中獲得提取物，提取的條件可以是一種或多種，例如：(1)不加夾帶劑的提取物；(2)加夾帶劑的提取物；(3)不加夾帶劑提取後再加夾帶劑的提取物。超臨界二氧化碳提取的條件如下：萃取釜:萃取溫度為30-70℃；優選為35-60℃；更優選為40-50℃；最優選43-47℃。萃取溫度可以選自40℃，42℃，45℃，47℃，50℃。萃取壓力為10-40mpa；優選為13-35mpa；優選為16-24mpa；更優選為18-22mpa。萃取壓力可以選自15mpa，20mpa，20.6mpa，29.6mpa，30mpa。萃取釜可以是1個或多個分離釜，例如1個，2個，3個，4個，5個或更多。如果是多個萃取釜的，可以是並聯或串聯。為了儘量節約原藥材的加料和卸料時間，提高生產效率，優選是多個萃取釜並聯。在一部分萃取釜加料或卸料的時候，另外的萃取釜同事進行萃取。萃取劑流速：萃取劑二氧化碳的流速會對本發明的生產效率產生重大的影響。如果二氧化碳的流速過快，二氧化碳和萃取溶質不能充分接觸，會降低每體積二氧化碳的萃取效率；如果二氧化碳的流速過慢，會降低單位時間的生產效率。因此，萃取劑二氧化碳的流速需要一個合適的流速。萃取劑二氧化碳的流速為每公斤藥材每小時20-150升(以每公斤藥材每小時計，單位為l/h·kg生藥)，即20-150l/h·kg；優選的萃取劑二氧化碳的流速為23-125l/h·kg；更優選為33-80l/h·kg；進一步優選為50-70l/h·kg；最優選為55-65l/h·kg。萃取劑二氧化碳的流速可以選自23.1l/h·kg；23.8l/h·kg；28.5l/h·kg；32.3l/h·kg；32.8l/h·kg；36.2l/h·kg；38.3l/h·kg；35.3l/h·kg；44.8l/h·kg；50.7l/h·kg；55.4l/h·kg；75.6l/h·kg；82.2l/h·kg。萃取時間分鐘(min)：30-400min，優選120-160min，更優選120-160min，最優選120-160min。萃取時間可以是60-70min，70-80min，80-100min，110-120min，120-130min，140-150min，155-165min。例如萃取時間可以是62min，70min，83min，100min，120min，132min，145min，160min。夾帶劑:本發明的超臨界提取方案中，可以選擇性的使用夾帶劑或不使用夾帶劑；優先是使用夾帶劑。本領域常用的溶劑均可以作為本發明的夾帶劑。例如本發明的夾帶劑可以選自：0％-100％v/v的乙醇水溶液、甲醇，乙酸乙酯、丙酮等中至少一種，即作為帶劑的溶劑可以是單一溶劑，或其中任何一種溶劑與另一種、及多種溶劑間的彼此混合溶劑等。本文中100％v/v的乙醇水溶液表示無水乙醇；本文中0％v/v的乙醇水溶液表示沒有醇的水。例如本發明的夾帶劑可以選自：水、無水乙醇、30％-100％v/v的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮。優選的夾帶劑選自水、無水乙醇、30％-99％v/v的乙醇水溶液。更優選的夾帶劑選自75％-95％v/v的乙醇水溶液。最優選的夾帶劑選自95％v/v的乙醇水溶液。夾帶劑的量(以每公斤藥材計為l/kg，kg/kg；或以每克藥材計為ml/g，g/g)：夾帶劑的量為0.10-2.5l/kg；；優選0.20-1.5l/kg；，更優選0.30-0.80l/kg；最優選0.40-0.60l/kg；分離釜：分離釜的溫度為25-70℃，優選為30-60℃；更優選為35-55℃，最優選為40-50℃，。分離釜的溫度可以選自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，41℃，42℃，43℃，44℃，45℃，46℃，47℃，48℃，49℃，50℃，51℃，52℃，53℃，54℃，55℃，56℃，57℃。分離釜的壓力為2-17mpa；優選為3-15mpa；更優選為4-12mpa；最優選為4.5-10mpa。分離釜的壓力可以選自4.65mpa，4.9mpa，5.1mpa，5.2mpa，5.3mpa，5.4mpa，5.5mpa，5.6mpa，5.7mpa，5.8mpa，6mpa，7mpa，8mpa，8.5mpa，9mpa，9.5mpa，10mpa。分離釜可以是1個或多個分離釜，例如1個，2個，3個，4個，5個或更多。如果是多個分離釜的，可以是並聯或串聯，為了儘量提高提取物的回收率，優選是多個分離釜串聯。分離釜i壓力和溫度：分離釜i的溫度為30-70℃，優選為50-60℃；更優選為53-57℃；最優選為55℃。分離釜i的溫度可以選自53℃，54℃，55℃，56℃，57℃。分離釜i的壓力為4-17mpa；優選為5-15mpa；更優選為6-12mpa；最優選為8-10mpa。分離釜i的壓力可以選自8mpa，8.5mpa，9mpa，9.5mpa，10mpa。分離釜ii壓力和溫度：分離釜ii的溫度為25-50℃，優選為30-45℃；更優選為32-42℃；最優選為35-40℃。分離釜ii的溫度可以選自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃。分離釜ii的壓力為2-8mpa；優選為3-7mpa；更優選為4-6mpa；最優選為4.5-5.5mpa。分離釜ii的壓力可以選自4.65mpa，4.9mpa，5.1mpa，5.2mpa，5.3mpa，5.4mpa，5.5mpa。分離釜iii壓力和溫度：分離釜iii的溫度為25-50℃，優選為30-45℃；更優選為32-42℃；最優選為35-40℃。分離釜iii的溫度可以選自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃。分離釜iii的壓力為2-8mpa；優選為3-7mpa；更優選為4-6mpa；最優選為4.5-5.5mpa。分離釜iii的壓力可以選自4.65mpa，4.9mpa，5.1mpa，5.2mpa，5.3mpa，5.4mpa，5.5mpa。分離釜中的得到的提取物，就是本發明的臘梅屬植物提取物。在本發明的一個具體實施方案中，是對原藥材不加夾帶劑的進行超臨界提取，原藥材加入萃取釜，萃取釜溫度為40℃-50℃，壓力為15mpa-40mpa，二氧化碳氣體通過萃取釜的流量為100-250kg/小時，萃取時間為90-300分鐘，分離釜i的溫度為50℃-60℃，壓力為7.5mpa-9mpa，分離釜ii的溫度為35℃-45℃，壓力為4.8mpa-6mpa，分離釜中的得到的提取物即為本發明的提取物。在本發明的一個具體實施方案中，是對原藥材加夾帶劑進行超臨界提取，原藥材加入萃取釜，萃取釜溫度為40℃-50℃，壓力為15mpa-40mpa,加入夾帶劑，二氧化碳氣體通過萃取釜的流量為23-125l/h·kg生藥，萃取時間為90-300分鐘，分離釜i的溫度為50℃-60℃，壓力為7.5mpa-9mpa，分離釜ii的溫度為35℃-45℃，壓力為4.8mpa-6mpa；分離釜中的得到的提取物即為本發明的提取物。所述的夾帶劑選自水、無水乙醇、30％-99％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮等中至少一種，即作為帶劑的溶劑可以是單一溶劑，或其中任何一種溶劑與另一種、及多種溶劑間的彼此混合溶劑等。在本發明的一個具體實施方案中，是對原藥材先不加夾帶劑進行超臨界提取後再加夾帶劑的進行提取，原藥材加入萃取釜，萃取釜溫度為40℃-50℃，壓力為15mpa-40mpa，分離釜i的溫度為50℃-60℃，壓力為7.5mpa-9mpa，分離釜ii的溫度為35℃-45℃，壓力為4.8mpa-6mpa；二氧化碳氣體通過萃取釜的流量為23-125l/h·kg生藥，萃取時間為90-300分鐘；放出分離釜中的提取物；再加入夾帶劑，二氧化碳氣體通過萃取釜的保持流量為23-125l/h·kg生藥，再萃取90-300分鐘；分離釜中再次得到的提取物即為本發明的提取物。所述的夾帶劑選自水、無水乙醇、30％-99％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮等中至少一種，即作為帶劑的溶劑可以是單一溶劑，或其中任何一種溶劑與另一種、及多種溶劑間的彼此混合溶劑等。本領域常用的乾燥均可以用於本發明，例如：減壓乾燥、噴霧乾燥、冷凍乾燥、熱風乾燥、遠紅外線乾燥或微波乾燥。或聯合使用上述一種或多種乾燥方式。本發明提供的提取物的第四種製備方法：所述提取物是原藥材經二氧化碳超臨界提取後，其剩餘的藥材再加入溶劑提取，過濾並濃縮濾液，乾燥獲得。具體的提取方法可以第一種方式相同。在本發明中，術語「提取」可以是常溫下的浸漬，或者超臨界狀態下的提取，或者在升高的溫度下的提取(例如煎煮和/或回流)，或者這些操作方式的結合。還可以進一步包括對提取物進行進一步處理，例如進一步純化，例如除溶劑、沉澱除雜質、溶劑萃取、樹脂吸附分離等。如本文所述的，術語「提取物」將包括可用於實現本發明任何目的的任何純度的提取物，提取物的提取純度可以在較大的範圍內變化。本發明第三方面公開含有臘梅屬植物提取物的製劑，所述的藥物與藥學上接受的輔料製成藥劑學上接受的口服製劑。本發明第三方面的製劑，其特徵在於，所述的製劑為柳葉蠟梅或浙江臘梅或山臘梅的提取物製劑。本發明第三方面的製劑，其特徵在於，所述的製劑的組合物還包含一種或多種無毒生理學可接受的載體。所述的可接受的載體包括本領域公知的任何輔料及起控釋作用的輔料。常用的輔料包括稀釋劑、黏合劑、潤溼劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、致孔劑、增塑劑、填充劑、增溶劑和乳化劑。稀釋劑可以是但不限於澱粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；溼潤劑可以是但不限於水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是澱粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是但不限於幹澱粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯聚乙烯吡咯烷酮、交聯羧甲基纖維素鈉、羧甲基澱粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉等；潤滑劑和助流劑可以是但不限於滑石粉、二氧化矽、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇；增溶劑和乳化劑可以是但不限於乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油類(特別是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇、聚乙二醇和脫水山梨糖醇的脂肪酸酯及它們的混合物。起緩控釋作用的輔料可以選自親水性凝膠材料、蠟脂類材料和不溶性材料的一種或多種。所述的親水性凝膠材料可以選自羥丙基甲基纖維素、卡波普、羧甲基纖維素鈉和海藻酸鹽，所述的蠟脂類材料可以選自十六醇、十八醇、蜂蠟、山嵛酸甘油酯、硬脂酸和巴西棕櫚蠟，所述的不溶性材料可以選自乙基纖維素、丙烯酸樹脂、聚氧乙烯和聚乙烯。此外，如需要，可向藥物製劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加劑。本發明第三方面的製劑，其特徵在於，所述製劑包含柳葉蠟梅或浙江臘梅或山臘梅的提取物和藥學上可接受的載體製成的製劑。可通過將組合物與一種或多種藥學上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結合，製成適於人或動物使用的任何劑型。該製劑可根據本領域公知的方法製備。本發明第三方面的製劑，其特徵在於，所述製劑優選噴霧劑、口服製劑、畜牧用藥。本發明第四方面公開了浙江臘梅提取物用於(1)治療家畜、家禽和伴侶動物、野生動物、鳥類的細菌與病毒等微生物感染的疾病；(2)畜牧飼料與添加劑；(3)消殺劑。有益技術效果目前，偽狂犬病遍及全世界50多個國家，在我國有20多個省市發現該病，且仍在不斷蔓延擴大，更為嚴重的是偽狂犬病尚無有效藥。本發明提供了製備直接殺滅偽狂犬病毒的藥物和製備預防和/或治療偽狂犬病毒感染的藥物的提取物，為偽狂犬病毒的殺滅和偽狂犬病的預防和治療藥物的開發提供了潛在的可能性。在本發明的研究過程中發現三個品種臘梅柳葉臘梅、浙江臘梅、山臘梅的水提、醇提、揮髮油和超臨界樣品對偽狂犬病毒均有不同程度的殺滅、阻斷和抑制作用。其中，對病毒的直接殺滅作用尤為顯著，殺滅率均大於50％，對病毒的抑制效果也較佳，抑制率接近50％，對病毒亦有明顯阻斷作用。具體實施方式提取物製備實施例實施例1-4取粉碎後藥材，裝入圓底燒瓶中，分兩次加水回流提取。第一次加10-16倍水，提取1小時後過濾，第二次加水8-12倍，提取1小時，合併兩次濾液。旋轉蒸發儀上濃縮或水浴鍋上濃縮，水浴75℃、轉速80rpm,濃縮至比重為1.18－1.22時，傾倒入不鏽鋼盤中置減壓乾燥烘箱65℃，真空烘乾後粉碎。柳葉蠟梅的水提物編號lys，浙江臘梅的水提物編號zys，山臘梅的水提物編號sys。序號方法品名藥材重(g)一次二次浸膏(g)收率(％)樣品編號實施例1水提柳葉蠟梅60013倍水10倍水14023lys(140601)實施例2水提柳葉蠟梅100016倍水16倍水20620lys(140607)實施例3水提山臘梅33010倍水8倍水89.627.15sys(161217)實施例4水提浙江臘梅37010倍水8倍水11731.6zys(161218)實施例5-7醇提：取柳葉臘梅乾燥老葉粉碎後藥材，裝入圓底燒瓶中，分兩次加乙醇回流提取。第一次加10倍乙醇，提取1小時後過濾，第二次加乙醇8倍，提取1小時，合併兩次濾液。旋轉蒸發儀上濃縮，水浴65℃、轉速80rpm，濃縮至比重為1.18－1.22時，傾倒入不鏽鋼盤中置減壓乾燥烘箱65℃，真空烘乾後粉碎。序號方法品名藥材重(g)一次二次浸膏(g)收率(％)樣品編號實施例5醇提柳葉蠟梅60013倍70％醇提10倍70％醇提14825lyc(140602)實施例6醇提山臘梅25010倍70％乙醇8倍70％乙醇71.828.7syc(161225)實施例7醇提浙江臘梅30010倍70％乙醇8倍70％乙醇9230.6zyc(16112)實施例8-11稱取適量已粉碎的藥材，裝入5-20倍水提時，裝好揮髮油提取器，待油產生後收集。序號方法品名藥材重/g加水量揮髮油收率/％樣品編號實施例8水蒸餾柳葉蠟梅60010倍水40ml3.6lyy實施例9水蒸餾柳葉蠟梅10008倍水26.8g2.68lyy實施例10水蒸餾浙江臘梅11308倍水26.6g2.33zyy(161030)實施例11水蒸餾山臘梅10008倍水13g1.3syy(161030)實施例12開啟電熱控制系統和製冷系統。稱取6.4kg柳葉蠟梅葉子，置於24l萃取釜中。稱取3.2kg95％乙醇，放置於副泵的儲箱中，開啟副泵(r＝9.1r/min),60min內加夾帶劑結束。萃取釜ii、分離釜i、分離釜ii、分離釜iii的壓力分別為20.7mpa、8.5mpa、5mpa、5mpa，溫度分別為45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的轉速r＝30.5r/min，二氧化碳流速為220-240l/h。從分離釜i和分離釜ii出料口收集產物，基本無產物時停止實驗，用時135min。後處理：分離i得到固體1.3g，編號lylj-1(2-6)；抽濾分離ii收集產品，抽濾得膏狀物13g，編號lylj-2-b(2-6)；濾液70℃旋轉蒸發得187.4g黑色油狀物，編號lylj-2-y(2-6)，總收率3.15％。附圖說明圖1prv對vero細胞的毒力測定形態學觀察結果a：正常細胞；b：prv感染細胞圖1顯示正常vero細胞呈梭形和扁平不規則形狀，細胞間緊密相連，層次感強。不同稀釋度的prv病毒液液接種於vero細胞後，低稀釋度的病毒孔細胞第二天出現病變，之後逐漸明顯，表現為細胞變圓突起、膨脹、體積變大、折光性增強、開始皺縮並逐漸脫落。圖28種中藥提取物對vero細胞增殖的影響圖2顯示，lyc、lys、zys、zyy、sys、syy、lyy、lylj-2-y(2-6)對vero細胞的最大無毒濃度分別是0.625ug/ml、1.25ug/ml、25ug/ml、100ug/ml、1.25ug/ml、2.5ug/ml、200ug/ml、5ug/ml。(ap<0.01,bp<0.01andcp<0.01vs0μg/ml)圖3lyy和lylj對prv吸附細胞阻斷作用的形態學觀察結果圖3顯示，顯微鏡形態學觀察發現，與正常細胞對照組相比，lyy濃度12.5－200μg/ml和lylj濃度0.3125－5μg/ml範圍內，細胞有病變，且部分已脫落，但病變程度較病毒對照組輕，且隨著藥物濃度的提高病變程度逐漸減輕。圖4lyy和lylj對prv增殖抑制作用的形態學觀察結果圖4顯示lyy和lylj對prv在vero細胞上增殖的抑制作用。光學顯微鏡觀察發現，與正常對照組比較，lyy濃度12.5－200μg/ml以及lylj濃度1.25－5μg/ml時，細胞有病變，且部分已脫落，但病變程度較病毒對照組輕，且隨著藥物濃度的提高病變程度逐漸減輕。圖5lyy和lylj對prv直接殺滅作用的形態學觀察結果圖5顯示lyy和lylj對prv的殺滅作用。顯微鏡觀察發現，與病毒對照組相比，lyy高濃度尤其100和200μg/ml病變細胞甚少。lyy濃度12.5、25和50μg/ml以及lylj濃度在1.25－5μg/ml時，細胞有病變，但病變程度相對較輕，且隨著藥物濃度的增加病變程度逐漸減輕。藥理實驗實施例1：臘梅樣品抗豬偽狂犬病毒活性檢測實驗1.材料1.1實驗病毒株：豬偽狂犬病病毒(prv，barthak61株)：碩騰公司美國查理斯堡公司。細胞：非洲綠猴腎細胞(vero)，浙江大學動物科學學院天然藥物實驗室傳代保存。1.2樣品：實施例1、3、4、5、8、10、11、12所得產物。1.3主要儀器：co2細胞培養箱：mco-15ac型，日本三洋(sanyo)公司；電子天平：sartorius1700型，德國w-germany；超淨工作檯：sw-cj-1f型，蘇州安泰空氣技術有限公司；離心機：ld5-2a型，北京醫用離心機廠；酸度計：orionstara211，thermo公司；酶標儀：bio-rad680型，美國伯樂bio-rad公司；生物倒置顯微鏡：xds-1b型，重慶光學儀器廠；電熱恆溫水浴鍋：dk-s26型，上海精宏實驗設備有限公司；微量振蕩儀：mh-1型，江蘇海門其林貝爾儀器製造有限公司；漩渦混合器：wh-861型，江蘇太倉華利達實驗設備有限公司。1.4試劑：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(mtt)、dmem培養基購自sigma公司；二甲基亞碸(dmso)購自國藥集團化學試劑有限公司；0.25％胰酶購自吉諾生物醫藥技術有限公司；胎牛血清購自gibco公司；完全培養液(含10％胎牛血清以及雙抗的dmem培養液)；細胞維持液(含2％胎牛血清的dmem培養液)；磷酸緩衝液(pbs，ph7.4)，本實驗室自製。1.5主要試劑的配製3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(mtt)溶液：稱取mtt粉末，加入pbs，溶解，製成2mg/ml的mtt溶液。2.實驗方法2.1vero細胞復甦和培養從液氮灌中取出凍存的vero細胞，於37℃水浴快速融化，用75％乙醇擦拭凍存管口，將凍存管中液體轉移至預先加有預冷pbs的離心管中，1200r/min離心5min，棄上清。細胞沉澱以含10％胎牛血清的dmem完全培養液重懸，轉移至細胞培養瓶中，置37℃、5％co2細胞培養箱培養，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。2.2prv的tcid50測定vero細胞以0.75×105/ml濃度接種96孔細胞培養板，貼壁培養24h。將prv液按10倍作倍比稀釋，加入到鋪滿vero細胞的96孔培養板中，每個稀釋度重複8孔，置於37℃、5％co2細胞培養箱中孵育，期間每隔30分鐘搖晃一次。2h後棄去上清，加入維持液繼續培養。分別於接毒後12、24、48、72h置倒置顯微鏡下觀察。比較不同稀釋度的細胞病變情況(cpe)，有細胞病變的判為陽性，無細胞病變的為陰性，採用reed-muench法計算prv在vero細胞中的tcid50。2.3試驗藥物對vero細胞的最大安全濃度的測定vero細胞以0.75×105/ml的濃度接種96孔細胞培養板，貼壁培養24h。lyy初始濃度(400μg/ml)採用dmem培養液作2倍倍比稀釋至25μg/ml，lylj初始濃度(40μg/ml)向下2倍倍比稀釋至0.625μg/ml，依次加到長成單層vero細胞的96孔細胞板上，100μl/well，每個稀釋度重複8孔，另設細胞對照孔，置於37℃、5％co2細胞培養箱培養。孵育2h後，棄培養上清，加入維持液繼續培養，每天觀察細胞狀態，以48h時，8孔均未出現細胞病變的濃度作為最大安全濃度。同時，另一批細胞於藥物作用44h後，每孔加入mtt溶液(2mg/ml)50μl，繼續孵育4h，2000r/min離心5min，甩去上清，每孔加入150μl酸性dmso溶液(192μldmso加8μl1nhcl)，振蕩儀振蕩，俟結晶完全溶解，採用酶標儀于波長492nm處測定od值(od492)。2.4對prv吸附細胞的阻斷作用以最大安全濃度作為初始濃度，用dmem培養液作2倍倍比稀釋後，分別加入到長成單層vero細胞的96孔細胞培養板上，每個濃度8個復孔，100μl/well，於37℃、5％co2細胞培養箱培養。孵育2h後棄去上清，每孔加入100tcid50的prv病毒液100μl，於37℃、5％co2細胞培養箱繼續孵育2h，每隔30分鐘搖晃一次。另設細胞對照和病毒對照。2h後棄去病毒液後，每孔加入100μl維持液，繼續培養，每天於倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況。於藥物作用44h後，每孔加入mtt溶液(2mg/ml)50μl，繼續孵育4h，2000r/min離心5min，甩去上清，每孔加入150μl酸性dmso溶液(192μldmso加8μl1nhcl)，振蕩儀振蕩，俟結晶完全溶解後採用酶標儀于波長492nm處測定od值(od492)，作為細胞存活量的指標，按下列公式計算阻斷率。阻斷率(％)＝[(給藥組平均值－病毒對照平均值)/(正常細胞對照組平均值－病毒對照平均值)]×100％。2.5對prv增殖的抑制作用在長滿單層的vero細胞孔中按100μl/well加入100tcid50的prv病毒液，於37℃、5％co2細胞培養箱吸附2h，每隔30分鐘搖晃一次。棄去病毒液，按100μl/well加入不同稀釋度的藥物稀釋液，每個稀釋度重複8孔，於37℃、5％co2細胞培養箱孵育。。2h後棄去藥液，每孔加入100μl維持液，繼續培養，同時設細胞對照和病毒對照，每天於倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況。同時，於藥物作用44h後，每孔加入mtt溶液(2mg/ml)50μl，繼續孵育4h，2000r/min離心5min，甩去上清，每孔加入150μl酸性dmso溶液(192μldmso加8μl1nhcl)，振蕩儀振蕩，俟結晶完全溶解，採用酶標儀于波長492nm處測定od值，作為細胞存活量的指標，按下列公式計算抑制率。抑制率(％)＝[(給藥組平均值－病毒對照平均值)/(正常細胞對照組平均值－病毒對照平均值)]×100％。2.6對prv的殺滅作用將不同稀釋度的藥物稀釋液分別與等體積的200tcid50病毒液混合，於37℃、5％co2細胞培養箱孵育2h，每隔30分鐘搖晃一次。然後將混合液按100μl/well加入長成單層的vero細胞中，於37℃、5％co2細胞培養箱培養，間隔30分鐘搖晃一次。2h後棄去上清，每孔加入100μl維持液，繼續培養，同時設細胞對照和病毒對照。每天於倒置顯微鏡下觀察細胞病變。於藥物作用44h後，每孔加入mtt溶液(2mg/ml)50μl，繼續孵育4h，2000r/min離心5min，甩去上清，每孔加入150μl酸性dmso溶液(192μldmso加8μl1nhcl)，振蕩儀振蕩，俟結晶完全溶解，採用酶標儀于波長492nm處測定od值(od492)，作為細胞存活量的指標，按下列公式計算殺滅率。殺滅率(％)＝[(給藥組平均值－病毒對照平均值)/(正常細胞對照組平均值－病毒對照平均值)]×100％。3試驗結果3.1試驗藥物對vero細胞的最大安全濃度的測定表18種中藥提取物對vero細胞無毒性的最大濃度3.2樣品對prv的阻斷作用表2.lyc和lys對prv吸附細胞的阻斷作用mtt法檢測結果註：與正常細胞對照組比較，cp<0.001；與病毒對照組比較，ep<0.01和fp<0.001fp<0.001。表3.zys和zyy對prv吸附細胞的阻斷作用mtt法檢測結果註：與正常細胞對照組比較，cp<0.001；與病毒對照組比較，fp<0.001。表4.sys和syy對prv吸附細胞的阻斷作用mtt法檢測結果註：與正常細胞對照組比較，cp<0.001；與病毒對照組比較，ep<0.01和fp<0.001。表5.lyy(2015)和lylj-2-y(2-6)對prv吸附細胞阻斷作用的mtt法檢測結果註：與病毒對照組比較，cp<0.001；與細胞對照組比較，ep<0.01,fp<0.001。3.3樣品對prv的增殖抑制作用表6.lyc和lys對prv增殖的抑制作用mtt法檢測結果註：與正常細胞對照組比較，cp<0.001；與病毒對照組比較，ep<0.01和fp<0.001。表7.zys和zyy對prv增殖的抑制作用mtt法檢測結果註：與正常細胞對照組比較，cp<0.001；與病毒對照組比較，fp<0.001。表8.sys和syy對prv增殖的抑制作用mtt法檢測結果註：與正常細胞對照組比較，cp<0.001；與病毒對照組比較，ep<0.01和fp<0.001。表9.lyy(2015)和lylj-2-y(2-6)對prv增殖抑制作用的mtt法檢測結果註：與病毒對照組比較，cp<0.001；與細胞對照組比較ep<0.01,fp<0.001。此處補表3.4樣品對prv直接殺滅作用表10.lyc和lys對prv殺滅作用mtt法檢測結果註：與正常細胞對照組比較，bp<0.01和cp<0.001；與病毒對照組比較，fp<0.001。表11.zys和zyy對prv殺滅作用mtt法檢測結果註：與正常細胞對照組比較，cp<0.001；與病毒對照組比較，fp<0.001。表12.sys和syy對prv殺滅作用mtt法檢測結果註：與正常細胞對照組比較，cp<0.001；與病毒對照組比較，fp<0.001。表13.lyy(2015)和lylj-2-y(2-6)對prv殺滅作用mtt法檢測結果註：與病毒對照組比較，bp<0.01,cp<0.001；與細胞對照組比較，fp<0.001。當前第1頁12