雙酶法製備分子量可控的藥用右旋糖酐的製作方法
2023-12-05 19:13:31
專利名稱：雙酶法製備分子量可控的藥用右旋糖酐的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物製藥與酶工程領域，具體地說是採用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶聯合製備分子量可控的藥用右旋糖酐的工藝。
背景技術：
右旋糖酐(Dextran)是若干葡聚糖脫水形成的聚合物，主要由葡萄糖α-1，6糖苷鍵連接而成，由腸膜狀明串菌株(Leuconstoc mesenteriodes)產生的右旋糖酐鹿糖酶(Dextransucrase ；E. C. 2. 4. I. 5)合成的右旋糖酐含有95%的α -I, 6糖苷鍵，同時含有少量其它糖苷鍵的分支結構。因其具有安全、無毒等多種優點，已被廣泛應用於醫藥、工業、食品等多個領域。高分子右旋糖酐可以被用來作為藥物載體，以及常用的凝膠色譜填料。臨床上常用的有中分子右旋糖酐70、右旋糖酐40及右旋糖酐20，主要用作血漿代用品，用於出血性休克、創傷性休克及燒傷性休克等。重均分子量6-8 kDa的右旋糖酐常被用於製成右旋糖酐鐵，用於治療嚴重的貧血症。重均分子量低於5 kDa的右旋糖酐常被硫酸化，用於抗血栓。小分子右旋糖酐I (Dextran I, Mw 1000 Da)近來被發現,可以避免由於右旋糖酐70及40而引起的人體自身免疫的變態反應。分子量更小的低聚異麥芽糖則被用於益生
J Li ο目前國內多採用發酵方法製備高分子右旋糖酐，再利用鹽酸水解得到不同分子量的藥用右旋糖酐，由於生產的右旋糖酐含有大量的氯化物嚴重影響了右旋糖酐的質量和品質，在臨床使用過程中常出現過敏反應，可引起皮膚反應、嚴重的呼吸和循環衰竭，甚至導致死亡。同時由於是酸催化水解，水解過程無序，得到的產品分子量分布不集中，影響產品的質量。另外，由於利用鹽酸水解需要高溫高酸等惡劣條件，不利於環保、低碳。而採用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶酶法製備藥用級右旋糖酐，就能減少氯化物對產品質量的影響，同時由於酶對底物的特異性水解，能得到分子量分布集中的高品質右旋糖酐，產品達到高產率。此外，酶催化降解反應條件溫和、能耗低，從而實現了中、小分子量多糖生產工藝的綠色、環保、低碳的目標。目前國外已有學者直接採用分別產右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的菌株發酵製備藥用右旋糖酐，但是由於直接發酵，菌株產生的代謝物種類繁雜，不利於產品的分離純化，同時由於產率低，不利於產業化生產。另外也有學者採用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶雙酶聯合製備藥用糖酐，但是由於產率較低(36%)，從而不利於產業化生產。
發明內容
本發明為了避免現有技術存在的不足之處，提供一種採用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶雙酶聯合製備分子量可控的藥用右旋糖酐的方法，該方法不僅綠色、環保、低成本、簡便；而且使製備獲得的右旋糖酐分子量可控。本發明解決技術問題採用如下方案雙酶法製備分子量可控的藥用右旋糖酐，該方法按如下步驟進行(I)右旋糖酐蔗糖酶合成高分子右旋糖酐，、
採用pH 5.4 O. 02 mol/L醋酸-醋酸鈉緩衝液配製終體積濃度12%的蔗糖溶液1000 mL，所述緩衝液中添加0.05g/L CaCl2 ;將配置好的蔗糖溶液置於25°C保溫10 min後，加入右旋糖酐蔗糖酶使其終濃度為2 IU/mL，置於25°C恆溫、120r/min反應4小時，再置於25°C條件下保溫20小時；然後終止右旋糖酐蔗糖酶的催化反應，將反應液用於下一步右旋糖酐酶的催化水解；所述右旋糖酐蔗糖酶的一個酶活IU是指，以pH5. 4的醋酸-醋酸鈣緩衝液配製終體積濃度為10%的蔗糖溶液為底物；所述緩衝液中含醋酸鈣0.05 8/1、冰醋酸0.02 mol/L ;25°C條件下，每毫升底物反應液中每小時催化蔗糖產生O. I mg果糖所需要的酶量；(2)右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐
向步驟I)經右旋糖酐蔗糖酶催化合成的反應液中加入右旋糖酐酶使其終濃度為O. 23 U/mL，置於35°C條件下攪拌反應160min_180 min，然後終止酶促反應；所述右旋糖酐酶的一個酶活U是指，以pH 5. O的醋酸鹽緩衝液配製的終體積濃度為3%的重均分子量為70 kDa的右旋糖酐溶液為底物，在35°C條件下，每分鐘產生I μ mol還原糖所需要的右旋糖酐酶量；(3)去除雜質將上述步驟2)經右旋糖酐酶催化水解的反應液置於80°C保溫3小時，隨後採用多層紗布過濾雜質，重複過濾兩次，隨後採用中速定性濾紙過濾上清液；然後再將上述過濾後的上清液加熱煮沸15 min，待上清液冷卻後，再利用中速定性濾紙過濾去除雜質，清澈無色的濾液用於下一步乙醇分級醇沉；(4)乙醇分級醇沉及真空乾燥採用4級劃分，一級劃分乙醇體積濃度為39%，在攪拌裝置下，向步驟(3)所得濾液中緩慢加入體積濃度95%乙醇，定時測定濾液中乙醇體積濃度，當乙醇體積濃度達到39%時停止醇沉，將濾液置於40度保溫22小時，然後倒出上清液，再向沉澱中加入適量乙醇取出大分子雜質；二級劃分乙醇體積濃度為43%，向一級劃分後的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達43%時，停止醇沉，將醇沉好的濾液置於34度保溫22小時，然後倒出上清液，再向沉澱中加入乙醇獲得右旋糖酐70產品；三級劃分乙醇濃度為47%，向二級劃分後的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達47%時，停止醇沉，將醇沉好的慮液置於40度保溫12小時，倒出上清液，再向沉澱中加入乙醇獲得右旋糖酐40產品；四級劃分乙醇濃度為57%，向三級劃分後的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達57%時，停止醇沉，將醇沉好的慮液置於常溫，2小時後，再加入乙醇獲得右旋糖酐20產品；將上述乙醇劃分所得到的產品分別置於80°C真空乾燥箱中乾燥4小時，去除產品中殘留的乙醇及水分，即得到相應的右旋糖酐產品。本發明優選使用申請號為200710134765. 4的專利公開文本中的重組右旋糖酐蔗糖酶，該酶具有高酶活性，平均酶活達到40IU/mL，能夠高效的催化蔗糖轉化為右旋糖酐，蔗糖的轉化率高達95%以上；同時本發明優選使用申請號為201110117071.6的專利公開文本中的右旋糖酐酶，該酶催化水解高分子右旋糖酐具有較強的底物特異性，該酶在催化高分子右旋糖酐時，能夠優先催化降解分子量較大的糖酐，從而實現中小分子右旋糖酐的富集，利於酶法定向製備分子量可控的藥用右旋糖酐，同時獲得較高的產品收率；也可以使用從土壤中篩選出的棘孢青黴菌株發酵而成的右旋糖酐酶，該菌株GenBank登錄號為HQ647326。本發明採用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶聯合製備分子量可控的藥用右旋糖酐，方法具有如下優點(I)本發明先用蔗糖酶作用於蔗糖合成高分子的右旋糖酐，轉化率高達95%，之後再加入右旋糖酐酶降解160-180min，得到系列右旋糖酐產品，該方法不僅綠色、環保、低成本、簡便；而且能夠大幅度提聞廣品收率，獲得聞品質藥用右旋糖野。(2)本發明能夠實現藥用右旋糖酐的分子量可控生產，通過控制反應條件，調節催化反應時間可以定向製備以右旋糖酐20為主的產品。
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發明技術方案做進一步解釋說明。
實施例I(I)右旋糖酐蔗糖酶合成高分子右旋糖酐，包含以下A、B兩步A :右旋糖酐蔗糖酶活力測定用pH5. 4的醋酸-醋酸鈣緩衝液(含醋酸鈣O. 05 g/L、冰醋酸O. 02 mol/L)蔗糖溶液的終濃度配製為10%，加入適量稀釋酶液在25°C條件下靜置反應lh。反應完成後取樣500 μ I加入DNS試劑375 μ I (稀釋10倍)，沸水浴中加熱準確煮沸5min，然後取出將其冷卻至室溫，加入蒸餾水定容至5. 375ml。以未反應的對照液作為參照，用分光光度計在波長520nm處測量光密度值，根據果糖的標準曲線計算果糖量，最終計算出酶活力。一個酶活單位(IU)定義為在上述條件下，每毫升底物反應液中每小時催化蔗糖產生O. I mg果糖所需要的酶量。檢測結果顯示右旋糖酐蔗糖酶粗酶液活力達110IU/mL。B :酶法合成高分子右旋糖酐工藝條件採用pH 5. 4 O. 02 mol/L醋酸-醋酸鈉緩衝液(添加O. 05g/L CaCl2)配製12%的蔗糖溶液5000 mL，置於25°C保溫10 min後，加入右旋糖酐蔗糖酶使其終濃度為2 IU/mL,加入右旋糖酐蔗糖酶總活力單位10000 IU，置於25°C恆溫、120r/min反應4小時，再置於25°C條件下保溫20小時。反應結束後，將反應液置於70°C保溫20 min終止右旋糖酐蔗糖酶的催化反應。反應液用於下一步右旋糖酐酶的催化水解。反應液取樣檢測，採用高效液相色譜檢測樣品的重均分子量達IOOOkDa以上，蔗糖轉化率高達95%以上。(2)右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐，包含以下A、B兩步A :右旋糖酐酶活力測定右旋糖酐酶的活力測定將4ml O. 02mol/L pH 5. O的醋酸鹽緩衝液配製的3%右旋糖酐70 kDa溶液置於35°C保溫lOmin，再加入適當稀釋的酶液Iml保溫Ih後，利用3，5- 二硝基水楊酸(DNS)法測定生成的還原糖。以在上述條件下每分鐘產生I μ mol還原糖(葡萄糖當量)所需要的酶量定義為一個酶活力單位(U)。檢測結果顯示右旋糖酐酶粗酶液活力達500U/mL。B :右旋糖酐酶的催化降解向上述步驟I)經右旋糖酐蔗糖酶催化合成的反應液中加入右旋糖酐酶使其終濃度為0.23 U/mL，加入右旋糖酐酶總活力單位為1150U，置於35°C條件下攪拌反應160min-180 min,反應結束後,將反應液置於100°C水浴保溫10 min或通入水蒸氣5min,使右旋糖酐酶變性失活，以終止酶促反應。(3)去除雜質將上述步驟2)經右旋糖酐酶催化降解的反應液置於80°C保溫3小時，反應液保溫3小時後，會有大量絮狀變性蛋白析出，隨後採用八層紗布過濾雜質(主要為加熱變性的右旋糖酐蔗糖酶)，以上步驟重複兩次，隨後採用中速定性濾紙過濾上清液。然後再將上述反應液過濾後的上清液加熱煮沸15 min，待上清液冷卻後，再利用中速定性濾紙過濾雜質，清澈無色的濾液用於下一步乙醇分級醇沉，即雜蛋白的去除分為兩步進行。(4)乙醇分級醇沉及真空乾燥採用4級劃分，一級劃分乙醇體積濃度為39%，在攪拌裝置下，向步驟(3)所得濾液 中緩慢加入體積濃度95%乙醇，定時測定濾液的溫度和酒精度，並根據溫度和酒精度值查表得濾液中乙醇體積濃度，當乙醇體積濃度達到39%時停止醇沉，將濾液置於40度保溫22小時，然後倒出上清液，再向沉澱中加入適量乙醇取出大分子雜質；二級劃分乙醇體積濃度為43%，向一級劃分後的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達43%時，停止醇沉，將醇沉好的濾液置於34度保溫22小時，然後倒出上清液，再向沉澱中加入乙醇獲得右旋糖酐70產品；三級劃分乙醇濃度為47%，向二級劃分後的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達47%時，停止醇沉，將醇沉好的慮液置於40度保溫12小時，倒出上清液，再向沉澱中加入乙醇獲得右旋糖酐40產品；四級劃分乙醇濃度為57%，向三級劃分後的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達57%時，停止醇沉，將醇沉好的慮液置於常溫，2小時後，再加入乙醇獲得右旋糖野20廣品；最後獲得三種分子量不同的藥用右旋糖酐，經高效液相色譜檢測，三種產品的分子量分別為 69376,38251 和 21364 Da，保留時間分別為 13. 866 min, 14. 390 min 和 15. 037min，分子量分布係數分別為2. 08、I. 39、I. 21，三種產品的總產率為80. 32%，對應的產率為5. 77%、12. 55%、62%。當反應時間為160min_180min，可以定向製備右旋糖酐20為主要的產
品O本實施例中的右旋糖酐蔗糖酶為申請號為200710134765. 4的專利公開文本中的重組右旋糖酐蔗糖酶；右旋糖酐酶為申請號為201110117071.6的專利公開文本中的右旋
糖酐酶。
權利要求
1.雙酶法製備分子量可控的藥用右旋糖酐，其特徵在於，該方法按如下步驟進行 (1)右旋糖酐蔗糖酶合成高分子右旋糖酐， 採用pH 5.4 0. 02 mol/L醋酸-醋酸鈉緩衝液配製終體積濃度12%的蔗糖溶液1000mL，所述緩衝液中添加0.05g/L CaCl2;將配置好的蔗糖溶液置於25°C保溫10 min後，加入右旋糖酐蔗糖酶使其終濃度為2 IU/mL,置於25°C恆溫、120r/min反應4小時，再置於25°C條件下保溫20小時；然後終止右旋糖酐蔗糖酶的催化反應，將反應液用於下一步右旋糖酐酶的催化水解； 所述右旋糖酐蔗糖酶的一個酶活IU是指，以pH5. 4的醋酸-醋酸鈣緩衝液配製終體積濃度為10%的蔗糖溶液為底物；所述緩衝液中含醋酸鈣0.05 g/L、冰醋酸0.02 mol/L ；25°C條件下，每毫升底物反應液中每小時催化蔗糖產生0. I mg果糖所需要的酶量； (2)右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐 向步驟I)經右旋糖酐蔗糖酶催化合成的反應液中加入右旋糖酐酶使其終濃度為0. 23U/mL，置於35°C條件下攪拌反應160min-180 min，然後終止酶促反應； 所述右旋糖酐酶的一個酶活U是指，以pH 5. 0的醋酸鹽緩衝液配製的終體積濃度為3%的重均分子量為70 kDa的右旋糖酐溶液為底物，在35°C條件下，每分鐘產生I y mol還原糖所需要的右旋糖酐酶量； (3)去除雜質 將上述步驟2)經右旋糖酐酶催化水解的反應液置於80°C保溫3小時，隨後採用多層紗布過濾雜質，重複過濾兩次，隨後採用中速定性濾紙過濾上清液；然後再將上述過濾後的上清液加熱煮沸15 min,待上清液冷卻後，再利用中速定性濾紙過濾去除雜質,清澈無色的濾液用於下一步乙醇分級醇沉； (4)乙醇分級醇沉及真空乾燥 採用4級劃分，一級劃分乙醇體積濃度為39%，在攪拌裝置下，向步驟(3)所得濾液中緩慢加入體積濃度95%乙醇，定時測定濾液中乙醇體積濃度，當乙醇體積濃度達到39%時停止醇沉，將濾液置於40度保溫22小時，然後倒出上清液，再向沉澱中加入適量乙醇取出大分子雜質；二級劃分乙醇體積濃度為43%，向一級劃分後的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達43%時，停止醇沉，將醇沉好的濾液置於34度保溫22小時，然後倒出上清液，再向沉澱中加入乙醇獲得右旋糖酐70產品；三級劃分乙醇濃度為47%，向二級劃分後的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達47%時，停止醇沉，將醇沉好的慮液置於40度保溫12小時，倒出上清液，再向沉澱中加入乙醇獲得右旋糖酐40產品；四級劃分乙醇濃度為57%，向三級劃分後的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達57%時，停止醇沉，將醇沉好的慮液置於常溫，2小時後，再加入乙醇獲得右旋糖酐20產品； 將上述乙醇劃分所得到的產品分別置於80°C真空乾燥箱中乾燥4小時，去除產品中殘留的乙醇及水分，即得到相應的右旋糖酐產品。
全文摘要
本發明涉及一種雙酶法製備分子量可控的藥用右旋糖酐，其產品種類包括右旋糖酐70，右旋糖酐40以及右旋糖酐20；其製備步驟分為兩大步，第一大步為高分子右旋糖酐的合成，首先是採用右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖製備高分子右旋糖酐，該新方法使蔗糖轉化為右旋糖酐的轉化率達到95%以上；第二大步為高分子右旋糖的可控性降解，採用高酶活性的右旋糖酐酶催化降解高分子右旋糖酐為藥用右旋糖酐，實現右旋糖酐的分子量可控降解；反應結束後採用簡單的過濾方法去除產品中的雜蛋白，採用乙醇分級醇沉獲得不同分子量右旋糖酐。該方法不僅綠色、環保、低成本、簡便；而且能夠大幅度提高產品收率，獲得高品質藥用右旋糖酐。
文檔編號C12P19/16GK102676615SQ20121018943
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月10日 優先權日2012年6月10日
發明者吳定濤, 張洪斌, 甘微葦, 胡雪芹 申請人:合肥工業大學