枯草菌表面活性劑的生產方法

2023-11-09 22:18:37 1

專利名稱：枯草菌表面活性劑的生產方法
相關申請的相互參照本申請是基於35 U.S.C.第111(a)節的規定提交的申請，並依據35U.S.C.第119(e)(1)節，要求在2000年12月29日根據35 U.S.C.第111(b)節的規定提交的美國臨時申請60/258,560的申請日的權利。
枯草菌表面活性劑易於生物降解，而且在10ppm或以下的低濃度時有降低表面張力的活性，因此，枯草菌表面活性劑作為優良的表面活性劑一直受到關注。關於生產枯草菌表面活性劑的方法，已知有下面的方法。例如，K.Arima等公開了用枯草芽孢桿菌株ATCC 21331或ATCC 21332生產枯草菌表面活性劑的方法(參見，美國專利3,687,926和Biochem.Bioph.Res.Commun.，31，488-494(1968))，而且說明根據這個方法，通過培養24小時可在培養基中積累從0.05到0.1g/L的枯草菌表面活性劑。
因為對於工業應用，這樣的生產率是低的，故大量的發明人努力嘗試以改進生產率。Cooper等公開了生產枯草菌表面活性劑並同時不斷地除去枯草芽孢桿菌ATCC 21332培養過程中產生的泡沫的方法(參見，Appl.Environ.Microbiol.，42，408-412(1981))。根據這個方法，枯草菌表面活性劑的產量是0.7到0.8g/L。
Sheppard等公開了在含有水解泥炭的培養基中生長枯草芽孢桿菌的方法，而且由此取得了0.16g/L的產量(參見，Appl.Microbiol.Biotechnol.，27，110-116(1987))。Mulligan等公開了通過使用突變的枯草芽孢桿菌菌株ATCC 21332提高枯草菌表面活性劑產量的方法(參見，Appl.Microbiol.Biotech.，31，486-489(1989))。根據這個方法，培養40個小時後，枯草菌表面活性劑的產量是0.562g/L。
Okuda等公開了通過在磁場中培養枯草芽孢桿菌增加枯草菌表面活性劑產量的方法(參見，JP-A-6-121668(用在這裡的術語「JP-A」意思是「未經過審查的公開的日本專利申請」))。Wei等公開了通過培養枯草芽孢桿菌菌株ATCC 21332，同時添加高濃度鐵來增加枯草菌表面活性劑產量的方法(參見，Enz.Microbial Technol.，22，724-728(1998))，這個方法中枯草菌表面活性劑的產量是3.5g/L。
Carrera等公開了枯草芽孢桿菌ATCC 21332的突變株枯草芽孢桿菌ATCC 55033有產生濃度為2.0到4.0g/L的枯草菌表面活性劑的活性(參見，日本專利號3030789，美國專利號5227294)。Kim等公開，在用葡萄糖做為碳源和NH4HCO3做為氮源並限制氧的條件下培養枯草芽孢桿菌C9可生產濃度為7.0g/L的枯草菌表面活性劑(參見，J.Ferment.Bioeng.，84，41-46(1997))。
然而，這些改進對於枯草菌表面活性劑的工業應用是不夠的。需要具有更高生產率的株系和能進一步提高生產率的生產方法。
為了克服上述問題，本發明人對各種培養基成分進行了廣泛的調查研究。結果發現，當在含有豆粉，如大豆粉或其提取物做為氮源的培養基中培養生產枯草菌表面活性劑的芽孢桿菌屬微生物時，在肉湯培養物中枯草菌表面活性劑以高濃度積累，而且因為在枯草菌表面活性劑產生期間這個方法阻止了過多泡沫的產生故不需要採取除去泡沫的手段。而且，還發現當修飾生產枯草菌表面活性劑的芽孢桿菌屬微生物，而且在培養基中培養修飾的微生物時，可以在肉湯培養物中以高濃度積累枯草菌表面活性劑。根據這些發現完成了本發明。
更具體地，本發明涉及下面[1]到[20]所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，及下面[21]到[26]所述的芽孢桿菌屬微生物。生產枯草菌表面活性劑的方法，包括在含有豆粉或其提取物的液體培養基中培養芽孢桿菌屬微生物，及在肉湯培養物中積累枯草菌表面活性劑。如[1]所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中所述的豆選自大豆，赤豆，豌豆，蠶豆，鷹咀豆，小扁豆，有筋的青刀豆。如[2]所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中所述的豆是大豆。如上述[1]-[3]任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中在含有酵母提取物的液體培養基中培養芽孢桿菌屬微生物。如上述[1]-[4]任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，包括步驟在進一步含有可分解代謝的碳源，可分解代謝的氮源和無機鹽的液體培養基中，在有氧條件和pH6-9，溫度25-42℃下培養芽孢桿菌屬微生物，在肉湯培養物中積累枯草菌表面活性劑，且不從發酵罐中除去產生的泡沫，和從獲得的肉湯培養物中分離和純化枯草菌表面活性劑。如上述[1]-[5]任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中在肉湯培養物中積累8到50g/L濃度的枯草菌表面活性劑。如上述[1]-[6]任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中芽孢桿菌屬微生物是枯草芽孢桿菌。如上述[7]所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌SD901(FERM BP-7666)或其突變株。如上述[1]-[8]任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中培養液中豆粉或其提取物的濃度是0.5到20w/w％(重量/重量％)。如上述[5]-[9]任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中可分解代謝的碳源是選自葡萄糖，麥芽糖，蔗糖，水解澱粉，糖蜜，馬鈴薯提取物，麥芽，泥炭，植物油，玉米漿，果糖，糖漿，糖，液態糖，轉化糖，醇，有機酸，有機酸鹽和烷烴的一種或多種成分。如上述[10]所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中可分解代謝的碳源是葡萄糖或麥芽糖。如上述[5]-[11]任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中可分解代謝的氮源是銨鹽或無機或有機氮。如上述[12]所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中銨鹽是硝酸銨，硫酸銨，氯化銨，醋酸銨，碳酸銨或碳酸氫銨。如上述[12]或[13]所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中無機或有機氮是選自氨，硝酸鈉，硝酸鉀，穀氨酸鈉，尿素，蛋白腖，肉膏，玉米漿，酪蛋白水解物，羽毛粉和酵母提取物的一種或多種成分。如上述[5]-[14]任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中包含在無機鹽中的陽離子是鉀離子，鈉離子，鎂離子，鐵離子，錳離子，鈣離子，鋅離子，鈷離子，鎳離子，銅離子或鉬離子，陰離子是磷酸根離子，硫酸根離子，氯離子或硝酸根離子。如上述[1]-[15]任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中在培養基中含有胺基酸和/或維生素。如上述[16]所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中胺基酸是選自L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-纈氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-半胱氨酸，胱氨酸，L-甲硫氨酸，L-色氨酸，L-組氨酸，L-脯氨酸，L-天冬氨酸，L-天冬醯胺，L-穀氨酸，L-穀氨醯胺，L-精氨酸，L-賴氨酸，D-纈氨酸和D-異亮氨酸的一個或多個成分。如上述[16]或[17]所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中維生素是選自生物素，硫胺素，核黃素，吡哆醇，煙酸，煙醯胺，泛酸，吡哆醛，吡哆醇，肌醇，膽鹼，葉酸，鈷胺素和氰鈷胺素的一個或多個成分。如上述[4]-[18]任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中pH是6.9到7.5。如上述[4]-[19]任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中溫度是30℃到37℃。芽孢桿菌屬微生物，其具有在培養20到90小時後產生濃度為8到50g/L的粗枯草菌表面活性劑的活性。如上述[21]所述的芽孢桿菌屬微生物，其在含有豆粉或其提取物的液體培養基中培養20到90小時後，有產生濃度為8到50g/L的枯草菌表面活性劑的活性。如上述[22]所述的芽孢桿菌屬微生物，其中所述的豆是大豆。如上述[21]-[23]任一項所述的芽孢桿菌屬微生物，其是枯草芽孢桿菌。如上述[24]所述的芽孢桿菌屬微生物，其中枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌SD901(FERM BP-7666)或其突變株。枯草芽孢桿菌SD901(FERM BP-7666)或其突變株。發明詳述下面將詳述本發明。
根據本發明，通過向培養基中添加豆粉，如大豆粉或其提取物作為氮源培養生產枯草菌表面活性劑的微生物，可以在肉湯培養物中積累高濃度的枯草菌表面活性劑。
根據本發明人的知識，在含有豆粉或其提取物做為氮源的培養基中培養芽孢桿菌屬微生物對本領域技術人員是常規已知的，然而，在含有豆粉或其提取物做為氮源的培養基中培養生產枯草菌表面活性劑的微生物並在肉湯培養物中高濃度地積累枯草菌表面活性劑的生產方法是未知的，而且是本發明人新發現的。
用在本發明中的豆類包括大豆，小豆(赤豆)，豌豆，蠶豆，鷹咀豆，小扁豆和有筋的青刀豆。可以單獨或聯合使用它們。在這些豆類中，優選大豆。
不特別限定用在本發明中的芽孢桿菌屬微生物，只要它能生產枯草菌表面活性劑即可，然而，例如，本發明人修飾的枯草芽孢桿菌SD901是適宜的。
這個株系是一種新的枯草芽孢桿菌突變株系，其特徵在於具有以高濃度積累枯草菌表面活性劑的活性。這個株系與現有株系的區別在於其有極其高的枯草菌表面活性劑生產率，故將這個株系定為新的枯草芽孢桿菌株系是合適的。這個新的株系命名為枯草芽孢桿菌SD901，在2000年8月7日保藏在日本國際工業貿易部工業科學技術研究所生物工程工業技術實驗室(Bioengineering Industrial Technology Laboratory，Institute ofIndustrial Science and Technology，Ministry of International Trade andIndustry)，保藏號為FERM P-17989 ；而且在2001年7月16日轉為國際保藏，國際保藏號FERM BP7666，保藏地址是國際專利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)，國立現代工業科學技術研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305-8566日本。
因此，枯草芽孢桿菌SD901(FERM BP-7666)本身是本發明的一個主題。本發明包括來源於該株系並與該株系在具有極高枯草菌表面活性劑生產率方面有相同性質的突變株系。
而且，在培養20到90個小時後有生產8到50g/L粗枯草菌表面活性劑的活性的芽孢桿菌屬微生物也是本發明的主題。
更具體地描述本發明，本發明枯草芽孢桿菌SD901(FERM BP-7666)來源於枯草芽孢桿菌MI113(pC115)，枯草芽孢桿菌MI113(pC115)是枯草芽孢桿菌MI113(枯草芽孢桿菌Marburg 168株系的突變株系)的轉化體。
在Nakayama等的公開文獻中描述了枯草芽孢桿菌MI113(pC115)。(參見，Appl.Microbio Biotechnol.，48，80-82(1997))。Huang等公開描述了質粒pC115。(參見，J.Ferment.Bioeng.，76，6，445-450(1993))。在質粒pC115中參與枯草菌表面活性劑生產的基因lpa-14與來源於枯草芽孢桿菌的質粒pNS1981連接形成質粒，由此轉化枯草芽孢桿菌MI113。在Hiraoka等的公開文獻中描述了lpa-14。(參見，J.Ferment.Bioeng.，74，5，323-326(1992))。在Shishido等的公開文獻中描述了質粒pNS1981。(參見，Plasmid，10，224-234(1983))。
通過突變以上獲得的轉化體，得到本發明的枯草芽孢桿菌SD901(FERM BP-7666)。為了這個目的，使化學或物理誘變劑作用於得到的轉化體，並從中分離生產率增加的菌落，由此獲得了枯草芽孢桿菌SD901(FERM BP-7666)，即枯草菌表面活性劑產量改變的菌株原種。
可以利用的化學誘變劑的例子包括EMS(甲磺酸乙酯)，硫酸二乙酯和NTG(N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍)。可以利用的物理誘變劑的例子包括紫外射線，γ射線和X射線，其中每種以可以誘導突變發生的量使用。
製備突變菌株原種的方法的例子包括這樣的方法，其中收集在營養培養基，如營養肉湯(Difco Laboratories生產)中生長達到對數期的枯草芽孢桿菌，在生理鹽水中洗滌，然後重懸，向懸浮液肉湯中加入數量可誘導突變發生的NTG以誘導突變發生，再一次收集細胞，洗滌以除去NTG，再一次在營養培養基，如營養肉湯(Difco Laboratories生產)中培養，由此製備突變菌株原種。
為了分離生產率增加的菌落，可以，例如，適當稀釋突變菌株原種，將其鋪於平板培養基上，所述平板培養基是通過向培養基，如添加有綿羊血的Tryptose Blood Agar Base(TBAB，Difco Laboratories生產)中添加瓊脂製備的，然後通過比較長出的枯草芽孢桿菌菌落周圍形成的澄清區帶的大小，可以篩選出具有高濃度地生產枯草菌表面活性劑的能力的突變株系。
實際上，Mulligan等已揭示了形成的澄清區帶的大小與枯草芽孢桿菌產生的枯草菌表面活性劑的量成比例(參見，J.Ferment.Technol.，62，158-179(1984))。隨後，用MI113(pC115)做為對照，試管培養由此分離的枯草芽孢桿菌突變株，籍此可以證實枯草菌表面活性劑的生產率。通過這種方法，可以獲得本發明的枯草芽孢桿菌SD901(FERM BP-7666)。
現在在採用大豆的情況下示例本發明的枯草菌表面活性劑的生產方法，其中大豆是優選的豆類。為了最簡單和方便地構成枯草菌表面活性劑的生產方法，可以，例如在含有10ppm四環素的營養培養基，如L培養基中，在25℃到42℃，優選28℃到40℃，更優選30℃到37℃的溫度下培養枯草芽孢桿菌SD901(FERM BP-7666)約5到24個小時，以0.1到10w/w％，優選0.5到7w/w％，更優選1到5w/w％的濃度在含有大豆粉或其提取物做為氮源的培養基中接種得到的肉湯培養物，然後在25℃到42℃，優選28℃到40℃，更優選30℃到37℃的溫度下培養細胞約20到90個小時。如果溫度偏離了上述範圍，枯草菌表面活性劑的產量將不利地急劇減少。
在本發明的術語「豆粉或其提取物」中，大豆粉或其提取物指通過粒狀粉碎大豆或脫脂大豆得到的大豆粗顆粒，粉碎的大豆粉或其提取物如熱水提取物，或水解產物如酸水解產物和酶水解產物等等。不特別限定大豆粉或其提取物的濃度，然而，由於枯草菌表面活性劑的產量隨著培養基中大豆粉或其提取物的濃度成比例地增加，故在某種程度上，為了獲得高產量，優選0.5w/w％或以上的濃度。然而，如果大豆粉或其提取物的濃度過高，則可能引起不充分的滅菌，因此，優選大豆粉或其提取物的濃度不超過20w/w％。
因此，為了獲得高產量，大豆粉或其提取物的濃度為0.5到20w/w％，優選2到15w/w％，更優選4到12w/w％。
除了大豆粉或其提取物外，本發明中使用的培養基可以包含常用的可分解代謝的碳源，可分解代謝的氮源和無機鹽。如果期望的話，也可以進一步添加胺基酸和/或維生素。
可以利用的可分解代謝的碳源的例子包括葡萄糖，麥芽糖，蔗糖，水解澱粉，糖蜜，馬鈴薯提取物，麥芽，泥炭，植物油，玉米漿，果糖，糖漿，糖，液態糖，轉化糖，醇，有機酸，有機酸鹽和烷烴及其它通用的碳源。可以單獨或聯合使用它們。在這些碳源中，優選葡萄糖和麥芽糖。通常可以以0.01到50w/w％，優選大約1到40w/w％的濃度使用可分解代謝的碳源。
可以利用的可分解代謝的氮源的例子包括銨鹽，如硝酸銨，硫酸銨，氯化銨，醋酸銨，碳酸銨和碳酸氫銨，及含有無機或有機氮的那些氮源，如，氨，硝酸鈉，硝酸鉀，穀氨酸鈉，尿素，蛋白腖，肉膏，玉米漿，酪蛋白水解物，羽毛粉和酵母提取物。可以單獨或聯合使用它們。在這些氮源中，考慮到枯草菌表面活性劑的生產率，優選酵母提取物。可分解代謝的氮源的適宜使用濃度通常是0.01到30w/w％，優選大約0.1到10w/w％。
而且，優選添加陽離子或陰離子做為無機鹽，其例子包括鉀離子，鈉離子，鎂離子，鐵離子，錳離子，鈣離子，鋅離子，鈷離子，鎳離子，銅離子，鉬離子，磷酸根離子，硫酸根離子，氯離子和硝酸根離子。添加的濃度隨培養條件而變化，然而，通常磷酸鹽從0.01到5w/w％，鎂鹽從10ppm到2w/w％，其它鹽大約從0.1ppm到1,000ppm。
添加的胺基酸的例子包括L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-纈氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-半胱氨酸，胱氨酸，L-甲硫氨酸，L-色氨酸，L-組氨酸，L-脯氨酸，L-天冬氨酸，L-天冬醯胺，L-穀氨酸，L-穀氨醯胺，L-精氨酸，L-賴氨酸，D-纈氨酸和D-異亮氨酸，並且可以添加它們中的一種或多種。在本發明中，特別優選L-精氨酸，L-色氨酸。添加的濃度為0.001到5％w/w％，優選大約0.01到1w/w％。
維生素的例子包括生物素，硫胺素，核黃素，吡哆醇，煙酸，煙醯胺，泛酸，吡哆醛，吡哆醇，肌醇，膽鹼，葉酸，鈷胺素和氰鈷胺素，且可以添加它們中的一種或多種。添加的濃度是0.1到100ppm，優選1到50ppm。
在本發明中，所述培養在強有力的通氣條件下，通過向容器，如試管，燒瓶或發酵罐中添加上述培養基進行。不是特別需要除去產生的泡沫。
在傳統的培養方法中，因為伴隨著枯草菌表面活性劑的積累會劇烈產生泡沫使培養變得困難，故在培養期間要除去泡沫，回收包含在其中的枯草菌表面活性劑。然而，這個方法不能以工業規模實施。在本發明中，因為積累的枯草菌表面活性劑吸附到源於培養基中的大豆粉或其提取物的不可溶物質上，由此抑制了過多的泡沫，而且也因為源於大豆粉或其提取物的成分有抑制泡沫的作用，所以可以認為不需要除去培養期間產生的泡沫。鑑於這些，可以以類似於普通的發酵生產的方式進行工業規模的生產。在添加有大豆粉或其提取物的培養基中存在源於大豆粉或其提取物的不可溶物質，因此與以相同濃度添加有可溶成分的培養基比較，這種培養基無高滲透壓。這些不可溶物質在培養期間逐漸溶解和消耗，因此可以在含有高濃度營養源的培養基中實施發酵生產，而且產生高產量的枯草菌表面活性劑。
在用容器如試管或燒瓶的情況下，通過強有力搖動容器進行通氣，而且將培養基的最初pH調節為6.5到8.0。
在用容器如發酵罐進行高濃度生產的情況下，通入無菌空氣，通過攪拌進行培養，而且當由於泡沫使培養變得困難時，可以添加常用的消泡劑。
優選將培養基維持在pH6到9，優選6.5到8.0，更優選6.9到7.5。通過添加鹼性水溶液如氨，氫氧化鉀，氫氧化鈉，碳酸鈉和碳酸鉀的水溶液調整pH。其中，優選使用氫氧化鈉和氨水。氫氧化鈉的優選濃度是大約20w/w％，氨水的優選濃度是8到25w/w％。在這樣的優選條件下進行培養，在20到90個小時內可以獲得含有濃度為8到50g/L的粗枯草菌表面活性劑的肉湯培養物。
從此肉湯培養物中，可以回收枯草菌表面活性劑，並純化。可以通過已知的方法進行純化，這樣可以通過添加硫酸，鹽酸或硝酸使肉湯培養物呈酸性，對沉澱的枯草菌表面活性劑進行超濾，用有機溶劑如甲醇或二氯甲烷進行提取，用活性碳處理或結晶。代替通過添加酸進行沉澱，可以通過添加鈣鹽進行沉澱。
以此方式，每1L培養基可以獲得6到40g的純化枯草菌表面活性劑。
根據本發明得到的枯草菌表面活性劑可以用於，例如去汙劑，乳化劑，溼潤劑，分散劑，增溶劑，抗靜電劑，防暈劑(anticlouding)，潤滑劑，管道減阻劑等等領域，而且對於化妝品，食品，藥品，農藥，墨水等等是有效的。
向懸浮液中加入0.05ml的2000ppm N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍水溶液，在30℃放置10分鐘。離心懸浮液，棄去上清液，用5ml同樣的緩衝液洗細胞3次，在1ml的新L培養基中再一次懸浮。向4ml添加有10ppm四環素的L培養基中加入懸浮液，在35℃培養細胞過夜，加入2.5ml的50w/w％甘油水溶液，將由此得到的肉湯培養物等份裝入幾個小瓶用於細胞保藏並貯藏在-135℃以製備轉化體貯藏原種。
隨後，用無菌水稀釋轉化體的貯藏原種，將其鋪在含有5w/v％綿羊血，4w/v％葡萄糖，0.1w/v％營養肉湯(Difco Laboratories生產)和0.1％酵母提取物的瓊脂平板培養基(見，Cooper等，Appl.Environ.Microbiol.，42，408-412(1981))上以形成約200個菌落/平板。在35℃溫育20到48個小時後，觀察到了在生長的菌落周圍形成澄清區帶，篩選在其周圍形成大澄清區帶的菌落做為枯草菌表面活性劑的高產菌株。這些株系之一命名為枯草芽孢桿菌SD901，保藏號為FERM BP-7666。實施例3在試管培養中氮源對枯草菌表面活性劑產量的影響在添加有10ppm四環素的L平板培養基上劃線枯草芽孢桿菌SD901(FERM BP-7666)，35℃過夜生長。之後，向試管中分裝入1ml具有以下組成A的培養基，在該培養基中接種從L平板培養基上挑取的一環細胞，在35℃培養72小時。
組成A(w/w％)1.4％ K2HPO40.6％ KH2PO40.1％ 檸檬酸鈉0.02％ MgSO4·7H2O0.005％ FeSO4·7H2O3ppmMnCl2·4H2O1ppmZnCl20.1ppm CoCl2·6H2O0.02ppm CuCl2·2H2O0.02ppm Na2MoO4·2H2O3％ 葡萄糖0.01％ 酵母提取物
0.1％ L-色氨酸0.1％ L-精氨酸向上述組成中，添加下列氮源之一。
0.5w/w％ 大豆粉0.5w/w％ 硝酸鉀0.5w/w％ 硝酸銨0.5w/w％ 硫酸銨0.5w/w％ 尿素0.5w/w％ 穀氨酸鈉0.5w/w％ 蛋白腖離心肉湯培養物，通過HPLC方法在下列條件下定量包含在上清液中的枯草菌表面活性劑。
樣品的量20μl柱子ODS-2，4.6mm×250mm，GL Science Co.，Ltd.製造。
柱子溫度40℃洗脫液 80v/v％乙腈，3.8mM三氟乙酸流速1.5ml/min檢測器 UV檢測器波長205nm根據用枯草菌表面活性劑(Sigma-Aldrich Co.生產)的標準樣品製成的標準曲線進行定量。下面以各氮源為基礎顯示了枯草菌表面活性劑的量大豆粉 5g/L硝酸鉀 0.6g/L硝酸銨 0.6g/L硫酸銨 0.6g/L尿素 0.6g/L穀氨酸鈉 0.9g/L蛋白腖 0.6g/L實施例4試管培養中大豆粉的濃度對枯草菌表面活性劑產量的影響在添加有10ppm四環素的L平板培養基上劃線枯草芽孢桿菌SD901(FERM BP-7666)，35℃過夜生長。之後，向試管中分裝具有下面組成B，C或D的培養基各1ml，在每個培養基中接種從L平板培養基上挑取的一環細胞，在35℃培養48小時。
組成B(w/w％)2％ 大豆粉0.5％ K2HPO40.05％MgSO4·7H2O0.018％ CaCl2·2H2O25ppm FeSO4·7H2O22ppm MnCl2·4H2O3.4％ 麥芽糖組成C(w/w％)4％ 大豆粉0.5％ K2HPO40.05％MgSO4·7H2O0.018％ CaCl2·2H2O25ppm FeSO4·7H2O22ppm MnCl2·4H2O6.7％ 麥芽糖組成D(w/w％)8％ 大豆粉0.5％ K2HPO40.05％MgSO4·7H2O0.018％ CaCl2·2H2O25ppm FeSO4·7H2O
22ppm MnCl2·4H2O6.7％ 麥芽糖離心肉湯培養物，通過HPLC方法定量包含在上清液中的枯草菌表面活性劑。下面以各培養基為基礎顯示了枯草菌表面活性劑的量。
組成B8g/L組成C16g/L組成D23g/L實施例5發酵罐中枯草菌表面活性劑的生產在添加有10ppm四環素的L平板培養基上劃線枯草芽孢桿菌SD901(FERM BP-7666)，35℃過夜生長。在帶擋板的燒瓶中製備100ml添加有10ppm四環素的L培養基，向其中接種1環來自上述肉湯培養物的細胞，在35℃和150rpm培養12小時。在5L體積的發酵罐中，製備2L具有下面組成E的培養基，向其中加入L培養基中的肉湯培養物，在35℃培養細胞90小時，同時通過添加20％ NaOH水溶液調節pH從6.5到7.5。
組成E(w/w％)10％ 大豆粉0.5％ K2HPO40.05％MgSO4·7H2O0.018％ CaCl2·2H2O25ppm FeSO4·7H2O22ppm MnCl2·4H2O0.1％ 酵母提取物17％ 麥芽糖0.1％ L-色氨酸
0.1％ L-精氨酸隨時間進程從肉湯培養物中取樣，通過HPLC方法定量離心後包含在上清液中的枯草菌表面活性劑。各培養時間的枯草菌表面活性劑的量如下所示。
20小時 8g/L32小時 18g/L52小時 36g/L64小時 44g/L70小時 48g/L80小時 50g/L90小時 50g/L工業實用性根據本發明，在廣泛的領域，如藥品，農藥，食品，化妝品，化學產品，資源/能源和環境中有用的枯草菌表面活性劑，可以利用廉價培養基原料以比現有方法高許多的濃度產生。
序列表110昭和電工株式會社(SHOWA DENKO K.K.)120枯草菌表面活性劑的生產方法130SDF-3897PCT150JP2000-3003001512000-09-29150US60/2585601512000-12-291604170PatentIn version 3.1210121136212DNA213人工220223引物4001gtggtcgatg aaagagagct ttatcaaaca ggccgg 36210221136212DNA213人工220223引物4002ccggcctgtt tgataaagct ctctttcatc gaccac 36210321146212DNA213人工220223引物4003cccggatccg gactagtcta gagctctacg cgatctccgg gcgggc 46210421136212DNA213人工220223引物4004cccggatcct taagcttgag tacgacggtt tttctg 3權利要求
1.生產枯草菌表面活性劑的方法，包括在含有豆粉或其提取物的液體培養基中培養芽孢桿菌屬微生物，及在肉湯培養物中積累枯草菌表面活性劑。
2.如權利要求1所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中所述的豆選自大豆，赤豆，豌豆，蠶豆，鷹咀豆，小扁豆，有筋的青刀豆。
3.如權利要求2所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中所述的豆是大豆。
4.如權利要求1-3任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中在含有酵母提取物的液體培養基中培養芽孢桿菌屬微生物。
5.如權利要求1-4任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，包括步驟在還含有可分解代謝的碳源，可分解代謝的氮源和無機鹽的液體培養基中，在有氧條件和pH6-9，溫度25-42℃下培養芽孢桿菌屬微生物20-90個小時；在肉湯培養物中積累枯草菌表面活性劑，且不從發酵容器中除去產生的泡沫，和從得到的肉湯培養物中分離和純化枯草菌表面活性劑。
6.如權利要求1-5任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中枯草菌表面活性劑在肉湯培養物中以8到50g/L的濃度積累。
7.如權利要求1-6任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中芽孢桿菌屬微生物是枯草芽孢桿菌。
8.如權利要求7所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌SD901(FERM BP-7666)或其突變株。
9.如權利要求1-8任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中培養液中豆粉或其提取物的濃度是0.5到20w/w％。
10.如權利要求5-9任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中可分解代謝的碳源是選自葡萄糖，麥芽糖，蔗糖，水解澱粉，糖蜜，馬鈴薯提取物，麥芽，泥炭，植物油，玉米漿，果糖，糖漿，糖，液態糖，轉化糖，醇，有機酸，有機酸鹽和烷烴的一種或多種成分。
11.如權利要求10所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中可分解代謝的碳源是葡萄糖或麥芽糖。
12.如權利要求5-11任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中可分解代謝的氮源是銨鹽或無機或有機氮。
13.如權利要求12所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中銨鹽是硝酸銨，硫酸銨，氯化銨，醋酸銨，碳酸銨或碳酸氫銨。
14.如權利要求12或13所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中無機或有機氮是選自氨，硝酸鈉，硝酸鉀，穀氨酸鈉，尿素，蛋白腖，肉膏，玉米漿，酪蛋白水解物，羽毛粉和酵母提取物的一種或多種成分。
15.如權利要求5-14任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中包含在無機鹽中的陽離子是鉀離子，鈉離子，鎂離子，鐵離子，錳離子，鈣離子，鋅離子，鈷離子，鎳離子，銅離子或鉬離子，陰離子是磷酸根離子，硫酸根離子，氯離子或硝酸根離子。
16.如權利要求1-15任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中在培養基中含有胺基酸和/或維生素。
17.如權利要求16所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中胺基酸是選自L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-纈氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-半胱氨酸，胱氨酸，L-甲硫氨酸，L-色氨酸，L-組氨酸，L-脯氨酸，L-天冬氨酸，L-天冬醯胺，L-穀氨酸，L-穀氨醯胺，L-精氨酸，L-賴氨酸，D-纈氨酸和D-異亮氨酸的一種或多種成分。
18.如權利要求16或17所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中維生素是選自生物素，硫胺素，核黃素，吡哆醇，煙酸，煙醯胺，泛酸，吡哆醛，吡哆醇，肌醇，膽鹼，葉酸，鈷胺素和氰鈷胺素的一種或多種成分。
19.如權利要求4-18任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中pH是6.9到7.5。
20.如權利要求4-19任一項所述的生產枯草菌表面活性劑的方法，其中溫度是30℃到37℃。
21.芽孢桿菌屬微生物，其具有在培養20至90個小時後產生濃度為8至50g/L的粗枯草菌表面活性劑的活性。
22.如權利要求21所述的芽孢桿菌屬微生物，其在含有豆粉或其提取物的液體培養基中培養20到90個小時後，有產生濃度為8到50g/L的枯草菌表面活性劑的活性。
23.如權利要求22所述的芽孢桿菌屬微生物，其中所述的豆是大豆。
24.如權利要求21到23任一項所述的芽孢桿菌屬微生物，其是枯草芽孢桿菌。
25.如權利要求24所述的芽孢桿菌屬微生物，其中枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌SD901(FERM BP-7666)或其突變株。
26.枯草芽孢桿菌SD901(FERM BP-7666)或其突變株。
全文摘要
本發明公開了一種生產枯草菌表面活性劑的方法，包括在含有豆粉如大豆粉或其提取物做為氮源的液體培養基中培養芽孢桿菌屬微生物，及在肉湯培養物中積累枯草菌表面活性劑；本發明還公開了在培養20到90個小時後，具有產生濃度為8到50g/L的粗枯草菌表面活性劑的活性的芽孢桿菌屬微生物。
文檔編號C07K14/195GK1466626SQ01816513
公開日2004年1月7日 申請日期2001年9月28日 優先權日2000年9月29日
發明者米田正, 御代田喜昭, 古谷和男, 續木敏, 喜昭, 男 申請人:昭和電工株式會社