治療慢性疼痛的方法

2023-12-05 13:22:51 3

專利名稱：治療慢性疼痛的方法
技術領域：
本發明涉及用於預防和/或治療慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀的抗CGRP抗體， 且涉及使用抗CGRP抗體治療和/或預防慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀的方法。
背景技術：
慢性疼痛是比根源性損傷或疾病的天然癒合的短暫過程持續更長的持久性疼痛。 其不起有益的或保護性作用，並且在英國估計有270萬人因慢性疼痛病況而病廢。癌症疼痛是最常見的慢性疼痛類型之一，並且顯示傷害性成分(nociceptive component)(由於腫瘤生長)和神經病理性成分(由於腫瘤誘導的神經損傷)。其還牽涉 結構性損傷、神經卡壓和損傷、炎性過程，其導致正常組織代謝的中斷、炎性前列腺素和細 胞因子的產生和組織損傷。迄今為止，用於治療慢性疼痛的主要鎮痛藥是阿片劑和非類固醇抗炎藥 (NSAIDS)。兩類藥都可產生嚴重的副作用；NSAIDS可引起胃潰瘍和腎損傷，阿片劑可引起 噁心、便秘、意識錯亂和依賴性問題。阿片樣物質(Opioid)(甚至在高劑量上)不能在所有 患慢性疼痛的個體中產生疼痛緩解，並且對阿片樣物質的鎮痛抗性的產生使它們用於長期 治療的用途變得複雜。在特定的癌症中，疼痛的治療需要使用不可接受的高水平的阿片劑 (其帶來副作用)並且至少20%的被治療的患者仍然具有不受控制的疼痛。因此，存在對鑑定幹擾慢性疼痛過程的關鍵步驟和特別地用於治療和/或預防慢 性傷害性疼痛和/或慢性傷害性疼痛的症狀的新型藥學活性化合物的急切醫學需要。令人驚訝地，我們已發現抗CGRP抗體的施用(通過外周作用部位)在慢性疼痛， 特別地慢性傷害性疼痛例如癌症疼痛的預防和/或治療中是有效的。CGRP (降鈣素基因相關肽)是在中樞神經系統中用作神經遞質的37個胺基酸的神 經肽。其以高親和力結合CGRP受體，降鈣素受體樣受體(CRLR)，從而激活腺苷酸環化酶和 蛋白激酶A產生。已顯示通過中央穿透脊柱施用的小分子選擇性CGRP拮抗劑在神經病性和傷害性 疼痛病況的治療中是有用的(Adwanikar等人，Pain2007)，這表明脊髓中內源性CGRP的去 除具有鎮痛效應。此外，已顯示抗CGRP抗血清的鞘內施用在關節炎的嚙齒類動物模型中減 少傷害性行為(Kuraishi，Y.，等人 Neurosci. Iett (1998) 92，325-329)。令人驚訝地，我們已發現，當外周施用時，抗CGRP抗體的施用，對於外周作用部 位，在慢性疼痛，特別地慢性傷害性疼痛的預防和/或治療中是有效的。該外周施用途徑 提供了優於對鞘內或通過脊柱施用抗體(更高危險和不方便的過程)的需要的顯著有利方發明概述本發明提供了抗CGRP拮抗劑抗體用於製造藥劑的用途，所述藥劑用於預防和/或 治療慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀，其中藥劑經製備用於外周施用。本發明還提供了預防和/或治療個體中的慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀的方 法，該方法包括給所述個體外周施用治療有效量的抗CGRP拮抗劑抗體。
在一個實施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體在施用後在外周起作用。附圖概述

圖1.在骨癌疼痛模型中，抗體G2對應對8克von Frey刺激的機械性超敏反應的 作用。在手術後第9天用抗體G2或媒介物(PBS+0. 01 % Tween20)處理注射了 MRMT-I的 大鼠。組群在整個手術後期間一直都是健康的，如通過不斷增加的手術後體重增長顯示的 (數據未顯示)。數據是每組7-9隻大鼠的平均值士SEM。*p< 0.05，在各時間點上與媒介 物處理的組相比較。圖2.在骨癌疼痛模型中，抗體G2對應對15克von Frey刺激的機械性超敏反應 的作用。在手術後第9天用G2或媒介物(PBS+0. 01% Tween20)處理注射了 MRMT-I的大 鼠。數據是每組7-9隻大鼠的平均值士SEM。*p< 0.05，在各時間點上與媒介物處理的組 相比較。圖3.通過轉棒實驗(rota rod)測量的抗體G2對步行(ambulation)的作用。探 測2個終點。在骨癌疼痛模型中，跌落潛伏期(latency to fall)作為化合物誘導的運動 協調的損傷的量度(A)，轉棒實驗評分作為步行誘發的疼痛的量度(B)。在手術後第9天用 抗體G2或媒介物(PBS+0. 01% Tween20)處理注射了 MRMT-I的大鼠。數據是每組7-9隻大 鼠的平均值士SEM。*p < 0. 05，在各時間點上與媒介物處理的組相比較。圖4 證明抗體Gl抑制α -CGRP與CGRPl受體結合的結合測定數據。圖5a 在IV施用10mg/kg後，通過抗IgG ELISA測量的抗CGRP濃度的血清水平 (ug/ml)對時間。圖5b 在IV施用10、30、100mg/kg後，通過抗IgG ELISA測量的抗CGRP濃度的血 清水平(ug/ml)對時間。圖6使用C末端CGRP片段(CGRP 25-37)進行的丙氨酸掃描。親和力的變化以親 和力的損失倍數表示，並且其顯示抗CGRP抗體Gl結合人α -CGRP的C末端區域。圖7 利用Biacore進行的溶液競爭CGRP，CGRP片段或在序列上與CGRP相關的 肽用於確定抗體Gl的特異性。圖8 來自人、食蟹猴、大鼠、小鼠、狗和兔子的CGRP序列。物種之間的非保守殘基 以下劃線標示，抗體Gl的表位以粗體標示。圖9 顯示Gl抑制皮膚中的神經源性潮紅(neurogenic flare)(始於處理後90分 鍾)的數據。通過靜脈內施用來施用Gl(lml/kg)。數據來自每組6-8或13隻大鼠。*p = 0. 05，= 0. 01，與各時間點上的媒介物(磷酸緩衝鹽溶液)處理組相比較(AVOVA)。表1 在25°C下測量的抗人α -CGRP的抗CGRP抗體的Kd和IC50 [muMab7E9 = Gl 的鼠前體。其對於大鼠β-CGRP的Kd= InM。RN4901 =鼠類工具(murine tool)，其識別 與Gl相同的表位但在大鼠中顯示相同的親和力和選擇性(β-CGRP Kd = 17ηΜ) ；Gl =從 muMab7E9人源化的抗體(對於大鼠β CGRP的Kd = 0. InM)]。表2 利用Biacore測量的Gl結合親和力。發明描述一般技術除非另外指出，否則本發明的實施將使用分子生物學(包括重組技術)、微生物 學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術，所述技術在本領域技術人員的能力之內。
7此類技術在文獻中得到了詳盡的解釋，所述文獻例如，Molecular Cloning =A Laboratory Manual,第 2 片反(Sambrook ^ Α 1989)Cold Spring Harbor Pres s ；Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait, ed.,1984) ；Methods in Molecular Biology, Humana Press ；Cell Biology :A Laboratory Notebook(J. E. Cellis, ed.,1998)Academic Press ；Animal Cell Culture(R. I. Freshney, ed. ,1987) ；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather 和P. E. Roberts,1998)Plenum Press ；Cell and Tissue Culture-Laboratory Procedures (A.Doyle, J. B. Griffiths,和 D. G. Newell, eds. , 1993-1998)J. Wiley 和 Sons ；Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.) ；Handbook of Experimental Immunology(D. M. Weir 和 C. C. Blackwel1,eds.) ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller 和 M. P. Calos, eds. ,1987) ;Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel 等人，eds. , 1987) ；PCR :The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 等 人』 eds. , 1994) ；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan 等 人』 eds., 1991) ；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley 和 Sons,1999) ；Immunobiology (C.A.Janeway 和 P.Travers,1997) ；Antibodies(P. Finch,1997) ；Antibodies :a practical approach(D. Catty. , ed. , IRL Press,1988-1989) ；Monoclonal antibodies a practical approach(P. Shepherd 和 C. Dean，eds. , Oxford University Press,2000)； Using antibodies -.a laboratory manual (E. Harlow 和 D.Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999) ；The Antibodies(M. Zanetti 和 J.D.Capra, eds. , Harwood Academic Publishers, 1995)；以及 Cancer !Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita 等人，eds. , J. B. Lippincott Company, 1993)。定義「抗體」是能夠通過位於免疫球蛋白分子的可變區中的至少一個抗原識別部位特 異性結合靶例如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文中所使 用的，該術語不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，而且還包括其片段(例如Fab、Fab'、 F(ab' )2、Fv、dAb)、單鏈抗體(ScFv)、其突變體、嵌合抗體、雙價抗體(diabody)、包含抗體 部分的融合蛋白以及包含抗原識別部位的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構型。抗體包括 任何類型的抗體，例如IgG、IgA或IgM(或其亞類)，並且抗體不必是任何特定類型。取決於 其重鏈的恆定區的抗體胺基酸序列，免疫球蛋白可被分配至不同類型。存在5個主要類型 的免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且這些類型中的數個可進一步細分為亞類(同 種型)，例如，IgGl, IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。相應於不同類型的免疫球蛋白的重鏈 恆定結構域分別稱為α、δ、ε、Y和μ。不同類型的免疫球蛋白的亞基結構和三維構型 是熟知的。「 Fv"是包含完整抗原識別和結合部位的抗體片段。在雙鏈Fv類別中，該區域 由緊密、非共價結合的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域的二聚體組成。在單鏈 Fv類別中，一個重鏈可變結構域與一個輕鏈可變結構域可通過柔性的肽連接體共價連接， 以便輕鏈和重鏈可以以類似於雙鏈Fv類別中的二聚體結構的二聚體結構結合。正是通過 該構型，各可變結構域的3個CDR相互作用，從而確定VH-VL 二聚體的表面上的抗原結合特 異性。然而，甚至單個可變結構域(或只包含特異於抗原的3個⑶R的Fv的一半)也具有 識別和結合抗原的能力，雖然通常以比完整結合部位更低的親和力結合。
Fab片段還包含輕鏈的恆定結構域和重鏈的第一恆定結構域(CHl)。Fab'片段與 Fab片段相異在於重鏈CHl結構域的羧基末端上少數殘基(包括來自抗體鉸鏈區的一個或 多個半胱氨酸)的添加。F(ab)2片段是包含通過鉸鏈區的二硫鍵連接的2個Fab片段的二 價片段。抗體可具有一個或多個結合部位(以與抗原結合)。如果存在多於一個的結合部 位，則結合部位可以彼此相同或可以不同。例如，天然發生的免疫球蛋白具有兩個相同的結 合部位，單鏈抗體或Fab片段具有一個結合部位，而就序列和/或抗原/表位識別而言，「雙 特異性」或「雙功能」抗體(雙價抗體)具有兩個不同的結合部位。「分離的抗體」是(1)不與在其天然狀態中與其相伴的天然結合成分(包括其他天 然結合的抗體)結合的抗體，⑵不含來自相同物種的其他蛋白質的抗體，⑶由來自不同 物種的細胞表達的抗體，或(4)非天然發生的抗體。「單克隆抗體」是指均質性抗體群體，其中單克隆抗體由參與抗原的選擇性結合的 胺基酸(天然發生的和非天然發生的)組成。單克隆抗體的群體是高度特異性的，其抗單 個抗原部位(antigenic site)。術語「單克隆抗體」不僅包括完整的單克隆抗體和全長單 克隆抗體，而且還包括其片段(例如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、包 含抗體部分的融合蛋白、以及包含結合抗原所需的特異性和能力的抗原識別部位的免疫球 蛋白分子的任何其他修飾構型。關於抗體的來源或其產生的方式(例如，通過雜交瘤、噬菌 體選擇、重組表達、轉基因動物等)，不希望受到限制。如本文中所使用的，「人源化的"抗體是指非人(例如鼠)抗體的形式，其為包含 來源於非人免疫球蛋白的最小序列的特定嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如 Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗體的其他抗原結合子序列)。在極大程度上，人源化的抗體 是其中來自受者的互補決定區(CDR)的殘基被來自非人物種(供者抗體)例如小鼠、大鼠 或兔子的具有期望的特異性、親和力和生物學活性的CDR的殘基置換的人免疫球蛋白(受 者抗體)。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構架區(FR)殘基被相應的非人殘基置換。此 外，人源化的抗體可包含在受者抗體和引入的CDR或構架序列中都未發現但被包括以進一 步改進和最優化抗體性能的殘基。一般地，人源化的抗體將包含基本上所有的至少一個，通 常二個可變結構域，其中所有或基本上所有的CDR區相應於非人免疫球蛋白的CDR區並且 所有或基本上所有的FR區是人免疫球蛋白共有序列的FR區。人源化抗體最佳地還將包括 免疫球蛋白恆定區或結構域(Fe)(通常人免疫球蛋白的恆定區或結構域)的至少一部分。 抗體可具有如W099/58572中所描述的修飾的Fc區域。人源化抗體的其他形式具有相對於 原始抗體進行了改變的一個或多個⑶R(l、2、3、4、5、6個)，其也稱為「衍生自，，原始抗體的 一個或多個⑶R的一個或多個⑶R。如本文中所使用的，「人抗體」是指具有相應於由人產生的抗體的胺基酸序列的 胺基酸序列的抗體，和/或已使用本領域內已知的或本文中公開的用於製備人抗體的任 何技術進行製備。人抗體的該定義包括包含至少一個人重鏈多肽或至少一個人輕鏈多肽 的抗體。一個這樣的實例是包含鼠輕鏈和人重鏈多肽的抗體。人抗體可使用本領域內已 知的各種技術來產生。在一個實施方案中，人抗體選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表 達人抗體(Vaughan 等人，1996，Nature Biotechnology, 14 :309_314 ；Sheets 等人，1998， PNAS, (USA)95 :6157_6162 ；Hoogenboom 和 Winter，1991，J. Mol. Biol.，227 381 ；Marks 等人，1991，J. Mol. Biol.，222 :581)。還可通過將人免疫球蛋白基因座導入其中內源免疫球 蛋白基因已部分或完全被滅活的轉基因動物例如小鼠來製備人抗體。該方法描述於美國專 利 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 和 5，661，016 中。備選地， 還可通過永生化產生抗靶抗原的抗體的人B淋巴細胞(此類B淋巴細胞可從個體回收或 可已在體外進行了免疫)來製備人抗體。參見，例如，Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) ；Boerner 等人，1991, J. Immunol. , 147 (1) 86-95 ；和美國專利 5，750，373。單鏈抗體(scFc)是其中VL和VH區域經由使它們能夠製備為單個蛋白質鏈的合 成的連接體配對形成單價分子的抗體(Bird等人Science，242 =423-426(1988)和Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 :5879_5883 (1988))。雙價抗體是其中VH和VL結構域表達在單個多肽鏈上且使用連接體的二價、雙特 異性抗體，所述連接體太短以至於不允許相同鏈上的2個結構域之間形成配對，從而迫使 結構域與另一條鏈的互補結構域配對並且產生兩個抗原結合部位。「嵌合抗體"是指其中重鏈和輕鏈的各胺基酸序列的一部分與來源於特定物種 或屬於特定類型的抗體中的相應序列同源，然而鏈的其餘區段與另一種抗體中的相應序列 同源的抗體。一般地，在此類嵌合抗體中，輕鏈和重鏈的可變區模擬來源於一個哺乳動物物 種的抗體的可變區，而恆定部分與來源於另一個物種的抗體中的序列同源。此類嵌合形式 的一個明顯的有利方面是例如，可變區可通過使用可容易獲得的雜交瘤或B細胞(其來自 非人宿主生物)容易地從目前已知的來源產生，並且恆定區來源於例如人細胞製備物。在 可變區具有易於製備的有利方面並且特異性不受其來源影響的同時，來源於人的恆定區， 與來自非人來源的恆定區相比，當注射抗體時較不可能引起人受試者的免疫應答。然而，該 定義不限於該具體的實例。「功能性Fc區域」具有天然序列Fc區域的至少一個效應子功能。示例性「效應子 功能」包括Clq結合；補體依賴性細胞毒性(CDC) ；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細 胞毒性(ADCC)；吞噬作用(phagocytosis)；細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)的下調 等。此類效應子功能通常需要Fc區域與結合結構域(例如抗體可變結構域)組合，並且可 使用本領域內已知的用於評估此類抗體效應子功能的各種測定來進行評估。「天然序列Fc區域」包括與天然發現的Fc區域的胺基酸序列同一的胺基酸序列。 「變異Fc區域」包括與天然序列Fc區域的胺基酸序列相異在於至少一個胺基酸修飾，但仍 然保持天然序列Fc區域的至少一個效應子功能的胺基酸序列。優選，變異Fc區域，與天然 序列Fc區域或與親本多肽的Fc區域相比較，在天然序列Fc區域或在親本多肽的Fc區域 中具有至少一個胺基酸置換，例如大約1至大約10個胺基酸置換，優選大約1至大約5個 胺基酸置換。在本文中，變異Fc區域優選與天然序列Fc區域和/或與親本多肽的Fc區域 具有至少大約80%的序列同一性，更優選與其具有至少大約90%的序列同一性，更優選與 其具有至少大約95%的序列同一性。如本文中所使用的，「抗體依賴性細胞介導的細胞毒性」和「ADCC」是指細胞介導的 反應，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性 粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體，隨後引起靶細胞裂解。目的分子的ADCC活 性可使用體外ADCC測定例如美國專利5，500, 362或5，821，337中描述的測定來評估。可
10用於此類測定的效應子細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和NK細胞。備選地或另外地，目 的分子的ADCC活性可以例如在動物模型例如Clynes等人，1998，PNAS (USA), 95 :652_656 中公開的動物模型中進行體內評估。如本文中所使用的，「Fc受體"和「FcR」描述結合抗體的Fc區域的受體。優選的 FcR是天然序列人FcR。此外，優選的FcR是結合IgG抗體的FcR (γ受體)，其包括Fc γ RI、 Fc γ RII和Fc γ RIII亞類的受體，包括此類受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcyRII 受體包括Fc γ RIIA (〃激活性受體〃)和FcyRIIB("抑制性受體")，其具有相似的氨基 酸序列(主要不同在於其細胞質結構域)。FcR綜述於Ravet ch和Kinet，1991，Ann. Rev. Immunol.，9 457-92 ；Capel 等人，1994，Immunomethods，4 25-34 ；禾口 de Haas 等人，1995， J. Lab. Clin. Med. , 126 :330_41。「FcR，，還包括新生兒受體FcRn，其負責母源IgG至胎兒的 轉移(Guyer 等人，1976，J. Immunol.，117 587 ；和 Kim 等人，1994，J. Immunol. ,24 :249)。「補體依賴性細胞毒性」和「CDC」是指在補體存在的情況下靶的裂解。補體活化途 徑通過補體系統的第一組分(Clq)與和相關抗原複合的分子(例如抗體)的結合來起始。 為了評估補體活化，可進行CDC測定，例如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods, 202 =163(1996)中描述的測定。如本文中所使用的，術語「G1」和「抗體G1」可互換使用，其是指由具有保藏號 ATCC-PTA-6867和ATCC-PTA-6866的表達載體產生的抗體。重鏈和輕鏈可變區的胺基酸序 列示於SEQ ID No. 1和2中。抗體Gl的CDR部分(包括Chothia和Kabat CDR)以圖表的 形式描述於W02007/054809 (其內容以其全文通過弓丨用合併入本文)的圖5中。編碼重鏈和 輕鏈可變區的多核苷酸示於SEQ ID No. 9和10中。抗體Gl的特徵描述於W02007/054809 的實施例中，其全部內容通過引用合併入本文。Gl是人源化單克隆阻斷性抗體(blocking antibody) (IgG2)，其阻斷神經肽CGRP(a和b)的結合和活性以及由CGRP釋放引起的其神 經源性血管舒張作用。Gl是來源於鼠抗CGRP拮抗劑抗體前體(稱為muMAb7E9，如在使用 從用人和大鼠CGRP免疫的小鼠製備的、與鼠漿細胞瘤細胞融合的脾細胞的篩選中鑑定的) 的IgG2Aa單克隆抗CGRP拮抗劑抗體。通過將muMAb 7E9來源的輕鏈和重鏈的⑶R移植入 最接近的人種系序列，然後將至少1個突變導入各⑶R和將2個構架突變導入Vh中來產生 Gl。將兩個突變導入Gl的Fc結構域以抑制人Fc受體激活。已顯示Gl和muMab7E9識別 相同表位。如本文中所使用的，術語「G2」和「抗體G2」可互換使用，其是指抗大鼠CGRP小鼠 單克隆抗體，如Wong HC等人Hybridoma 12:93-106(1993)中所描述的。重鏈和輕鏈可變 區的胺基酸序列示於SEQ ID No. 19和20。編碼重鏈和輕鏈可變區的多核苷酸示於SEQ ID No. 27和28。在SEQ ID No. 21至26中提供了抗體G2的CDR部分。已顯示G2與Gl識別 相同的表位。如本文中所使用的，抗體的"免疫特異性"結合是指在抗體的抗原結合部位與該 抗體識別的特定抗原之間發生的抗原特異性結合相互作用(即，抗體在ELISA或其他免疫 測定中與蛋白質反應，並且不與不相關的蛋白質發生可檢測的反應)。「特異性結合」或「優先結合」(在本文中可互換使用)抗體或多肽的表位是本領域 內熟知的術語，並且測定此類特異性或優先結合的方法在本領域內也是熟知的。如果分子 更頻繁、更快、以更長的持續時間和/或更大的親和力與特定的細胞或物質反應或結合(與其和另外的細胞或物質的反應或結合相比)，則該分子被認為展示「特異性結合」或「優先結 合」。如果抗體以更大的親和力、親合力、更容易地和/或以更長的持續時間結合靶(與其 和其他物質的結合相比)，則所述抗體「特異性結合」或「優先結合」靶。通過閱讀該定義， 還應理解例如，特異性或優先結合第一靶的抗體(或部分或表位)可以或可以不特異性或 優先結合第二靶。因此，「特異性結合」或「優先結合」不一定需要(雖然其可包括)專一結 合。通常，但非必須地，結合是指優先結合。術語「多肽」、「寡肽」、「肽」和「蛋白質，，在本文中可互換使用，其是指任何長度的 胺基酸聚合物。聚合物可以是線性的或分枝的，其可包含修飾的胺基酸，並且其可被非氨基 酸中斷。該術語還包括已被天然修飾或通過幹預(intervention)修飾的胺基酸聚合物；例 如，二硫鍵的形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾，例如與標記成 分的綴合。還包括在該定義中的是例如包含一個或多個胺基酸類似物(包括例如，非天然 胺基酸等)以及本領域內已知的其他修飾的多肽。應理解，因為本發明的多肽基於抗體，因 此多肽可以以單鏈或結合的鏈的形式存在。「多核苷酸」或「核酸」，如在本文中可互換使用的，是指任何長度的核苷酸聚合物， 且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或鹼基，和/ 或它們的類似物，或可由DNA或RNA聚合酶整合入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含 修飾的核苷酸例如甲基化的核苷酸和它們的類似物。如果存在，可在聚合物組裝之前或之 後賦予對核苷酸結構的修飾。核苷酸序列可被非核苷酸成分中斷。在聚合後，多核苷酸還 可被進一步修飾，例如通過與標記成分綴合來修飾。修飾的其他類型包括例如「加帽」，用類 似物置換一個或多個天然發生的核苷酸，核苷酸間修飾例如使用不帶電荷的連接(例如， 甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸醯胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)的修飾和使用帶電 荷的連接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂部分例如蛋白質(例如， 核酸酶，毒素，抗體，信號肽，多聚L賴氨酸等)的修飾，使用插入劑(例如，吖啶、補骨脂素 等)的修飾，包含螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)的修飾，含有烷化劑 (alkylator)的修飾，具有修飾的連接(例如，α端基異構(anomeric)核酸等)的修飾，以 及多核苷酸的未修飾形式。此外，通常存在於糖中的任何羥基可以例如被膦酸基團、磷酸基 團置換，由標準保護基團保護，或被活化以產生與另外的核苷酸的另外的連接，或可被綴合 至固體支持物。5』和3』末端OH可被磷酸化或可用1至20個碳原子的有機加帽基團部分 或胺置換。其他羥基還可被衍生至標準保護基團。多核苷酸還可包含本領域內公知的核糖 或脫氧核糖的類似物形式，包括例如2' -0-甲基_、2' -0-烯丙基、2'-氟-或2'-疊 氮基-核糖、碳環糖類似物、α-端基異構糖、差向異構(epimeric)糖例如阿拉伯糖、木糖 或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物和無鹼基核苷類似物例如甲基核苷。一 個或多個磷酸二酯連接可被備選連接基團置換。此類備選連接基團包括但不限於，其中磷 酸酯被 P(0)S( 「硫代(thioate)」)、P(S)S( 「二硫代」)、「 (0)NR2( 「醯胺化」)、P(0)R、P(0) OR'、⑶或CH2( 「formacetal」)置換的實施方案，其中各R或R'獨立地是H或經取代或 未經取代的烷基(1-20個C)(任選地包含醚(-0-)連接)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或 araldyL·多核苷酸中並非所有連接必須是相同的。上述描述適用於本文中提及的所有多 核苷酸，包括RNA和DNA。抗體的「可變區」是指單獨的或組合的抗體輕鏈可變區或抗體重鏈可變區。重鏈和輕鏈的可變區各自由通過3個互補決定區(CDR)(也稱為高變區)連接的4個構架區(FR) 組成。各鏈中的⑶R通過FR緊密地結合在一起並且，與來自另一條鏈的⑶R —起，促成了 抗體的抗原結合部位的形成。存在至少兩個用於確定CDR的技術(1)基於跨物種序列變 異性的方法(艮口，Kabat 等人 Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第 5 版，1991 ,National Institutes of Health,Bethesda MD))；禾口 (2)基於抗原-抗體複合 物的晶體學研究的方法(Chothia 等人(1989)Nature 342 877 ；Al-Iazikani 等人(1997) J. Molec. Biol. 273 :927-948))。如本文中所使用的，CDR可以指通過任一方法或通過兩種 方法的組合確定的⑶R。抗體的「恆定區」是指單獨的或組合的抗體輕鏈恆定區或抗體重鏈恆定區。如本文中所使用的，「抗CGRP拮抗劑抗體」(可互換地稱為「抗CGRP抗體」)是指 能夠結合CGRP並且抑制CGRP生物學活性和/或下遊途徑的抗體。抗CGRP拮抗劑抗體包 括阻斷、拮抗、抑制或減少(包括顯著地)CGRP生物學活性的抗體。為了本發明的目的，應 明確地理解，術語「抗CGRP拮抗劑抗體」包括所有之前鑑定的術語、名稱以及功能狀態和特 徵，由此CGRP本身，CGRP生物學活性或生物學活性的結果在任何有意義的程度上基本上被 消除、減少或中和。本文中提供了抗CGRP拮抗劑抗體的實例。如本文中所使用的，「大體上純的」是指這樣的材料，其為至少50%純的(即，不含 汙染物)，更優選至少90 %純的，更優選至少95 %純的，更優選至少98 %純的，更優選至少 99%純的。「宿主細胞」包括個體細胞或細胞培養物，其可以是或已經是用於多核苷酸插入物 的整合的載體的受者。宿主細胞包括單個宿主細胞的後代，並且由於天然、意外或故意突變 的原因，後代可以不必與原始親本細胞完全相同(在形態學上或在基因組DNA互補物上)。 宿主細胞包括用本發明的多核苷酸體內轉染的細胞。如本文中所使用的，「治療」是用於獲得有益或期望的臨床結果的方法。為了本發 明的目的，有益或期望的臨床結果包括但不限於下列中的一個或多個慢性疼痛和/或慢 性疼痛的症狀的任何方面的改善或減輕。為了本發明的目的，有益或期望的臨床結果包括 但不限於下列中的一個或多個包括疼痛和/或與慢性疼痛相關的症狀的緩解、減輕的嚴重度。藥物、化合物或藥物組合物的「有效量」是足以產生有益或期望的結果包括臨床結 果例如痛覺的減輕或減少的量。可以以一次或多次施用來施用有效量。為了本發明的目的， 藥物、化合物或藥物組合物的有效量是足以治療、改善、減少慢性疼痛或與慢性疼痛相關的 症狀的強度和/或預防慢性疼痛或與慢性疼痛相關的症狀的量。如在臨床背景中所理解 的，可以結合或可以不結合另一種藥物、化合物或藥物組合物來獲得藥物、化合物或藥物組 合物的有效量。因此，可在施用一種或多種治療劑的背景中考慮「有效量」，並且如果與一種 或多種其他試劑結合，獲得或可獲得期望的結果，則單個試劑可被認為是以有效量提供。在一個實施方案中，「經製備用於」在本文中是指藥劑以劑量單位等形式存在，其 經合適地包裝和/或標記用於外周施用。慢性疼痛和/或與慢性疼痛相關的症狀的「日益減少的發病率」是指任何不斷減 輕的嚴重度(其可包括不斷減少的對通常用於此類病症的其他藥物和/或治療的需要和/ 或不斷減少的(暴露至)所述藥物和/或治療的量)、持續時間和/或頻率。
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「改善」慢性疼痛和/或與慢性疼痛相關的症狀是指當與不施用抗CGRP拮抗劑抗 體相比較時，一種或多種慢性疼痛的症狀和/或與慢性疼痛相關的症狀的減輕或好轉。「改 善」還包括症狀持續時間的縮短或減少。「緩和」慢性疼痛和/或與慢性疼痛相關的症狀是指用根據本發明的抗CGRP拮 抗劑抗體治療的個體或個體的群體中，慢性疼痛的一個或多個不期望的臨床表現的程度減輕。如本文中所使用的，「延遲」慢性疼痛的發展意指推遲、阻止、減緩、遲滯、穩定和/ 或延緩慢性疼痛和/或與慢性疼痛相關的症狀的進展。取決於疾病的歷史和/或待治療的 個體，該延遲可以是不同的時間長度。如對於本領域技術人員是很明顯的，充分或顯著的延 遲事實上可包括預防，因為個體不發展慢性疼痛。「延遲」症狀的發展的方法是這樣的方法， 當與不使用該方法相比較時，其在給定的時幀內減少發展症狀的可能性和/或在給定的時 幀內減少症狀的程度。此類比較通常基於臨床研究(使用統計學上顯著的受試者數量)。「生物學樣品」包括從個體獲得的各種樣品類型，並且可用於診斷或監控測定。該 定義包括生物來源的血液和其他液體樣品、固體組織樣品例如活檢樣本或組織培養物或來 源於其的細胞以及其後代。該定義還包括在它們獲得後以任何方式進行了操作(例如通過 用試劑處理、增溶或就某些成分例如蛋白質或多核苷酸進行富集，或為了切片而包埋在半 固體或固體基質中)的樣品。術語「生物學樣品」包括臨床樣品，並且還包括培養中的細胞、 細胞上清液、細胞裂解物、血清、血漿、生物學液體和組織樣品。「個體」或「受試者」是脊椎動物，優選哺乳動物，更優選人。哺乳動物包括但不限 於，家畜(例如牛)、運動動物(sport animal)、寵物(例如貓、狗和馬)、靈長類動物、小鼠 和大鼠。如本文中所使用的，「載體"是指能夠遞送並且優選在宿主細胞中表達一個或多 個目的基因或序列的構建體。載體的實例包括但不限於病毒載體、裸露的DNA或RNA表達 載體、質粒、粘粒或噬菌體載體、與陽離子凝聚劑(condensing agent)結合的DNA或RNA表 達載體、封裝在脂質體中的DNA或RNA表達載體和某些真核細胞例如生產者細胞(producer cell)ο如本文中所使用的，「表達控制序列"是指指導核酸的轉錄的核酸序列。表達控 制序列可以是啟動子，例如組成型或誘導型啟動子，或增強子。表達控制序列有效地連接至 待轉錄的核酸序列。如本文中所使用的，「藥學上可接受的載體"包括當與活性成分組合時允許所述 成分保持生物學活性，並且不與受試者的免疫系統反應的任何材料。實例包括但不限於，任 何標準藥物載體例如磷酸緩衝鹽溶液、水、乳劑例如油/水乳劑和各種類型的溼潤劑。用於 氣霧劑或胃腸外施用的優選稀釋劑是磷酸緩衝鹽溶液或生理鹽水(0. 9% )。通過熟知的常 規方法(參見，例如，Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 18 版,A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co. , Easton, PA,1990 ；禾口 Remington, The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing, 2000)配製包含此類載體的組合物。如本文中所使用的，術語「外周施用的」是指籍以遞送物質、藥劑和/或抗CGRP 拮抗劑抗體的途徑，特別地其是指不通過中樞、不通過脊柱、非鞘內、非直接地遞送入 CNS0該術語是指除了剛才描述的施用途徑外的施用途徑，其包括口服、舌下、口腔、局部(topical)、經直腸、通過吸入、透皮、皮下、靜脈內、動脈內、肌內、心臟內、骨內、真皮內、腹 膜內、經黏膜、經陰道、玻璃體內、關節內、關節周、局域(local)或經表皮(印icutaneous) 的途徑。術語「在外周起作用」，如本文中所使用的，是指物質、化合物、藥劑和/或抗CGRP 拮抗劑抗體的作用部位，相對於中樞神經系統，所述部位在周圍神經系統內，當外周施用 時，所述化合物、藥劑和/或抗CGRP拮抗劑抗體受到不能穿過屏障到達CNS和腦的限制。術 語「中央滲透(centrally penetrat ing) 」是指物質能夠穿過屏障到達腦或CNS。術語"K。ff"，如本文中所使用的，意指抗體從抗體/抗原複合物解離的解離速率 常數。術語〃 Kd"，如本文中所使用的，意指抗體-抗原相互作用的解離常數。本發明涉及用於預防和/或治療個體中慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀的藥劑以 及用於預防和/或治療個體中慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀的方法。在第一方面，本發明提供了抗CGRP拮抗劑抗體用於製造藥劑的用途，所述藥劑用 於預防和/或治療慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀，其中藥劑經製備用於外周施用或其中 外周施用藥劑。在第二方面，本發明提供了用於預防和/或治療慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀 的抗CGRP拮抗劑抗體，其中抗體經製備用於外周施用或其中外周施用抗體。在第三方面，本發明提供了抗CGRP拮抗劑抗體用於製造藥劑的用途，所述藥劑用 於改善、控制慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀、減少慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀的發病 率或延遲慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀的發展或進展，其中藥劑經製備用於外周施用或 其中外周施用藥劑。在該方面的可選方案中，本發明提供了抗CGRP拮抗劑抗體，所述抗體 用於改善、控制慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀、減少其發病率或延遲其發展或進展，其中 抗體經製備用於外周施用或其中外周施用抗體。在第四方面，本發明提供了預防和/或治療個體中慢性疼痛和/或慢性疼痛的症 狀的方法，該方法包括給個體外周施用有效量的抗CGRP拮抗劑抗體。在第五方面，本發明提供了在個體中改善、控制慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀、 減少其發病率或延遲其發展或進展的方法，該方法包括給個體外周施用有效量的抗CGRP 拮抗劑抗體。根據本發明的優選實施方案，個體優選是哺乳動物，例如伴侶動物例如馬、貓或狗 或家畜例如綿羊、牛或豬。最優選，哺乳動物是人。根據本發明的優選實施方案，藥劑和/或抗CGRP拮抗劑抗體經製備用於口服、舌 下、口腔、局部、直腸、吸入、透皮、皮下、靜脈內、動脈內、肌內、心臟內、骨內、真皮內、腹膜 內、經黏膜、經陰道、玻璃體內、關節內、關節周、局域或經表皮施用。根據其他優選實施方案，藥劑經製備用於在慢性疼痛發展之前和/或期間和/或 之後外周施用。在一個實施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體在施用後在外周起作用。在一個實施方案 中，不通過中樞、脊柱或鞘內途徑來施用抗CGRP拮抗劑抗體。根據本發明的優選實施方案，慢性疼痛包括慢性傷害性疼痛、慢性神經性疼痛、慢 性炎性疼痛、纖維肌痛、爆發性疼痛(breakthrough pain)和持續性疼痛中的一種或多種。慢性疼痛可包括痛覺過敏、異常性疼痛、中樞致敏、外周致敏、抑制解除(disinhibition) 和增強的易化(facilitation)的一種或多種。根據本發明的另外的優選實施方案，慢性疼痛是癌症疼痛，優選癌症疼痛起因於 惡性腫瘤或起因於優選選自下列中的一種或多種的癌症腺組織中的腺癌、器官的胚性組 織中的母細胞瘤、上皮組織中的癌、形成血細胞的組織中的白血病、淋巴組織中的淋巴瘤、 骨髓中的骨髓瘤、結締或支持性組織中的肉瘤、腎上腺癌、AIDS相關淋巴瘤、貧血、膀胱癌、 骨癌、腦癌、乳腺癌、類癌瘤、宮頸癌、化學療法(chemotherapy)、結腸癌、血細胞減少、子宮 內膜癌、食管癌、胃癌、頭部癌症、頸癌、肝膽管癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、何杰金 氏病、淋巴瘤、非何杰金氏病、神經系統腫瘤、口癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、皮膚 癌、胃癌症、睪丸癌症、甲狀腺癌、尿道癌、骨癌、結締組織的肉瘤癌、骨組織的癌症、造血細 胞的癌症、骨髓癌、多發性骨髓瘤、白血病、原發性或繼發性骨癌、轉移至骨的腫瘤、浸潤神 經和空腔臟器的腫瘤、鄰近神經結構的腫瘤。更優選，癌症疼痛包括內臟疼痛，優選起因於 胰腺癌和/或腹部中的轉移灶的內臟疼痛。更優選地，癌症疼痛包括軀體疼痛，優選由骨 癌、骨中的轉移灶、術後疼痛、結締組織的肉瘤癌、骨組織的癌症、骨髓的造血細胞的癌症、 多發性骨髓瘤、白血病、原發性或繼發性骨癌的一種或多種癌症引起的軀體疼痛。根據本發明的優選實施方案，抗CGRP拮抗劑抗體結合CGRP，更優選地結合CGRP並 且抑制CGRP結合CGRP受體的能力。優選抗CGRP拮抗劑抗體結合人和嚙齒類動物的CGRP， 優選人和大鼠的CGRP。更優選抗體結合人CGRP，更優選抗CGRP拮抗劑抗體結合人α-CGRP 或結合人α-CGRP和/或β-CGRP。最優選抗CGRP拮抗劑抗體是展示任何一種或多種下列 功能特徵的抗體(a)結合CGRP ； (b)阻止CGRP結合其受體；(c)阻斷或減少CGRP受體的激 活，包括cAMP激活；(d)抑制、阻斷、壓制或減少CGRP的生物學活性，包括由CGRP信號轉導 介導的下遊途徑，例如受體結合和/或細胞對CGRP的應答的誘發；(e)預防、改善或治療慢 性疼痛的任何方面；(f)增加CGRP的清除；和(g)抑制(減少)CGRP的合成、產生或釋放。已知本發明的抗體(包括Gl和G2)結合CGRP並且消除其生物利用度，例如在血 清中的生物利用度，從而阻止CGRP接觸其受體以及CGRP的下遊細胞應答和生物學效應例 如潮紅和血管舒張。在本發明的另外的優選實施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體結合CGRP的片段，更優選 結合CGRP的片段以及結合全長CGRP。優選，抗CGRP拮抗劑抗體結合CRGP的C末端區域 或片段。CRGP的C末端區域或片段優選包括CGRP的胺基酸19-37或25-37或29-37或備 選地30-37，另外備選地31-37。在另外的實施方案中，CRGP的C末端區域或片段優選包含 CGRP的胺基酸32-37，最優選33至37。優選CGRP是α -CGRP或β -CGRP,更優選人或齧齒 類動物，更優選人或大鼠，更優選人，更優選人α "CGRP或β -CGRP，最優選人α -CGRP。在本發明的另外的優選實施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體特異性結合胺基酸序列 GSKAF。優選，CGRP的序列GSKAF是抗CGRP拮抗劑抗體結合的表位，其優選在位點33至37 上，最優選，所述序列是GXXXF (其中X可以是任何胺基酸)，其優選在CGRP的位點33至37 上，其末端由CGRP的胺基酸G 33和F 37確定。在一個實施方案中，本發明提供了特異性結合由CGRP的胺基酸G33至F37確定的 表位的抗CGRP拮抗劑抗體。抗CGRP拮抗劑抗體可特異性結合由胺基酸序列GSKAF確定的 表位。在一個實施方案中，本發明提供了這樣的抗體在本發明的各個方面中定義的應用和
16方法中的用途。在一個實施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體抑制或防止CGRP受體的激活。優選抗CGRP 抗體具有0.0001(0. InM)至500 μ M的IC5tl。在一些優選實施方案中，IC5tl是0. 0001 μ M至 250 μ Μ、100 μ Μ、50 μ Μ、10 μ Μ、1 μΜ、500ηΜ、250ηΜ、100ηΜ、50ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、10ηΜ、5ηΜ、InM 或 0. 5ηΜ 中的任一個，或為大約 250μΜ、100μΜ、50μΜ、10μΜ、1μΜ、500ηΜ、250ηΜ、100ηΜ、 50ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、10ηΜ、5ηΜ、InM或0. 5ηΜ中的任一個，如在體外結合測定中測量的。在一些 另外的優選實施方案中，IC5tl小於500ρΜ或IOOpM或50ρΜ的任一個，如在體外結合測定中 測量的。在另外的更優選的實施方案中，IC5tl是1.2ηΜ或31ηΜ。在另外的優選實施方案中，使用的抗CGRP拮抗劑抗體能夠與本文中上述抗體競 爭對CGRP或對CGRP的片段的結合，或對CGRP的片段以及全長CGRP的結合，優選對CRGP 的C末端區域或片段的結合，優選CRGP的C末端區域或片段包含CGRP的胺基酸19-37或 25-37或29-37或備選地30-37，另外備選地31-37。在另外的實施方案中，CRGP的C末端 區域或片段優選包含CGRP的胺基酸32-37，最優選33至37。在另外的優選實施方案中，如本發明中使用的抗CGRP拮抗劑抗體或其抗原結合 部分能夠與本文中上述抗CGRP拮抗劑抗體，特別地如本文中描述的Gl或G2 (a)競爭對CGRP或CGRP的片段的結合，或對CGRP的片段以及全長CGRP的結合， 優選對CRGP的C末端區域或片段的結合，優選CRGP的C末端區域或片段包含CGRP的氨基 酸19-37或25-37或29-37或備選地30-37，另外地備選地31-37，優選胺基酸32-37，最優 選33至37，優選CGRP是α或β CGRP,優選β CGRP,更優選嚙齒類動物或人CGRP，最優選 人 CGRP，(b)競爭對表位序列GSKAF(其優選在(a)中定義的CGRP的胺基酸位點33至37 上)的結合，更優選對序列GXXXF的結合，其中X是任何胺基酸，優選GXXXF在(a)中定義 的CGRP的胺基酸位點33至37上，(c)以大體上相同的Kd和/或大體上相同的K。ff競爭如(a)或(b)中描述的結 合，和/或(d)競爭對CGRP的結合和抑制/拮抗CGRP生物學活性和/或下遊途徑，優選CGRP 是α或i3CGRP，優選日061^，更優選嚙齒類動物或人061^，最優選人061^。抗CGRP 拮抗劑抗體優選以 0. 000001 μ M (0. 00 InM)或 0. 00001 μ M (0. 0 InM)至 500 μ M的結合親和力(Kd)結合CGRP、CGRP的區域或CGRP的片段。在一些優選實施方 案中，結合親和力(Kd)在 0.000001 μΜ 或 0.00001 μΜ 與 250 μ Μ、100 μ Μ、50 μ Μ、10 μ Μ、 1 μ Μ、500ηΜ、250ηΜ、100ηΜ、50ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、10ηΜ、5ηΜ、1ηΜ、0. 5ηΜ、1ηΜ、0. 05ηΜ 或 0. OlnM, 0. 005ηΜ、0. OOlnM 中的任一個之間，或為大約 250 μ Μ、100 μ Μ、50 μ Μ、10 μ Μ、1 μ Μ、500ηΜ、 250ηΜ、100ηΜ、50ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、10ηΜ、5ηΜ、1ηΜ、0· 5ηΜ、1ηΜ、0· 05ηΜ 或 0· OlnM,0. 005ηΜ、 0. OOlnM中的任一個，如在體外結合測定中測量的。在一些另外的優選實施方案中，結合親 和力(Kd)小於500ρΜ或ΙΟΟρΜ，50pM或10pM，5pM，IpM的任一個，如在體外結合測定中測量 的。在另外的更優選的實施方案中，結合親和力(Kd)是0.04nM或16nM。本發明中使用的抗CGRP拮抗劑抗體可選自單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段 (例如，Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv, Fe、ScFv等)、嵌合抗體、雙特異性抗體、異源綴合抗體 (heteroconjugate antibody)、單鏈(ScFv)抗體、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白(例如，結構域抗體)、人源化抗體以及包含所需特異性的抗原識別部位的免疫球蛋白分子的任 何其他修飾構型，包括抗體的糖基化變體、抗體的胺基酸序列變體和共價修飾的抗體。抗 CGRP拮抗劑抗體可以是鼠、大鼠、人或任何其他來源(包括嵌合或人源化抗體)。在一些實 施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體可以是人源化的，但更優選是人抗體。優選，抗CGRP拮抗劑 抗體是分離的抗體，更優選其是大體上純的抗體。當抗CGRP拮抗劑抗體是抗體片段時，片 段優選保留原始抗體的功能特徵，即如在上述功能特徵中描述的CGRP結合和/或拮抗劑活 性。 抗CGRP拮抗劑抗體的實例在本領域內是已知的。因此根據本發明的優選實 施方案，本發明中使用的抗CGRP拮抗劑抗體優選是這樣的抗CGRP抗體，其是如⑴ W02007/054809, (ii) W02007/076336，(iii) Tan 等人，Clin. Sci. (Lond) · 89 :565_73，1995， (iv) Sigma (Missouri, US)，產品編號 C7113 (克隆 #4901)，(v) Plourde 等人，PeptidesH 1225-1229，1993的任一項中一般或特別地公開的抗CGRP抗體，或其包含下列或由下列組
成
(a)所述抗體的片段(例如，Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv、Fc、ScFv 等)，
(b)所述抗體的輕鏈，
(C)所述抗體的重鏈，
(d)來自所述抗體的輕鏈和/或重鏈的--個或多個可變區，
(e)所述抗體的一個或多個⑶R(l、2、3、」4、5 或 6 個 CDR)，
(f)來自所述抗體的重鏈的⑶R H3，
(g)來自所述抗體的輕鏈的⑶R L3,
(h)來自所述抗體的輕鏈的3個CDR，
⑴來自所述抗體的重鏈的3個⑶R，
(J)來自所述抗體的輕鏈的3個CDR和來自所述抗體的重鏈的3個CDR，
(k)(a)至(j)的任一項或多項。
根據本發明的優選實施方案，抗CGRP拮抗劑抗體是抗體G2或抗體Gl。；
明的最優選實施方案，使用的抗CGRP拮抗劑抗體是在專利申請W02007/054809中特別地公 開的抗CGRP抗體G1，或包括W02007/054809的表6中顯示的其變體，還包括Gl的功能等價 抗體，即包含不顯著影響它們的功能特徵(例如CRGP結合或拮抗劑活性)的胺基酸殘基的 保守置換或一個或多個胺基酸的缺失或添加，以及具有增強或減少的活性和/或結合的變 體。如本文中所使用的，術語「G1」和「抗體G1」可互換使用，其是指由申請W02007/054809 中公開的具有保藏號ATCC PTA-6867和ATCC PTA-6866的表達載體產生的抗體。
根據本發明的另外的實施方案，抗CGRP拮抗劑抗體包含選自下列的多肽或 由選自下列的多肽組成(a) W02007/054809的表6中顯示的抗體Gl或其變體；(b) W02007/054809的表6中顯示的抗體Gl或其變體的片段或區域；(c)W02007/054809的 表6中顯示的抗體Gl或其變體的輕鏈；(d)W02007/054809的表6中顯示的抗體Gl或其 變體的重鏈；(e)來自W02007/054809的表6中顯示的抗體Gl或其變體的輕鏈和/或重 鏈的一個或多個可變區；(f)W02007/054809的表6中顯示的抗體Gl或其變體的一個或 多個CDR(1、2、3、4、5或6個CDR) ； (g)來自W02007/054809的表6中顯示的抗體Gl或其 變體的重鏈的CDR H3 ； (h)來自W02007/054809的表6中顯示的抗體Gl或其變體的輕鏈
18的⑶R L3 ； (i)來自W02007/054809的表6中顯示的抗體Gl或其變體的輕鏈的3個⑶R ； (j)來自W02007/054809的表6中顯示的抗體Gl或其變體的重鏈的3個⑶R ； (k)來自 W02007/054809的表6中顯示的抗體Gl或其變體的輕鏈的3個⑶R和/或重鏈的3個⑶R ； 和(i)包含(b)至(k)的任一項的抗體。本發明還提供了包含上述的任一項或多項的多 肽。在一些實施方案中，至少1、2、3、4、5或6個⑶R與W02007/054809的表6中顯示的Gl 或其變體的至少 1、2、3、4、5 或 6 個 CDR 至少大約 85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、 96%、97%、98%或 99% 同一。CDR區域的確定完全在本領域技術人員的能力之內。應理解，在一些實施方案中， ⑶R可以是Kabat和Chothia⑶R的組合。在一些實施方案中，⑶R是Kabat⑶R。在其他 實施方案中，CDR是Chothia CDR。抗CGRP拮抗劑抗體優選包含W02007/054809的表6中顯示的抗體Gl或其變體的 片段或區域(例如，Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv、Fe、ScFv等)或由所述片段或區域組成。優 選所述片段或區域具有抗CGRP拮抗劑抗體的功能特徵例如CGRP結合活性和/或拮抗劑活 性，並且包含一個或多個輕鏈、重鏈、片段(所述片段包含來自輕鏈和/或重鏈的一個或多 個可變區，或來自抗體Gl的輕鏈和/或重鏈的一個或多個CDR)或由其組成。根據本發明的另外的優選實施方案，抗CGRP拮抗劑抗體包含輕鏈可變區LCVR和/ 或重鏈可變區HCVR，所述輕鏈可變區包含具有選自專利申請W02007/076336的SEQ ID No: 28-32的序列的肽，所述重鏈可變區包含具有選自專利申請W02007/076336的SEQ ID No 34-38的序列的肽。更優選地，抗CGRP拮抗劑抗體包含專利申請W02007/076336的表1中顯示的SEQ ID NO的LCVR多肽並且還包含專利申請W02007/076336的表1中顯示的SEQ ID NO的HCVR多肽。根據本發明的另外的實施方案，所使用的抗CGRP拮抗劑抗體包含選自專利申請 W02007/076336 的 SEQ ID No :8_13 的輕鏈 CDR (CDRL)和 / 或選自專利申請 W02007/076336 的 SEQ ID No 14-22 的重鏈 CDR(CDRH)。製備和分離申請W02007/076336的抗CGRP拮抗劑抗體的方法以及證明所述抗體 的CGRP結合和拮抗劑特徵的數據描述於申請W02007/076336中。優選，用於本發明的抗CGRP拮抗劑抗體包含VH結構域，所述VH結構域與本文中 所示的SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :19在胺基酸序列上至少85%、至少86%、至少87%、至 少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一。優選，抗CGRP拮抗劑抗體包含VL結構域，所述VL結構域與本文中所示的SEQ ID NO :2或SEQ ID NO: 20在胺基酸序列上至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少 89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%或100%同一。抗CGRP拮抗劑抗體優選包含VH結構域和VL結構域，所述VH結構域和VL結構域 在胺基酸序列上分別與本文中所示的SEQ ID NO :1和2或分別與本文中所示的SEQ ID NO: 19和20至少85 %、至少86 %、至少87 %、至少88 %、至少89 %、至少90 %、至少91%、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一。優選，抗CGRP拮抗劑抗體包含在胺基酸序列上與本文中所示的SEQID NO 1至少 90%同一的VH結構域和在胺基酸序列上與本文中所示的SEQ ID NO :2至少90%同一的VL 結構域。備選地，抗CGRP拮抗劑抗體優選包含在胺基酸序列上與本文中所示的SEQ ID NO 19至少90%同一的VH結構域和在胺基酸序列上與本文中所示的SEQ ID N0:20至少90% 同一的VL結構域。抗CGRP拮抗劑抗體優選包含至少一個CDR，所述CDR選自(a). SEQID N0:3或21 中所示的 CDR Hl ； (b). SEQ ID NO 4 或 22 中所示的 CDR H2 ； (c). SEQ ID NO 5 或 23 中所 示的 CDR H 3 ； (d). SEQ ID NO 6 或 24 中所示的 CDR Ll ； (e) SEQ ID NO 7 或 25 中所示的 CDR L2 ； (f) · SEQ ID NO 8 或 26 中所示的 CDR L3 ；禾口 (g) · W02007/054809 的表 6 中所示的 CDR Li、CDR L2 和 CDR H2 的變體。根據本發明的優選實施方案，抗CGRP拮抗劑抗體重鏈恆定區可來自任何類型的 恆定區，例如IgG, IgM, IgD, IgA和IgE ；和任何同種型例如IgGl、lgG2、IgG3和IgG4。更優選，抗CGRP拮抗劑抗體包含由具有ATCC登錄號PTA-6867的表達載體產生的 重鏈。更優選，抗CGRP拮抗劑抗體包含由具有ATCC登錄號PTA-6866的表達載體產生的輕 鏈。更優選，抗CGRP拮抗劑抗體由具有ATCC登錄號PTA-6867和PTA-6866的表達載體產 生。優選，用於本發明的抗CGRP拮抗劑抗體是本文中定義的抗體Gl或抗體G2。根據本發明的另外的實施方案，抗CGRP拮抗劑抗體包含修飾的恆定區，如例如 W02007/054809中描述的。優選，修飾的恆定區在免疫學上是惰性的(包括在免疫學上部分 惰性的)，以便其不引起補體介導的裂解，不刺激抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)， 不活化小膠質細胞。優選修飾的恆定區的一個或多個此類活性降低。最優選，恆定區如 Eur. J. Immunol. (1999)29 :2613_2624 ；PCT 申請號 PCT/GB99/01441 ；禾口 / 或英國專利申請 9809951. 8中所述進行修飾。根據本發明的優選實施方案，抗CGRP拮抗劑抗體包括含有下 列突變的人重鏈IgG2恆定區A330、P331至S330、S331 (胺基酸編號參照野生型IgG2序 列)。Eur. J. Immunol. (1999)29 :2613_2624。製備和分離申請W02007/054809的抗CGRP拮抗劑抗體的方法以及證明所述抗體 的CGRP結合和拮抗劑特徵的數據描述於申請W02007/054809中。所述申請的SEQ ID No. 1 至14的序列在本文中分別作為SEQ ID No. 1至14提供。根據本發明的另外的實施方案，藥劑經製備用於外周施用，每周1至7次，更優選 每月1至4次，更優選每6個月的時期1至6次，更優選每年1至12次。優選，藥劑經製備 用於在選自下列的時期內外周施用每天1次，每2、3、4、5或6天1次、每周1次、每2周1 次、每3周1次、每月1次、每2個月1次、每3個月1次、每4個月1次、每5個月1次、每6 個月1次、每7個月1次、每8個月1次、每9個月1次、每10個月1次、每11個月1次或 每年1次。根據優選實施方案，藥劑經製備用於通過選自下列的一個或多個的途徑外周施 用口服、舌下、口腔、局部、經直腸、通過吸入、透皮、皮下、靜脈內、動脈內或肌內、通過心臟 內施用、骨內、真皮內、腹膜內、經黏膜、經陰道、玻璃體內、經表皮、關節內、關節周或局域。根據本發明的另外的實施方案，藥劑經製備用於外周施用，以0. 1至200mg/ml的抗體濃度；優選以大約 0. 5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 或 200mg/ml+/_10% 的誤差中的任一 個的抗體濃度或以 0. 1 至大約 0. 5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 或 200mg/ml+/_10 % 的誤差中 的任一個之間的抗體濃度，最優選以50mg/ml的抗體濃度。根據本發明的另外的實施方案，藥劑經製備用於外周施用，以0. 1至200mg/kg體 重的抗體濃度；優選以大約 0. 5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 或 200mg/kg 體重 +/-10% 的誤差 中的任一個的抗體濃度或以 0. 1 至大約 0. 5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、
65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或 200mg/kg 體重 +/-10%的誤差中的任一個之間的抗體濃度，最優選以10mg/kg的抗體濃度。根據本發明的優選實施方案，抗CGRP拮抗劑抗體具有超過2、4、6、8、10、12、14、 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、
66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、 112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、 150、152，154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、 188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208 或 210 天 +/-1 天中的任一個，更優選超 過7、8、9、10、11或12個月中的任一個的體內半衰期。優選，抗CGRP拮抗劑抗體具有超過6天的體內半衰期。根據本發明的另外的優選實施方案，藥劑和/或抗CGRP拮抗劑抗體不產生中樞 神經系統和/或認知損害的作用。優選，藥劑和/或抗CGRP拮抗劑抗體不誘導下列的任 一個或多個健忘症、意識錯亂(confusion)、人格解體、感覺減退(hypesthesia)、異常思 維、牙關緊閉、眩暈、靜坐不能、情感淡漠(apa thy)、共濟失調、口周感覺異常、CNS刺激、情 緒不穩、欣快症、幻覺、敵對、感覺過敏、運動過度、張力減退、動作失調、性慾增強(libido increase)、躁狂反應、肌陣攣、神經痛、神經病、精神病、咬死(seizure)、談話異常、木僵、自 殺意念；頭暈、嗜睡、失眠、焦慮、震顫、抑鬱或感覺異常。最優選，藥劑和/或抗CGRP拮抗劑 抗體不誘導運動協調或注意力的損害。根據本發明的另外的實施方案，藥劑和/或抗CGRP拮抗劑抗體不產生呼吸器官、 腎或胃腸的損害。根據本發明的另外的實施方案，藥劑和/或抗CGRP拮抗劑抗體不產生身體和/或 心理依賴性的效應。優選，藥劑和/或抗CGRP拮抗劑抗體不顯示對阿片劑、苯並二氮革、苯 環利定(PCP)或N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體或CNS刺激物的親和力，或產生任何鎮 靜或欣快效應。在一個實施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體在施用後改善、控制中樞性痛覺、減少其 發病率或延遲其發展或進展。在另一個實施方案中，在相同的慢性疼痛的模型中，抗CGRP拮抗劑抗體的效應等 於和/或優於NSAIDS和/或阿片劑的效應。在一個實施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體在治 療頑固性疼痛群體中是有效的。根據本發明的另外的方面，提供了根據本發明的任何其他方面的用途或方法，其
21中將抗CGRP拮抗劑抗體與一種或多種另外的藥學活性化合物或試劑(優選用於治療慢性 疼痛的化合物或試劑)聯合，且分開施用、相繼施用或同時施用。優選，另外的試劑選自下 列的一種或多種⑴阿片樣物質鎮痛藥，例如嗎啡、海洛因、氫嗎啡酮、羥嗎啡酮、左啡諾、左洛啡 烷、美沙酮、麥啶、芬太尼、古柯鹼、可待因、雙氫可待因、羥考酮、氫可酮、右丙氧芬、納美芬、 烯丙嗎啡、納洛酮、納曲酮、丁丙諾啡、布託啡諾、納布啡或噴他佐辛；(ii)非類固醇抗炎藥物(NSAID)，例如阿司匹林、雙氯芬酸、二氟尼柳 (diflusinal)、依託度酸、芬布芬、非諾洛芬、氟苯柳、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、 酮咯酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、萘丁美酮、萘普生、奧沙普秦、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、 託美丁或佐美酸、環氧合酶-2(C0X-2)抑制劑、塞來考昔；羅非考昔；美洛昔康JTE-522 ； L-745,337 ；NS398 ；，或其藥學上可接受的鹽；(iii)巴比妥類鎮靜劑，例如異戊巴比妥、阿普比妥、仲丁比妥、布他比妥 (butabital)、甲苯比妥、美沙比妥、美索比妥、戊巴比要、苯巴比妥(phenobartital)、司可 巴比妥、他布比妥、硫戊巴比妥(theamylal)或硫噴妥或其藥學上可接受的鹽；(iv)具有鎮靜作用的苯並二氮革，例如利眠寧、氯氮$、地西泮、氟西泮、蘿拉西 泮、奧沙西泮、替馬西泮或三唑侖或其藥學上可接受的鹽；(ν)具有鎮靜作用的H1拮抗劑，例如苯海拉明、美吡拉敏、異丙嗪、氯非尼拉敏或氯 環力嗪或其藥學上可接受的鹽；(vi)鎮靜藥例如格魯米特、甲丙氨酯、甲喹酮或氯醛比林或其藥學上可接受的
^rt.；(vii)骨骼肌鬆弛藥，例如巴氯芬、卡立普多、氯唑沙宗、環苯扎林、美索巴莫或奧 芬那君(orphrenadine)或其藥學上可接受的鹽；(viii)NMDA受體拮抗劑，例如右美沙芬((+)_3_羥基_N_甲基嗎啡喃)或其代謝 產物右啡烷((+)-3_羥基-N-甲基嗎啡喃)、氯胺酮、美金剛、吡咯喹啉醌或順_4-(膦醯基 甲基)-2_哌啶羧酸或其藥學上可接受的鹽；(ix) α -腎上腺素能藥，例如多沙唑嗪、坦洛新、可樂定或4-氨基-6，7_ 二甲氧 基-2-(5-甲磺醯氨基-1，2，3，4-四氫異喹啉-2-基)-5-(2-吡啶基)喹唑啉；(χ)三環抗抑鬱藥，例如地昔帕明、丙米嗪、阿米替林(amytriptiline)或去甲替 林(nortriptiline)；(xi)抗驚厥藥，例如卡馬西平或丙戊酸鹽；(xii)速激肽(NK)拮抗劑，特別地NK-3、NK-2或NK-1拮抗劑，例如(α R， 9R)-7-[3，5-二 (三氟甲基)苄基]-8，9，10，11-四氫 _9_ 甲基 _5-(4_ 甲苯基)-7Η_[1， 4] 二氮芳辛並[2，l-g][l，7]萘啶-6-13-二酮(TAK-637)、5-[[(2R，3S)-2-[(lR)-l-[3， 5_ 二(三氟甲基)苯基]乙氧基-3-(4-氟苯基)-4-嗎啉基]甲基]-1，2-二氫-3H-1，2， 4-三唑-3-酮(MK-869)、拉奈匹坦、達匹坦或3-[[2_甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]甲 氨基]-2-苯基-哌啶(2S，3S)；(xiii)毒蕈鹼拮抗劑，例如奧昔布寧(oxybutin)、託特羅定、丙哌維林、曲司氯銨 (tropsium chloride)或達非那新；(xiv)C0X-2抑制劑，例如塞來考昔、羅非考昔或伐地考昔；
(XV)非選擇性COX抑制劑(優選具有GI保護作用)，例如硝基氟吡洛芬 (HCT-1026)；(xvi)煤焦油鎮痛藥(coal-tar analgesic)，特別地對乙醯氨基酚；(xvii)精神安定藥例如氟哌利多；(xviii)香草素受體激動劑(例如樹脂毒素(resinferatoxin))或拮抗劑(例如 辣椒平)；(xix) β -腎上腺素能藥例如普萘洛爾；(XX)局部麻醉劑，例如美西律；(xxi)皮質類固醇，例如地塞米松；(xxii) 5-羥色胺受體激動劑或拮抗劑；(xxiii)膽鹼能(菸鹼)鎮痛藥；(xxiv)曲馬朵(商標)；(XXV)PDEV抑制劑，例如西地那非、伐地那非或他達拉非(taladafil)；(xxvi) α _2_ δ配體例如加巴噴丁或普瑞巴林；(xxvii)大麻素(canabinoid)；禾口(xxviii)抗抑鬱藥，例如阿米替林(Elavil)、曲唑酮(Desyrel)和丙咪嗪 (Tofranil)或抗驚厥藥例如苯妥英(Dilantin)或卡馬西平(Tegretol)。根據本發明的另外的方面，提供了用於在個體中預防和/或治療慢性疼痛和/或 慢性疼痛的症狀或用於改善、控制慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀或減少其發病率或延遲 其發展或進展的藥物組合物，所述藥物組合物包含抗CGRP拮抗劑抗體和藥學上可接受的 載體和/或賦形劑，其中組合物經製備用於外周施用。根據本發明的另外的方面，提供了試劑盒，其包括(a)如上定義的藥物組合物；和(b)用於給個體外周施用有效量的所述藥物組合物以預防和/或治療慢性疼痛和 /或慢性疼痛的症狀或改善、控制慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀、減少其發病率或延遲其 發展或進展的說明書。試劑盒可包括一個或多個裝有本文中描述的抗CGRP拮抗劑抗體或多肽的容器以 及根據本發明的任何方法和用途進行使用的說明書。試劑盒還可包括基於鑑定個體是否患 有慢性疼痛或處於患慢性疼痛的風險中來選擇適合於治療的個體的描述。藥物組合物的外 周施用的說明書可包括關於用於期望的治療的劑量、給藥方案和施用途徑的信息。本發明的各方面的優選特徵在就實際情況加以必要的修正後同等地適用於每一 個其他方面。
實施例現參照下列意在舉例說明而不在限定本發明的實施例來描述本發明。參照抗體Gl (抗人CGRP人單克隆抗體)以及抗體G2 (抗大鼠CGRP小鼠單克隆抗 體)產生下列實施例和附圖(Wong HC等人Hybridomal2 :93-106(1993))。實施例1 嚙齒類動物癌症機械性疼痛模型的建立使用的腫瘤細胞是由Novartis Institute(London)捐贈的同基因MRMT-1大鼠乳腺癌細胞。將細胞培養在含有10%胎牛血清(FCS)、1% L-穀氨醯胺、2%青黴素/鏈黴素 (Gibco)的RPMI 1640 (Gibco)中。用0. 1 % w/v胰蛋白酶進行2次短暫的清洗以釋放附著 至培養瓶的細胞，然後用等體積的10%FCS進行淬滅，之後以1200rpm將溶液離心3分鐘。 清洗沉澱，將其重懸浮於Hanks培養基中，使用血細胞計數器計算細胞的濃度，用臺盼藍染 色來測定死亡MRMT-I細胞的數目。然後根據看到的細胞的數目通過稀釋溶液來獲得3 X IO3 個細胞的終濃度。將終溶液保持在冰上直至注射的時間。將在手術時稱重接近170g的雄性Sprague-Dawley大鼠用於產生癌症模型。使用 氟烷或異氟烷(1. 5-2% )66% N2O和33% O2在大鼠中誘導麻醉，在適當的區域上剃除腿上 的毛髮，然後用氯己定(Animalcare Ltd, UK.)消毒。產生小切口以暴露脛骨遠端的前內側 表面。使用0. 7mm牙鑽在骨膜中鑽洞，通過該洞將2cm聚乙烯管插入脛骨的髓內腔lcm。通 過使用Hamilton注射器，將預先製備的10 μ 1 3 X IO3個MRMT-I細胞通過管注射至腔中。 然後取出管，使用骨修復材料(IRM，Dentsply USA)塞住洞。然後用0. 9%鹽水衝洗傷口， 且用金屬夾閉合傷口。使用相同的方法(但用10μ 1單獨的Hank' s溶液進行注射)對假 手術動物(sham animal)進行手術。將動物置於溫控恢復箱(thermoregulated recovery box)中直至能夠將它們放回它們居住的籠子的時刻。實施例2 嚙齒類動物抗CGRP抗體G2在癌症疼痛模型中的評估對軀體同側和對側的後爪的蹠面使用von Frey細絲(North Coast Medical Inc.，USA)以測試針對機械刺激的行為。將大鼠置於具有網格底板(meshfloor)的Perspex 小室中並且讓其適應環境10分鐘。在同側和對側之間交替地對各後爪使用各von Frey 10 次，每次持續2至3秒。使用的Von Frey細絲具有1、5、9和15g的彎曲力，並且在不斷加 大的von Frey力之間間隔5分鐘的時間。疼痛應答(nocifensive response)(抬起)定 義為後爪的活躍縮足，並且記錄在各von Frey上各爪抬起的次數(最多10次)，並且將其 表示為百分比應答。評估嚙齒類動物抗CGRP抗體G2在減弱對多種靜態機械、冷和整合的刺激的超敏 反應中的功效以及該已驗證的癌症誘導的骨痛的模型中背景基線疼痛行為。測量的應答被 標準鎮痛治療例如嗎啡和加巴噴丁減弱。所有測量都由相同的科學家以盲測方式(對化合 物/對照的身份和對動物的處理不知情)進行。在第9天以10mg/kg IV提供G2，在處理後2小時，然後在第10、11、12天，和然後 在第14至18天檢測大鼠(圖1)。G2對應對更高強度的機械性刺激的行為應答具有顯著的效應。針對von Frey 8g 的縮足頻率在注射後2小時降低，並且在第11和12天(注射後第2和3天，分別地ρ = 0.0164和0.0311)顯著低於在媒介物處理組中看到的縮足頻率。事實上，G2處理的動物現 具有與基線值相似的疼痛評分。到第14天(G2注射後第5天)，在G2與媒介物處理組之間 沒有可辨別的差異。到MRMT-I注射後第18天(處理後第9天)，兩組都達到相似水平的對 von Frey 8g的超敏反應。對von Frey 15g的超敏反應的相似的逆轉也很明顯。與媒介物處理組相比，對 von Frey 15g的超敏反應的降低在注射後2小時是明顯的，在藥物施用後第2和3天觀察 到顯著性(分別地ρ = 0. 02和0. 03)。到G2施用後6天，降低消失，並且到MRMT-I注射後 18天，兩個組現達到相似的最大縮足頻率(圖2)。
結果表明G2減少了轉移性骨癌大鼠模型中經歷的有害疼痛。實施例3 用於運動損傷的轉棒測試(rota rod test)骨癌疼痛模型中測試的另一個終點是步行(ambulation)(通過轉棒法)。該測試 通過比較抗體處理的動物與對照對物(各自在相同的條件下經歷相同的測試)獲得運動損 傷的測量。轉棒測試由4個被凸緣分開的滾筒(rotateable drum)(用電機驅動滾筒加速) (Ugo Basile, Comerio, VA, Italy)組成。對於給定的試驗，將大鼠置於轉棒上，旋轉速度在 2分鐘內從4rpm加速至16rpm。最大進行時間通常設置為120秒。各動物在手術後通常每 天接受3個試驗(1小時的間隔)，進行連續數天。跌下轉棒的潛伏期表示為3次試驗的平 均值。在強迫步行期間從轉棒跌下的潛伏期方面，抗體G2組與媒介物組之間沒有發現 差異(圖3)。這表明G2不損害參與運動協調或注意力的途徑，並且表明不存在由抗體產生 的CNS副作用。實施例4:結合測定進行結合測定以測量抗CGRP抗體Gl和G2在SK_N_MC細胞中阻斷人α -CGRP與 CGRPl-受體的結合的IC5(I。繪製劑量響應曲線，使用公式=Ki = IC5tl/(1+([配體]/Kd)確定 Ki值；圖4，其中人α -CGRP對存在於SK-N-MC細胞中的CGRPl-受體的平衡解離常數Kd = SpM0將報導的IC5tl值(就IgG分子而言)轉換成結合部位以便其可與通過Biacore測定的 親和力(Kd)相比較，以低水平(通常100個響應單位)將N-生物素化的人和大鼠α -CGRP 捕獲在單獨的流動池上以提供反應表面，同時未修飾的流動池用作參照通道。在晶片表面 上滴定G1。根據動力學速率常數的商(KD = k。ff/k。n)推導出結合親合力。參見表1。
G2小鼠Mab 7Ε9GlKD (ηΜ), α-Hu171. 00. 04IC50(ηΜ) α -Hu372. 61. 2KD (ηΜ) α-大鼠1. 0581. 2表 1晶片上的N-生
物素-CGRP eC k n(1/Wls0 koff(1/s) T1/2(h) K0 (nM)
α-Λ 『............251.86χ1037.80x1 (Γ5 6ΒΤδ^
α-Λ37χ 10s3.63 x10 s S.300.063
P-A374.51x10s6,98 χ ItT5 2.760,155
Χ-大鼠25508 χ 104618x10^ 3 121 22
α-大鼠371,55 XlO53,99x10"4 04&2 57
P-大鼠STr6 16χ1057.85 χ σ5 2 4 0.152表2Gl對於人α禾口 β CGRP的結合親和力相等(分別地Kd = 0. 155和0. 152nM)。G2
25對大鼠α和β CGRP的結合親和力相等(分別地16和17ηΜ)。此外，對於α -CGRP，人中的 Gl結合親和力是大鼠的40倍(分別地Kd = 0. 042和1. 22ηΜ)，並且對於β _CGRP，G1結合 親和力在人和大鼠是等效的(分別地Kd = O. 155和0. 152nM)。抗體Gl還顯示了良好的跨 物種選擇性並且以與抗體G2相同的親和力(大約1.2nM)結合大鼠α-CGRP(表2)。
Gl以高親和力結合人和食蟹猴的α -和β -CGRP (分別地Kd = 63和155pM)。Gl 展示對於人/食蟹猴CGRP的物種選擇性並且以更低的親和力結合來自其他物種例如大鼠 的 α -禾口 β -CGRP (分別地 Kd = 2. 57ηΜ 和 152ρΜ)。
實施例5 抗CGRP的體內半衰期大鼠中抗CGRP的血清測量(圖5)顯示半衰期為大約7天。由於具有大約150，000 的分子量，抗體被限制在外周，圖5a，5b，即其不能進入中樞神經系統或穿過血腦屏障。實施例6 抗CGRP抗體的選擇性我們通過使用Biacore晶片「探測」mAb+肽的預混合的複合物的游離濃度來確定 抗體Gl對人或大鼠CGRP的特異性。如所預期的，當我們將抗體Gl與人或大鼠CGRP預溫 育時，響應被完全阻斷。相比之下，將Gl與過量的胰澱素(amylin)、降鈣素或腎上腺髓質素 預溫育與對照響應(Gl加緩衝液)相當，這表明Gl不與這些肽形成複合物(圖7)。實施例7 抗體Gl結合表位的鑑定使用標準Biacore運行緩衝液(HBS-P)，在配備有鏈黴抗生物素蛋白包被(SA)的 傳感器晶片的Biacore 3000 系統(Biacore AB, Uppsala, Sweden)上於25°C下進行相互 作用分析。首先我們確認N-生物素化的25-37人α-CGRP片段以與全長N-生物素化的人 α -CGRP相同的親和力結合抗體G1。然後將位點27_37之間的各胺基酸逐個地突變成丙氨 酸，並且探測與野生型片段相比親和力的倍數損失。以低水平(通常100個響應單位)將 N-生物素化的片段捕獲在單獨的流動池上以提供反應表面，同時未修飾的流動池用作參照 通道。產生純化的抗體Gl的Fab片段。使用IyM作為2倍稀釋系列的最高濃度，在晶片 上滴定Fab片段。以100 μ 1/分鐘監控結合相和解離相，分別進行1分鐘和5分鐘。使用 35%乙醇+25mM Na0H+0. 5M NaCl的混合物再生表面。丙氨酸掃描結果顯示，抗體Gl結合人α -CGRP的C末端區域，特別地殘基25至 37，並且顯示對可定義為表位並且位於最後5個C末端胺基酸(即，G33A至F37A)中的區 域的特異性結合(即當特異性結合區域被突變時，親和力喪失顯著增加)。G33A和F37A突 變引起親和力的最大變化(圖6)。C末端Phe對於抗體Gl對CGRP(對比相關肽和基因家 族成員)的選擇性是非常重要的(圖8)。因此，在一個實施方案中，本發明提供了特異性結合由CGRP的胺基酸G33至F37 確定的表位的抗CGRP拮抗劑抗體。抗CGRP拮抗劑抗體可特異性結合由胺基酸序列GSKAF 確定的表位，更特別地結合確定為GXXXF的CGRP的表位，其中X可以是任何胺基酸，G33和 F37是最重要的表位殘基(對於確定抗CGRP拮抗劑抗體的高親和力結合來說)。實施例8 身體或心理依賴性的指標的分析抗體Gl和抗體G2都不顯示CNS滲透。此外，與對照動物相比較，以之前實施例中 使用的水平接受任一抗體的動物(大鼠)的長期觀察未顯示不利的CNS事件例如鎮靜或興 奮/欣快行為。這些觀察表明，不存在對於抗體的依賴性危險，從而顯示抗體的顯著提高的 安全性(優於目前疼痛治療中使用的現有阿片劑)。
實施例9 :胃腸不良作用的指標的分析使用抗體G2進行的1個月的體內大鼠研究和使用抗體Gl進行的1周對比研究 表明，與對照動物相比較，在行為、食物攝入、糞便產生或組織病理學方面未觀察到不良的 胃腸作用。這些觀察顯示不存在對於抗體的胃腸危險，從而顯示抗體的顯著提高的安全性 (優於目前疼痛治療中使用的現有NSAID)。實施例10 ；作為抗CGRP拮抗劑抗體的Gl和G2CGRP生物學活性的已知後果是當體內遞送時產生神經源性潮紅。Gl和G2經證明 為抗CGRP拮抗劑抗體，因為它們阻止了體內神經源性潮紅的發展。通過使用神經源性皮膚潮紅大鼠模型，就Gl在體內阻斷CGRP效應的能力測試Gl 的功效。電刺激大鼠中的隱神經，從而引起CGRP從神經末梢釋放和導致血管舒張，所得的 血流變化可使用雷射Dopler法來測量。血流參數的變化表示為曲線下的面積(AUC，任意Dopler通量單位乘以時間的變 化)。CGRP受體拮抗劑CGRP8_37(400nmOl/kg，i.v.)用作陽性對照以驗證模型的特異性(數 據未顯示)。為了確定在給藥前Gl對各動物的效應，用兩次隱神經刺激(每次間隔30分 鍾)建立針對刺激的基線血流響應。在第二次刺激的血流響應已回到基線水平後(刺激後 大約10分鐘)，用Gl處理大鼠，並且以30分鐘的間隔進行另外的4次刺激。結果(圖9)顯示在媒介物處理的動物中，血流響應沒有顯著變化，但用Gl處理的 大鼠顯示血流響應的顯著減少(對於10mg/kg和lmg/kg的處理，分別始於給藥後90和120 分鐘)。使用D2獲得相似的活性。此外，在另外的神經源性潮紅和血管舒張模型測試中，Gl 在IV給藥後7天顯示顯著的效應(在隱神經刺激模型中，預測的ED5(l = 6ug/ml)。來自進 行的測試的結論是，Gl和G2顯示抗CGRP拮抗劑活性。也在出版物，ZellerJ 等人 Br J Pharmacol. 2008Dec ； 155 (7) 1093-103. Epub 2008S印8中顯示了抗體的相似的CGRP功能阻斷能力。下面提供可用於實施本發明的抗體序列。抗體序列抗體Gl重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO!)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVAEIRSESDASATHYAEAVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYGLAIQNYffGQGTLVTVSS抗體Gl輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO 2)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYLGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIK抗體GlCDR Hl (擴展的 CDR) (SEQ ID NO 3)GFTFSNYffIS抗體GlCDR H2 (擴展的 CDR) (SEQ ID NO 4)EIRSESDASATHYAEAVKG抗體GlCDR H3 (SEQ ID NO 5)YFDYG LAIQNY抗體GlCDR Ll (SEQ ID NO 6)KAS KRVTTYVS
抗體GlCDR L2 (SEQ ID NO 7)GASNRYL抗體GlCDR L3 (SEQ ID NO 8)SQSYNYPYT抗體Gl重鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO 9)GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCT GCTTCCGGTTTCACCTTCTCCAACTACTGGATCTCCTGGGTTCGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGC TGAAATCCGTTCCGAATCCGACGCGTCCGCTACCCATTACGCTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCCCGTG ACAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCCTGGCT TACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTACTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCC抗體Gl輕鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO=IO)GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTCCCCAGGTGAACGTGCTACCCTGTCCTG CAAAGCTTCCAAACGGGTTACCACCTACGTTTCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCTGCTGATC TACGGTGCTTCCAACCGTTACCTCGGTATCCCAGCTCGTTTCTCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTG ACCATCTCCTCCCTGGAACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCCTACAACTACCCCTACACCTTC GGTCAGGGTACCAAACTGGAAATCAAA杭體Gi 重 車Φ長杭體序歹U (Hma^icψm^mmmm iSG2) (seq ID NO 11)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVAEIRSESDASATHYAEAVKGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYGLAIQNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKC CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR WSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK抗體Gl輕鏈全長抗體胺基酸序列(SEQ ID NO 12)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYLGIPARFSGSGSGT DFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC抗體Gl重鏈全長抗體核苷酸序列(包括如本文中所描述的修飾的1^2) (SEQ ID NO 13)GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCT GCTTCCGGTTTCACCTTCTCCAACTACTGGATCTCCTGGGTTCGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGC TGAAATCCGTTCCGAATCCGACGCGTCCGCTACCCATTACGCTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCCCGTG ACAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCCTGGCT TACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTACTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCCGCCTCCACCAA GGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCA AGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCT GTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTA CACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTC
28CACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATC TCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGT GGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCG TGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCC AGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCAGAGA GGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGG AGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTAT TCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCA CAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAA抗體Gl輕鏈全長抗體核苷酸序列(SEQ ID NO 14)GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTCCCCAGGTGAACGTGCTACCCTGTCCTGC AAAGCTTCCAAACGGGTTACCACCTACGTTTCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCTGCTGATCTA CGGTGCTTCCAACCGTTACCTCGGTATCCCAGCTCGTTTCTCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTGACCA TCTCCTCCCTGGAACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCCTACAACTACCCCTACACCTTCGGTCAG GGTACCAAACTGGAAATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCGCGCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATA ACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGC ACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTC TCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA人和大鼠CGRP(人 α -CGRP(SEQ ID NO 15)；人 β -CGRP(SEQ ID NO 16)；大鼠 α -CGRP(SEQ ID NO 17)；和大鼠 β -CGRP(SEQ ID NO 18))的胺基酸序列比較NH2-AC 麗 TATCVTHRLAGLLSRSGGWK 漏 NFVPTNVGSKAF-C0NH2 (SEQ ID NO 15)
NH2-AC 騰 TATCVTHRLAGLLSRSGG _ VK 謹 NFVPTNVGSKAF_CONH2 (SEQ ID NO 16)NH2- 1 C _ TATCVTHRLAGLLSRSGGVVK 誦 NFVPTNVGS 隱 AF-CONH2 (SEQ ID NO : 17)NH2- ■ C 羅 TATCVTHRLAGLLSRSGGffK 議 NFVPTNVGSKAF_CONH2 (SEQ ID NO 18)抗體G2重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO: 19)EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSSVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKAT LTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAKGGNDGYWGQGTTLTVSS抗體G2輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO 20)EIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSIYLHWYQQKPGFSPKVLIYRASNLASGVPARFSGSGSG TSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSTIPFTFGSGTKLEIK抗體G2CDR Hl (擴展的 CDR) (SEQ ID NO :21)SSVMH抗體G2CDR H2 (擴展的 CDR) (SEQ ID NO :22)YINPYNDGTKYNEKFKG抗體G2CDR H3 (SEQ ID NO :23)GGNDGY抗體G2CDR Ll (SEQ ID NO :24)
SASSSISSIYLH抗體G2CDR L2 (SEQ ID NO 25)RASNLAS抗體G2CDR L3 (SEQ ID NO 26)QQGSTIPFT抗體G2重鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO 27)GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAG GCTTCTGGATACACATTCACTAGCTCTGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGG ATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAAT CCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAAAGGGGGT AACGATGGCTACTGGGGCCAAGGCACTACTCTCACAGTCTCCTCA抗體G2輕鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO 28)GAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTG TAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCATTTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAAGTCTTG ATTTATAGGGCATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCT CTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTACTATACCATTCACG TTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA杭體G2重鏈Φ長杭彳本M某酸序歹Il (不句,括Fc結構域)(SEQ ID NO 29)EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSSVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKAT LTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAKGGNDGYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKG YFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRD抗體G2輕鏈全長抗體胺基酸序列(SEQ ID NO 30)EIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSIYLHWYQQKPGFSPKVLIYRASNLASGVPARFSGSGSG TSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSTIPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPRDIN VKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC抗體G2重鏈全長抗體核苷酸序列(不包括Fc結構域)(SEQ ID NO 31)GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAG GCTTCTGGATACACATTCACTAGCTCTGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGG ATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAAT CCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAAAGGGGGT AACGATGGCTACTGGGGCCAAGGCACTACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACT GGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAG TGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTAC ACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGC CAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGAT抗體G2輕鏈全長抗體核苷酸序列(SEQ ID NO 32)GAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGT AGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCATTTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAAGTCTTGAT TTATAGGGCATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTACTATACCATTCACGTTCGGC TCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTT AACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAGAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTG ATGGCAGTGAACGACAAAATGGTGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGC AGCACCCTCACATTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAAC TTCACCCATCGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAA
權利要求
抗CGRP拮抗劑抗體用於製造藥劑的用途，所述藥劑用於預防和/或治療慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀。
2.權利要求1的用途，其中所述藥劑經製備用於外周施用。
3.權利要求1的用途，其中外周施用所述藥劑。
4.權利要求1至3的任一項的用途，其中所述藥劑經製備用於口服、舌下、通過吸入、透 皮、皮下、靜脈內、動脈內、關節內、關節周、局域和/或肌內施用。
5.權利要求4的用途，其中所述藥劑經製備用於皮下或靜脈內施用。
6.前述權利要求的任一項的用途，其中抗CGRP拮抗劑抗體在施用後在外周起作用。
7.前述權利要求的任一項的用途，其中慢性疼痛包括慢性傷害性疼痛、慢性神經性疼 痛、慢性炎性疼痛、纖維肌痛、爆發性疼痛和持續性痛的一種或多種。
8.權利要求7的用途，其中慢性疼痛還包括痛覺過敏、異常性疼痛、中樞致敏、外周致 敏、抑制解除和增強的易化的一種或多種。
9.前述權利要求的任一項的用途，其中慢性疼痛是癌症疼痛。
10.權利要求9的用途，其中癌症疼痛是由下列病況的一種或多種引起的疼痛腺組 織中的腺癌、器官的胚性組織中的母細胞瘤、上皮組織中的癌、形成血細胞的組織中的白血 病、淋巴組織中的淋巴瘤、骨髓中的骨髓瘤、結締或支持性組織中的肉瘤、腎上腺癌、AIDS 相關淋巴瘤、貧血、膀胱癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、類癌瘤、宮頸癌、化學療法、結腸癌、血細胞 減少、子宮內膜癌、食管癌、胃癌、頭部癌症、頸癌、肝膽管癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴 瘤、何杰金氏病、淋巴瘤、非何杰金氏病、神經系統腫瘤、口癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直 腸癌、皮膚癌、胃癌症、睪丸癌症、甲狀腺癌、尿道癌、骨癌、結締組織的肉瘤癌、骨組織的癌 症、造血細胞的癌症、骨髓癌、多發性骨髓瘤、白血病、原發性或繼發性骨癌、轉移至骨的腫 瘤、浸潤神經和空腔臟器的腫瘤和鄰近神經結構的腫瘤。
11.前述權利要求的任一項的用途，其中抗CGRP拮抗劑抗體(a)結合CGRP ；(b)阻斷CGRP結合其受體；(c)阻斷或減少CGRP受體的激活；(d)抑制、阻斷、壓制或降低CGRP的生物學活性；(e)增加CGRP的清除；和/或(g)抑制CGRP的合成、產生或釋放。
12.前述權利要求的任一項的用途，其中抗CGRP拮抗劑抗體(i)是人抗體，( )是人源化的抗體，(iii)是單克隆抗體，(iv)以50nM或更小的Kd結合CGRP(如在37°C下通過表面等離子共振術測量的)；和/或(ν)具有至少7天的體內半衰期。
13.前述權利要求的任一項的用途，其中抗CGRP拮抗劑抗體特異性結合CGRP的C末端 區域。
14.權利要求12的用途，其中抗CGRP拮抗劑抗體特異性識別由序列GSKAF確定的表位。
15.前述權利要求的任一項的用途，其中抗CGRP抗體包含在胺基酸序列上與SEQID NO :1或19至少90%同一的VH結構域。
16.前述權利要求的任一項的用途，其中抗CGRP抗體包含在胺基酸序列上與SEQID NO 2或20至少90%同一的VL結構域。
17.權利要求16的用途，其中抗CGRP抗體還包含在胺基酸序列上與SEQID NO :1或 19至少90%同一的VH結構域。
18.權利要求1至14的任一項的用途，其中抗CGRP抗體包含至少一個選自下列的CDR (a).如SEQ ID NO 3 或 21 中所示的 CDR Hl ；(b)·如 SEQ ID NO 4 或 22 中所示的 CDR H2 ；(c).如SEQ ID NO 5 或 23 中所示的 CDR H3 ；(d).如SEQ ID NO 6 或 24 中所示的 CDR Ll ；(e)如SEQ ID NO 7 或 25 中所示的 CDR L2 ；(f).如SEQ ID NO 8 或 26 中所示的 CDR L3 ；禾口(g).Ll、L2和H2的變體。
19.權利要求1至14的任一項的用途，其中抗CGRP抗體包含在胺基酸序列上與SEQID NO :1至少90%同一的VH結構域和在胺基酸序列上與SEQ ID NO :2至少90%同一的VL結 構域。
20.權利要求1至14的任一項的用途，其中抗CGRP抗體包含由具有ATCC登錄號 PTA-6867的表達載體產生的重鏈。
21.權利要求1至14的任一項的用途，其中抗CGRP抗體包含由具有ATCC登錄號 PTA-6866的表達載體產生的輕鏈。
22.權利要求1至14的任一項的用途，其中抗CGRP抗體由具有ATCC登錄號PTA-6867 和PTA-6866的表達載體產生。
23.前述權利要求的任一項的用途，其中所述藥劑經製備用於通過皮下或靜脈內注射 而外周施用，每個月施用1、2、3或4次之間。
24.前述權利要求的任一項的用途，其中所述藥劑經製備用於以5至100mg/ml的抗體 濃度外周施用。
25.前述權利要求的任一項的用途，其中所述藥劑經製備用於以1至100mg/kg體重的 抗體濃度外周施用。
26.前述權利要求的任一項的用途，其中所述藥劑不產生運動協調或注意力的CNS損傷。
27.前述權利要求的任一項的用途，其中不通過中樞、脊柱或鞘內途徑施用抗CGRP拮 抗劑抗體。
28.前述權利要求的任一項的用途，其中抗CGRP拮抗劑抗體不是中樞、脊柱或鞘內滲 透分子。
29.前述權利要求的任一項的用途，其中將抗CGRP抗體與一種或多種另外的藥學活性 化合物聯合，且分開施用、相繼施用或同時施用。
30.權利要求29的用途，其中所述一種或多種另外的藥學活性化合物選自⑴阿片樣物質鎮痛藥，例如嗎啡、海洛因、氫嗎啡酮、羥嗎啡酮、左啡諾、左洛啡烷、美 沙酮、麥啶、芬太尼、古柯鹼、可待因、雙氫可待因、羥考酮、氫可酮、右丙氧芬、納美芬、烯丙 嗎啡、納洛酮、納曲酮、丁丙諾啡、布託啡諾、納布啡或噴他佐辛；( )非類固醇抗炎藥物(NSAID)，例如阿司匹林、雙氯芬酸、二氟尼柳、依託度酸、芬 布芬、非諾洛芬、氟苯柳、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸、甲芬那 酸、萘丁美酮、萘普生、奧沙普秦、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、託美丁或佐美酸，或其藥學上 可接受的鹽；(iii)巴比妥類鎮靜劑，例如異戊巴比妥、阿普比妥、仲丁比妥、布他比妥、甲苯比妥、美 沙比妥、美索比妥、戊巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥、他布比妥、硫戊巴比妥或硫噴妥或其 藥學上可接受的鹽；(iv)具有鎮靜作用的苯並二氮$，例如利眠寧、氯氮革、地西泮、氟西泮、蘿拉西泮、奧 沙西泮、替馬西泮或三唑侖或其藥學上可接受的鹽；(ν)具有鎮靜作用的H1拮抗劑，例如苯海拉明、美吡拉敏、異丙嗪、氯非尼拉敏或氯環力 嗪或其藥學上可接受的鹽；(vi)鎮靜藥例如格魯米特、甲丙氨酯、甲喹酮或氯醛比林或其藥學上可接受的鹽；(vii)骨骼肌鬆弛藥，例如巴氯芬、卡立普多、氯唑沙宗、環苯扎林、美索巴莫或奧芬那 君或其藥學上可接受的鹽；(viii)NMDA受體拮抗劑，例如右美沙芬((+)-3_羥基-N-甲基嗎啡喃)或其代謝產 物右啡烷((+)-3_羥基-N-甲基嗎啡喃)、氯胺酮、美金剛、吡咯喹啉醌或順_4-(膦醯基甲 基)~2~哌啶羧酸或其藥學上可接受的鹽；(ix)α-腎上腺素能藥，例如多沙唑嗪、坦洛新、可樂定或4-氨基-6，7-二甲氧 基-2-(5-甲磺醯氨基-1，2，3，4-四氫異喹啉-2-基)-5-(2-吡啶基)喹唑啉；(x)三環抗抑鬱藥，例如地昔帕明、丙米嗪、阿米替林或去甲替林；(xi)抗驚厥藥，例如卡馬西平或丙戊酸鹽；(xii)速激肽(NK)拮抗劑，特別地ΝΚ-3、ΝΚ-2或NK-I拮抗劑，例如(αR，9R) _7_[3， 5_ 二(三氟甲基)苄基]-8，9，10，11-四氫-9-甲基-5-(4-甲苯基)-7Η_[1，4] 二氮芳辛 並[2,1-g] [1,7]萘啶-6-13-二酮(TAK-637)、5-[[(2R，3S)-2-[(lR)-l-[3，5-二(三氟甲 基)苯基]乙氧基-3-(4-氟苯基)-4-嗎啉基]甲基]-1，2-二氫-3H-1，2，4-三唑-3-酮 (MK-869)、拉奈匹坦、達匹坦或3-[[2_甲氧基_5-(三氟甲氧基)苯基]甲氨基]_2_苯 基-哌啶(2S，3S)；(xiii)毒蕈鹼拮抗劑，例如奧昔布寧、託特羅定、丙哌維林、曲司氯銨或達非那新；(xiv)COX-2抑制劑，例如塞來考昔、羅非考昔或伐地考昔；(xv)非選擇性COX抑制劑(優選具有GI保護作用)，例如硝基氟吡洛芬(HCT-1026)；(xvi)煤焦油鎮痛藥，特別地對乙醯氨基酚；(xvii)精神安定藥例如氟哌利多；(xviii)香草素受體激動劑(例如樹脂毒素)或拮抗劑(例如辣椒平)；(xix)β -腎上腺素能藥例如普萘洛爾；(XX)局部麻醉劑，例如美西律；(xxi)皮質類固醇，例如地塞米松；(xxii)5-羥色胺受體激動劑或拮抗劑；(xxiii)膽鹼能(菸鹼)鎮痛藥；(xxiv)曲馬朵(商標)； (XXV) PDEV抑制劑，例如西地那非、伐地那非或他達拉非；(xxvi)α -2- δ配體例如加巴噴丁或普瑞巴林；和(xxvii)大麻素。
31.治療和/或預防個體中的慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀的方法，所述方法包括給 所述個體外周施用治療有效量的抗CGRP拮抗劑抗體。
32.用於治療和/或預防個體中的慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀的藥物組合物，其包 含抗CGRP拮抗劑抗體和藥學上可接受的載體，其中所述組合物經製備用於外周施用。
33.一種試劑盒，其包括(a)權利要求32的藥物組合物，和(b)給個體外周施用治療有效量的所述藥物組合物以治療和/或預防慢性疼痛和/或 慢性疼痛的症狀的說明書。
全文摘要
本發明涉及用於預防和/或治療慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀的抗CGRP抗體，且涉及使用抗CGRP抗體治療和/或預防慢性疼痛和/或慢性疼痛的症狀的方法。
文檔編號C07K16/26GK101959528SQ200980107603
公開日2011年1月26日 申請日期2009年3月3日 優先權日2008年3月4日
發明者D·L·謝爾頓, I·馬欽, J·澤勒, K·T·波爾森, L·克拉蒂尼 申請人:輝瑞有限公司