用於產生酵母提取物的方法

2023-11-09 21:40:37

專利名稱：：用於產生酵母提取物的方法
技術領域：
：本發明涉及使用外源蛋白酶產生酵母提取物的方法。
背景技術：
：酵母提取物用途廣泛，例如，用於食品工業中的調味，用於微生物發酵培養基中，和用作保健食品。酵母提取物的產生在文獻中有描述，參見例如Kelly,M.(1982)YeastExtract(於IndustrialEnzymology,Godfrey,T.編)或Chae，H.J.等(2001)，BioresourceTechnology76，253-258。酵母提取物通常通過如下方法製備，通過對細胞進行酸水解或機械或化學破壞來分解酵母，繼而用內源酶自溶，從而將酵母的大分子結構(特別是蛋白質)降解成極大量(maximumamount)的可溶性物質。可以添加內源酶，包括蛋白酶如木瓜蛋白酶，以增進酵母自身酶的效果。在酶水解之後，將酵母提取物與細胞碎片分離，並且可以進行巴氏滅菌和濃縮。濁度是酵母提取物的一個質量量度。低濁度使濃縮和分離更容易。因此，對產生低濁度酵母提取物的方法存在期望。根據本發明可應用的蛋白酶在先前已有描述。例如，源自擬諾卡氏菌屬菌種(Nocardiopsissp.)NRRL18262的蛋白酶在WO88/03947(其中將該菌抹稱作擬諾卡氏菌屬菌種菌抹IOR)和WO01/58276中公開。其它可用於本發明的相關蛋白酶在WO88/03947、WO04/111220、WO04/111222、WO04/111223、WO05/123911和WO04/072279中公開。
發明內容本發明人已經鑑定了可用於以高產率製備濁度非常低的酵母提取物的蛋白酶。當與等量酶蛋白進行比較時，這些蛋白酶比本領域使用的其它蛋白酶更有效，這使酵母提取物的製造者獲得更經濟的產品。此外，當使用本發明的蛋白酶製備酵母提取物時，總幹固體的蛋白質含量高，這反映了高純度。因此，本發明涉及用於產生酵母提取物的方法，其包括a)向包含蛋白質的酵母添加蛋白酶，所述蛋白酶與SEQIDNO:1具有至少50%同一性；和b)3溫育從而使蛋白質水解。發明詳述蛋白酶術語蛋白酶(protease)用於本文是水解肽4建的酶(具有蛋白酶活性)。蛋白酶也稱為，例如，肽酶、蛋白水解酶(proteinase)、肽水解酶或蛋白水解酶(proteolyticenzyme)。用於本發明的蛋白酶是在多肽鏈內部作用的內切型(endo-type)蛋白酶(內肽酶)。對用於本發明的蛋白酶的來源不進行限制。因此，術語蛋白酶不僅包括天然或野生型蛋白酶，還包括任何顯示蛋白酶活性的蛋白酶的突變體(mutant)、變體(variant)、片段等，以及合成的蛋白酶，諸如改組的蛋白酶(shuffledprotease),和共有蛋白酶(consensusprotease)。這些遺傳工^呈〈'l"飾的蛋白酶可以如本領域通常所知的來製備，例如通過定點誘變(site-directedmutagenesis)，通過PCR(使用含有期望的突變的PCR片段作為PCR反應中的引物之一)，或通過隨機誘變來製備。共有蛋白的製備在例如EP897985中描述。蛋白酶變體的實例(如本文中使用的)是已缺失、插入或用其它胺基酸取代了一個或多個胺基酸的蛋白酶。用於本發明的蛋白酶的實例是(i)WO01/58276中公開的源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶，所述蛋白酶的序列示於本文件的SEQIDNO:1;(ii)與(i)的蛋白酶具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90或至少95%胺基酸同一性的蛋白酶；(iii)(i)或(ii)的蛋白酶顯示蛋白酶活性的突變體、變體或片段。就本發明而言，兩個胺基酸序列的比對可以通過使用EMBOSS程序包(http:〃emboss.org)版本2.8.0的Needle程序來測定。Needle程序執行Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.MoLBiol.48,443-453中描述的全局比對算法(globalalignmentalgorithm)。使用的取代矩陣是BLOSUM62,缺口產生罰分(gapopeningpenalty)是10，並且擊夾口延伸罰分(gapextensionpenalty)是0.5。兩個胺基酸序列之間的同一性程度這樣計算，用兩個序列的比對中的精確匹配數除以兩個序列中最短序列的長度。結杲表示為百分比同一性。當兩個序列在重疊的相同位置具有相同的胺基酸殘基時，出現精確匹配。序列的長度為序列中的胺基酸殘基數(例如SEQIDNO:1的長度是188)。作為可用於本發明的細菌蛋白酶的實例，可提及的是WO88/03947中公開的來自白擬諾卡氏菌(Nocardiopsisalba)(先前為達*〉維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsisdassonvillei))NRRL18133的蛋白酶；來自ii^維爾擬諾卡氏菌達+〉維爾亞種(Nocardiopsisdassonvilleisubsp.dassonvillei)DSM43235、白#以諾卡氏菌DSM15647、擬諾卡氏菌屬菌種DSM16424的蛋白酶和合成的蛋白酶22，全部四種公開在WO04/111220中；WO04/111222中公開的來自蔥綠擬諾卡氏菌(Nocardiopsisprasina)DSM15648的蛋白酶；WO04/111223中^>開的來自蔥綠擬諾卡氏菌DSM15649的蛋白酶；來自蔥綠擬諾卡氏菌(先前為白擬諾卡氏菌)DSM14010、嗜i威擬諾卡氏菌(Nocardiopsisalkaliphila)DSM44657和盧森坦擬諾卡氏菌(Nocardiopsislucentensis)DSM44048的蛋白酶，全部三種公開於WO05/123911中；來自BrachysporiellagayanaCGMCC0865、綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)、粘帚酶屬菌種(Gliocladiumsp.)CBS114001、黑團孢屬菌種(Periconiasp.)CBS114002、黑團孢屬菌種CBS114000和新月彎孢(Curvularialunata)CBS114003的蛋白酶，全部六種公開在WO04/072279中；以及這些蛋白酶顯示蛋白酶活性的突變體、變體或片段。用於本發明的蛋白酶是細菌蛋白酶，術語"細菌的(bacterial)"表明所述蛋白質是衍生自或起源於細菌，或是源自細菌的類似物、片段、變體、突變體或合成蛋白酶。其可在原野生型細菌菌抹中、在另一微生物菌抹中或在植物中產生或表達；即所述術語涵蓋野生型、天然存在的蛋白酶的表達，以及重組蛋白酶、遺傳工程蛋白酶或合成蛋白酶在任何宿主中的表達。在本發明的方法中，蛋白酶可以是純化的。術語"純化的"用於本文包括這樣的酶蛋白，其基本上不含來自該酶蛋白所來源的生物的組分。術語"純化的"還包括這樣的酶蛋白，其不含來自從中獲得該酶蛋白的天然生物的組分，這也稱為"基本上純的(essentiallypure)"酶，並且可以具體涉及天然存在並且未經遺傳修飾的酶，所述遺傳修飾諸如通過缺失、取代或插入一個或多個胺基酸殘基。因此，蛋白酶可以是純化的，即僅存在少量的其它蛋白質。表述"其它蛋白質"具體而言指其它的酶。術語"純化的"用於本文還指去除其它組分，特別是作為所述蛋白酶來源的細胞中存在的其它蛋白質，並且最具體而言是其它的酶。蛋白酶可以是"基本上純的(substantiallypure)",即基本上不含來自在其中產生所述蛋白酶的生物的其它組分，所述生物例如用於重組產生酶的宿主生物。優選地，所述蛋白酶是75。/。(w/w)純的，更優選至少80%、85%、90%或甚至至少95%純的。在更優選的實施方案中，所述蛋白酶是至少98%純的酶蛋白製備物。然而，對於本發明的使用，蛋白酶不需要那麼純。其可以例如包括其它酶，甚至其它蛋白酶，在這樣的情況下可將其稱為蛋白酶製備物。本發明的蛋白酶可以與其它酶(例如其它蛋白酶)一起使用。在一個優選的實施方案中，將內切型的蛋白酶，例如源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶，與外肽酶組合，或與具有外肽酶活性的蛋白酶製備物組合，例如源自米麴黴(Aspergillusoryzae)的蛋白酶製備物，如W094/25580中所述，諸如Flavourzyme(NovozymesA/S,Denmark)。在一個具體實施方案中，當通過對酪蛋白的水解和後續的TCA可溶性肽與鄰苯二曱醛及2-巰基乙醇的反應，然後測量所得複合物在340nm的吸光度時，用於本發明的蛋白酶具有接近中性的pH-活性最優值。術語接近中性的pH活性最優值意指以下的一種或多種情況pH-最優值在pH5.5-11.0，或pH7,0-11.0，或pH6.0-10.0,或pH7.0-10.0，或pH8.0-11.0,或pH8.0-10.0的區間中。在另一具體實施方案中，用於本發明的蛋白酶是熱穩定的。術語熱穩定意指以下的一種或多種情況當如上所述通過對酪蛋白的水解來測定時，最佳溫度是至少50。C、52。C、54。C、56。C、58。C、60。C、62。C、64°C、66°C、68。C或至少70°C。酵母(familySaccharomycetaceae)。在一個特定的實施方案中，酵母是酵母屬(Saccharomyces)的酵母，例如酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或葡萄汁酵母(Saccharomycesuvamm)。在另一實施方案中，酵母是克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的酵母，例如脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)。在另一實施方案中，酵母是念珠菌屬(Candida)酵母，例如產朊念珠菌(Candidautilis),也稱為串酵母菌(Torulayeast)。應用的酵母可以是任何形式，諸如特別培養在例如糖蜜上的酵母，或廢啤酒酵母(spentBrewer'syeast)，或自醇發酵收集的酵母。應用的酵母可以是完整的酵母細胞，或完全或部分^C壞或降解的酵母細胞。酵母提取物酵母提取物在本發明的上下文中與酵母水解產物或酵母自溶產物同義，是來自包含經水解蛋白的酵母的可溶性提取物，其用途廣泛，例如用作增味劑(flavourenhancer)。根據本發明，所述酵母提取物是使用用於蛋白質水解的外源蛋白酶產生的。除了添加的蛋白酶之外，酵母本身含有多種降解酶(degradativeenzymes)，包括脂肪酶、核酸酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和蛋白酶。這些內源酶的最優溫度和pH值各不相同，並且它們在本發明的工藝條件下可能或多或少是有活性的。在添力口蛋白酶之前，酵母可以是含7K懸'液(aqueoussuspension)的開^式。酵母懸液的乾物質含量可以是5-50%，諸如10-30%。所述酵母懸液的pH和溫度可以適當參考所述蛋白酶的特性來調節。在一個實施方案中，將酵母懸液的pH調節得鹼性更強，例如調節至pH5.5-9，優選pH6-8，或更優選pH6-7。pH和溫度的調節可以在添加蛋白質之前、同時或之後進行。蛋白酶應該以有效量應用，即足以進行充分蛋白質水解的量。目前預期按一種或多種以下量(劑量範圍)施用所述酶0.001-1;0.005-1;0.01-0.5;0.01-0.2;或0.01-0.1——全部這些範圍的單位是mg酶蛋白/g酵母乾物質。在添加蛋白酶之前或之後，可以破壞酵母細胞，如通過提高溫度來進行。任選地，可以添加化學物質，諸如鹽或有機溶劑。此過程通常稱為質壁分離。質壁分離和由外源蛋白酶引起的蛋白質水解可以同時發生。酵母細胞內容物的自體消化通常稱為自溶。這種自體消化可能以不同程度在外源蛋白酶引起的蛋白質水解之前發生或與之同時發生。在一個優選的實施方案中，質壁分離、外源蛋白酶引起的蛋白質水解和特定程度的自體消化同時發生。在另一實施方案中，質壁分離和以酵母自身酶進行的自體消化首先進行，而以添加的蛋白酶進行的水解在單獨的澄清步驟(aseparateclarificationstep)中進行。添加蛋白酶之後的溫育可以在獲得期望程度的蛋白質水解所必需的任何方便的溫度和溫育時間進行。本發明上下文中的蛋白質水解可以基本上通過添加的蛋白酶進行，或者可以是添加的蛋白酶和酵母的自體消化性內源蛋白酶的作用的組合。即，術語蛋白質水解包括由添加的蛋白酶進行的蛋白質水解，和通常稱作自溶的由酵母自身的蛋白酶進行的蛋白質水解。在優選的實施方案中，溫育溫度是約20°C至約70°C，優選約40。C至約60°C，並且溫育時間是約1小時至48小時，優選12至30小時。在溫育進程中的任何時刻，可將pH和溫度二者任選地調節得更高或更低。將用蛋白酶進行的溫育持續到達到期望的結果，其後可以或可以不通過使酶失活來終止，例如通過熱處理步驟進行。這種熱處理也可以用於對酵母提取物進行巴氏滅菌。蛋白水解處理之後，可以將酵母提取物與細胞碎片分離，例如通過離心並且傾析上清。由此獲得的酵母提取物可以通過本領域已知的任何方法濃縮。可以對酵母提耳又物的質量進行表徵，例如通過以下參數進行表徵蛋白質產率是在酵母提取物中回收的蛋白質佔水解之前酵母千物質中的百分比。以下是使用本發明的蛋白酶可以獲得的蛋白質產率的實例至少40%,至少50%，或至少60%。水解程度(DH)表示通過所述方法獲得的蛋白質水解的程度。在本發明的上下文中，水解程度(DH)由下式定義DH=(切割的肽鍵數/肽鍵總數)x100%蛋白質分數(proteinfraction)是蛋白質來源的酵母提取物中幹固體所佔的分數。以下是使用本發明的蛋白酶可以獲得的蛋白質分數的實例至少45%,至少50%，或至少55°/。。酵母提取物的濁度可以通過本領域已知的任何方法測定。其可以作為NTU(比濁法濁度單位(NephelometricTurbidityUnits))測量。以下是使用本發明的蛋白酶可以獲得的酵母提取物濁度的實例低於2000NTU，低於1500NTU,低於1000NTU，或低於500NTU。本發明的一個實施方案是通過上述方法產生的酵母提取物。實施例1將具有SEQIDNO:1中所示序列的來自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶與Alcalase和無外源蛋白酶的酵母對照相比較來進行評估。在來自釀酒酵母的成塊酵母(blockyeast)上測試擬諾卡氏菌屬蛋白酶和Alcalase2.4L(NovozymesA/S,Denmark)。將酵母與去離子水混合以達到13.7%的乾物質含量，並且在室溫(磁力)攪拌60分鐘。將酵母混合物加熱至55°C，並且將一部分調節至pH6.5。另一部分不調節pH並且用作對照("酵母對照，，的水解產物pH是大約pH5)。向來自調節過pH的部分的樣品添加酶。酶的量按照mg酶蛋白/g酵母乾物質(YDM)的配製(dose)。取出20ml樣品並且稱量精確量。不向稱為"空白，，的樣品加酶。水解在55。C進行22小時。將樣品在85。C失活10分鐘。失活之後，使用Heraeus的Multifuge3S-R將樣品在3500rpm離心10分鐘。傾析之後稱量提取物的量。通過稱量(在105。C乾燥之後)測量提取物中的幹固體。通過燃燒法在LecoFP-528上測定了提取物中氮的量。蛋白質的量按照氮的量的6.25倍計算。游離氨基氮使用OPA(鄰苯二醛)法測定。基於上述測量進行以下計算%提取物產率=(離心之後的提取物g數)/(離心之前的酵母混合物g數)*100%蛋白質產率=(離心之後的提取物g數*提取物中的蛋白質含量(content))/(離心之前的酵母混合物g數*酵母混合物的蛋白質含量)*100。/。蛋白質/DS=(離心之後的提取物g數4是取物中的蛋白質含量)/(提取物中的幹固體g數"100水解程度=(切割的肽鍵數/肽鍵總數)*100=(h/htot)*100其中h表示為meqv絲氨酸NH2的函數h=(絲氨酸NH2-0.4)/1;並且htot=7.8。絲氨酸NH2相對於含100mg/L的絲氨酸標準品通過測量340nm的吸光度測量。提取物的濁度作為NTU(比濁法濁度單位)通過HACH2100AN濁度計使用USEPA濾光片測量。針對FormazinTurbidityStandard4000NTU(可從HACHCompany,USA獲得)進行校準。較高的NTU是較高濁度的量度。結果在下表中給出(EP二酶蛋白，YDM=酵母乾物質)9tableseeoriginaldocumentpage10來自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262的蛋白酶在低劑量水平(0.022-0.044mgEP/gYDM)產生了非常高的蛋白質產率。在相同的劑量範圍，經擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262蛋白酶處理的提取物的濁度非常澄清，並且更大部分的幹固體來源於蛋白質。權利要求1.一種用於產生酵母提取物的方法，包括a)向包含蛋白質的酵母添加蛋白酶，所述蛋白酶與SEQIDNO1具有至少50％同一性；和b)溫育從而使蛋白質水解。2.權利要求1的方法，其中所述蛋白酶與SEQIDNO:1具有至少60%同一性。3.權利要求1的方法，其中所述蛋白酶與SEQIDNO:1具有至少80%同一性。4.前述權利要求中任一項的方法，其中所述酵母是酵母屬、克魯維酵母屬或念珠菌屬酵母。5.權利要求4的方法，其中所述酵母是釀酒酵母或葡萄汁酵母。6.前述權利要求中任一項的方法，其中所述蛋白酶以每克酵母乾物質0.005-1mg酶的濃度存在。7.權利要求6的方法，其中所述蛋白酶以每克酵母乾物質0.01-0.5mg酶的濃度存在。8.前述權利要求中任一項的方法，其進一步包括將所述酵母懸浮在水溶液中。9.權利要求8的方法，其進一步包括將酵母懸液的pH調節成鹼性更強。10.前述權利要求中任一項的方法，其在步驟b)之後進一步包括進行離心以獲得沉澱和上清。11.權利要求10的方法，其中在所述上清中回收水解的蛋白質。12.通過前述權利要求中任一項的方法產生的酵母提取物。全文摘要本發明涉及使用外源蛋白酶產生酵母提取物的方法。文檔編號C12N1/06GK101558148SQ200780046547公開日2009年10月14日申請日期2007年12月20日優先權日2006年12月22日發明者利斯貝思·卡盧姆申請人:諾維信公司