一種青黴素和頭孢菌素的純化方法

2023-12-05 16:10:26 2

專利名稱：一種青黴素和頭孢菌素的純化方法
技術領域：
本發明涉及化學工程技術領域，具體涉及一種青黴素和頭孢菌素的純 化方法。
背景技術：
青黴素和頭孢菌素是廣泛應用於臨床的抗生素，具有高效性、低毒性、 分散性好等特點，但這些藥物會導致一些患者發生過敏反應，其中過敏性 休克危害極大。
分子作為 一種過壽丈原的必要條件是必須具有能被抗體識別的特定結
構的抗原決定簇，並且至少要有2個抗原決定簇。目前在臨床上使用的卩-內醯胺類抗生素本身既不具有免疫原性也不能引起過敏反應，只有當它們 與蛋白、多肽、多糖等大分子載體共價結合成全抗原或藥物自身聚合成大 分子化合物後才會引發過敏反應。
抗生素製品中的大分子雜質(分子量大於1000)可來源於發酵工藝或 生產過程，也可因儲存不當或使用不合理而產生，這些大分子雜質是引發 過敏反應的重要原因之一。因此，在確保藥物儲存得當、使用合理的前提 下，降低產品中的雜質含量是降低過敏反應發生率的根本所在。
在對p-內醯胺類抗生素中大分子雜質研究的早期，有學者用透析法分 離大分子雜質，用透析法分離大分子雜質一般都需要一天以上時間，效率 低，樣品經過透析被大幅度稀釋，並且藥物在水溶液中易水解或聚合，長 時間的透析很可能使樣品溶液中產生小分子降解產物或者低聚物。
離子交換色譜能夠將不同聚合度的聚合物雜質分離開來，是用於雜質 分離研究的重要手段，但其對蛋白類雜質的分離未見報導。離子交換色譜 的缺點是分離所需時間長，操作繁瑣。

發明內容
本發明提供了一種青黴素和頭孢菌素的純化方法，該方法可有效分離青黴素和頭孢菌素中的大分子致敏物質，操作簡單，而且藥品不會分解。
一種青黴素和頭孢菌素的純化方法，包括以下步驟 取青黴素或頭孢菌素溶於水中，上樣於用Toyopearl HW-40填料填充
的色譜柱，以水或電解質溶液為洗脫液進行洗脫，分離得到純化的青黴素
或頭孢菌素。
Toyopearl HW-40填料根據顆粒大小分為4個系列，分別為S、 F、 C 和EC,填料孔徑為50A, pH適用範圍為2-14, ^c受壓力上限為3bar。 曰本的Tosoh 7>司生產該系列產品。
所述的青黴素可以是6-氨基青黴烷酸、青黴素G、青黴素V、丙匹西 林、阿度西林、曱氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、氨千西林、 阿莫西林、羧苄西林、美洛西林、旅拉西林、海他西林、阿帕西林、匹氨 西林、上述青黴素的無機鹽(如鈉鹽、鉀鹽、鉀鹽、鋁鹽和銨鹽等)或者 上述物質的混合物，也可以是上述青黴素、青黴素鹽與藥物載體、穩定劑 的混合物。
所述的頭孢菌素可以是7-氨基頭孢黴烷酸、頭孢氨千、頭孢拉定、頭 孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢替安、頭孢哌酮、頭孢夢 多、頭孢坐林、頭孢曱將、上述頭孢菌素頭孢菌素的無機鹽(如鈉鹽、鉀 鹽、鈣鹽、鋁鹽和銨鹽等)或其混合物，也可以是上述頭孢菌素、頭孢菌 素鹽與藥物載體、穩定劑的混合物。
洗脫溫度優選為0~45°C,洗脫液流速優選為為0.2-3 BV/hr。 BV是 指色譜柱中填料的裝填體積。BV/h表示每小時流過色譜柱的液體體積與 色i普柱中填料裝填體積(BV)的比例倍數，用以表徵洗脫時單位時間內 液體的體積流量。
所述的電解質溶液優選為濃度不大於2mol/L, pH為3 ~ 8的檸檬酸鹽 緩衝液、磷酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、碳酸鹽緩沖液、三乙胺-鹽酸緩 衝液、氯化鈉溶液、石充酸鹽溶液、硝酸鹽溶液中的至少一種。
所述的Toyopearl HW-40填料優選為Toyopearl HW-40S、 Toyopearl HW-40F 、 Toyopearl HW-40C和Toyopearl HW-40EC中的至少 一種。
純化後的青黴素、頭孢菌素或大分子物質的致敏性測試通過如下方法 實現
(1)製備免疫原在鹼性環境下製備青黴素或頭孢菌素與牛血清白蛋白的複合物，此複合物可作為免疫原使家兔產生抗體。
(2) 免疫首次免疫對家兔靜脈注射免疫原與福氏完全佐劑的混合 物，以後對家兔靜脈注射免疫原與福氏不完全佐劑的混合物，分別在首次 免疫後第21天、35天、49天進行第二次、第三次、第四次免疫。第四次 免疫結束後一周從家兔血液中分離血清，得到抗血清。
(3) 激發在豚鼠背部脊推兩側皮內注射O.lmL—定稀釋度的抗血 清，使之被動致敏。18小時後，靜脈注入含有1%伊斯文藍染料的待測雜 質，若雜質能與抗體互相作用，會導致肥大細胞釋放組胺等生物活性物質， 使毛細血管擴張和血管通透性增加，在豚鼠背部皮膚上形成藍斑。
本發明方法通過色譜法分離青黴素和頭孢菌素中的大分子雜質，所採 用的填料為Toyopearl HW-40 (乙二醇和曱基丙烯酸酯聚合物共聚成的具 有親水性、多孔的半剛性小球)，該類填料在以水溶液為流動相時，會對 青黴素和頭孢菌素產生吸附作用，從而大大改善對青黴素和頭孢菌素中大 分子雜質的分離效果。
當採用緩沖溶液進行洗脫時，溶質分子與親水性填料表面的輕基基團 之間的排斥作用被抑制，進而加強填料對青黴素和頭孢菌素的吸附，增大 青黴素和頭孢菌素與大分子雜質之間的分離度。與G-IO、 G-25色譜填料 相比，ToyopearlHW-40填料對大分子雜質的分離效果有明顯的提高。
本發明方法相對於傳統的分離方法具備以下優點
(1) 本發明方法對大分子雜質的分離效率高、操作簡便，適合於工 業化生產。
(2) 本發明方法以Toyopearl HW-40填料為分離介質，大分子雜質不 能夠進入凝膠孔道內而被排阻，抗生素分子與凝膠之間的吸附作用使其被 較晚洗脫，大分子雜質與抗生素分子之間的分離度較高，可以有效地去除 青黴素中的大分子雜質，提高產品質量。
(3 )本發明方法所採用的Toyopearl HW-40系列凝膠呈半剛性小球， 穩定性好，可重複利用，使用壽命長。
具體實施方式
實施例1
稱取3g青黴素G鈉溶解於水中，上樣於色譜柱。Toyopearl HW-40F
5填料經洗脫液(0.005mol/L、 pH7.0的檸檬酸鈉緩衝液)充分溶脹後，採用溼法裝柱，色謙柱尺寸為(j)1.6cmx60cm，色譜柱體積(BV )為120.6mL。在5。C下，用0.005mol/L、 pH7.0的4寧檬酸鈉緩沖液以0.5 BV/hr的洗脫流速流經色語柱，洗脫劑用量為3BV。大分子雜質在前面洗脫，青黴素G鈉在後面洗脫，分別收集大分子雜質和青黴素G鈉並冷凍乾燥。青黴素G鈉收率為95.8%。
用被動皮膚過敏試驗檢驗大分子雜質以及純化後青黴素G鈉的致敏性。兔抗青黴素結合蛋白血清(製備方法如發明內容中所述)以生理鹽水配製成稀釋度為1:10、 1:80、 1:400的血清溶液，各取O.lmL皮內注射於脫毛白色健康豚鼠(230-280g)脊推兩邊，18小時後，從前腿靜脈注射含有1 %伊文思藍的大分子雜質溶液或純化後的青黴素G鈉溶液15分鐘量取結果，形成的藍斑直徑大於5mm視為陽性。結果顯示，大分子雜質具有強致敏性，純化後的青黴素G鈉不具有致敏性。
實施例2
調節250mg/mL的青黴素G鈉溶液pH值至8.0，在25。C下放置15天，上樣2mL於色譜柱。Toyopearl HW-40S填料經洗脫液(0.1mol/L、 pH7.0的檸檬酸鈉緩衝液)充分溶脹後，採用溼法裝柱，色譜柱尺寸為([)1.6cmx33cm，色譜柱體積(BV)為66.4mL。在25。C下，用0.1mol/L、pH7.0的檸檬酸鈉糹爰沖液以0.3 BV/hr的洗脫流速流經色譜柱，洗脫劑用量為4BV。在青黴素G鈉洗脫位置之前有紫外吸收物質被洗脫並收集、冷凍乾燥。被動皮膚過敏試驗如實施例1所述，在青黴素G鈉之前洗脫的組分可以？ 1發豚鼠發生過敏反應。
實施例3
稱取lg氨爺西林溶解於水中，上樣於色譜柱。Toyopearl HW-40S填料經洗脫液(0.5%氯化鈉溶液)充分溶月長後，採用溼法裝柱，色譜柱尺寸為)1.6cmx30cm,色i普柱體積(BV )為60.3mL。在15。C下，用0.5%氯化鈉溶液以0.5 BV/hr的洗脫流速流經色譜柱，洗脫劑用量為3BV。分別收集大分子雜質和氨節西林並冷凍乾燥。氨千西林的收率為96.6%。被動皮膚過敏試驗如實施例1所述，氨節西林中的大分子雜質引發豚鼠發生過敏反應，純化後的氨千西林不具有致敏性。
實施例4
稱取3g阿莫西林溶解於水中，上樣於色譜柱。Toyopearl HW-40F填 料經洗脫液(0.05mol/L、 pH7.0的磷酸鈉緩衝液)充分溶脹後，採用溼法 裝柱，色譜柱尺寸為(])1.6cmx60cm,色譜柱體積(BV)為120.6mL。在 40。C下，用0.05mol/L、 pH7.0的磷酸鈉緩衝液以0.6 BV/hr的洗脫流速流 經色譜柱，洗脫劑用量為3.5BV。分別收集大分子雜質和阿莫西林並冷凍 千燥。阿莫西林的收率為94.2°/。。被動皮膚過敏試驗如實施例1所述，阿 莫西林中的大分子雜質引發豚鼠發生過敏反應，純化後的阿莫西林不具有 致敏性。
實施例5
稱取2g丙匹西林溶解於水中，上樣於色譜柱。Toyopearl HW-40C填 料經洗脫液(0.3mol/L、 pH4.0醋酸鈉緩衝液)充分溶脹後，採用溼法裝 柱，色譜柱尺寸為(1.6cmx60cm,色譜柱體積(BV )為120.6mL。在25°C 下，用0.3mol/L、 pH4.0醋酸鈉緩衝液以1 BV/hr的洗脫流速流經色譜柱， 洗脫劑用量為4BV。分別收集大分子雜質部分和丙匹西林部分並冷凍幹 燥。丙匹西林的收率為94.2%。被動皮膚過4文試驗如實施例1所述，丙匹 西林中的大分子雜質能引發豚鼠發生過敏反應，純化後的丙匹西林不具有 致敏性。
實施例6
稱取lg曱氧西林溶解於水中，上樣於色譜柱。Toyopearl HW-40F填 料經洗脫液(0.01mol/L的^^酸氬鈉溶液)充分溶^^後，採用溼法裝柱， 色譜柱尺寸為(j)1.6cmx30cm,色語柱體積(BV )為60.3mL。在l(TC下， 用0.01mol/L的碳酸氫鈉溶液以0.6BV/hr的洗脫流速流經色譜柱，洗脫劑 用量為3BV。分別收集大分子雜質部分和甲氧西林部分並冷凍乾燥。甲氧 西林的收率為95.5°/。。被動皮膚過敏試驗如實施例1所述，曱氧西林中的 大分子雜質能引發豚鼠發生過敏反應，純化後的曱氧西林不具有致敏性。
實施例7
7稱取2g頭孢他咬溶解於水中，上樣於色譜柱。Toyopearl HW-40F填 料經洗脫液(0.1mol/L、 pH7.0檸檬酸鈉緩衝液)充分溶脹後，採用溼法 裝柱，色譜柱尺寸為(j)1.6cmx60cm，色譜柱體積(BV)為U0.6mL。在 15。C下，用0.1mol/L、 pH7.0杵檬酸鈉緩衝液以0.6 BV/hr的洗脫流速流經 色譜柱，洗脫劑用量為3BV。分別收集大分子雜質部分和頭孢他啶部分並 冷凍乾燥。頭孢他啶的收率為94.8%。；波動皮膚過壽丈試驗如實施例1所述， 頭孢他吱中的大分子雜質能？ 1發豚鼠發生過敏反應，純化後的頭孢他啶不 具有致敏性。
實施例8
稱取2.5g頭孢p塞吩鈉溶解於水中，上樣於色譜柱。Toyopearl HW-40F 填料經洗脫液(0.1mol/L、 pH7.0磷酸鈉緩衝液)充分溶脹後，釆用溼法 裝柱，色譜柱尺寸為(l)1.6cmx60cm,色譜柱體積(BV)為120.6mL。在5°C 下，用0.1mol/L、pH7.0磷酸鈉緩衝液以0.6 BV/hr的洗脫流速流經色i普柱， 洗脫劑用量為4BV。分別收集大分子雜質部分和頭孢噻吩鈉部分並冷凍幹 燥。頭孢p塞吩鈉的收率為96.0%。被動皮膚過敏試驗如實施例1所述，頭 孢塞吩鈉中的大分子雜質能《1發豚鼠發生過敏反應，純化後的頭孢噻吩鈉 不具有致壽文性。
8
權利要求
1、一種青黴素和頭孢菌素的純化方法，包括以下步驟取青黴素或頭孢菌素溶於水中，上樣於用Toyopearl HW-40填料填充的色譜柱，以水或電解質溶液為洗脫液進行洗脫，分離得到純化的青黴素或頭孢菌素。
2、 根據權利要求1所述的純化方法，其特徵在於所述的洗脫溫度為0 ~ 45°C ，洗脫液流速為0.2-3 BV/hr。
3、 根據權利要求1所述的純化方法，其特徵在於所述的電解質溶液為濃度不大於2mol/L， pH為3 ~ 8的檸檬酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、石友酸鹽緩沖液、三乙胺-鹽酸緩衝液、氯化鈉溶液、^琉酸鹽溶液、硝酸鹽溶液中的至少一種。
4、 根據權利要求1所述的純化方法，其特徵在於所述的ToyopearlHW-40填料為Toyopearl HW-40S、 Toyopearl HW-40F、 Toyopearl HW-40C和Toyopearl HW-40EC中的至少一種。
全文摘要
本發明公開了一種青黴素和頭孢菌素的純化方法，包括以下步驟取青黴素或頭孢菌素溶於水中，上樣於用Toyopearl HW-40填料填充的色譜柱，以水或電解質溶液為洗脫液進行洗脫，分離得到純化的青黴素或頭孢菌素。本發明方法通過色譜法分離青黴素和頭孢菌素中的大分子雜質，其所採用的填料為Toyopearl HW-40，該類填料在以水溶液為流動相時，會對青黴素和頭孢菌素產生吸附作用，從而大大改善了對青黴素和頭孢菌素中大分子雜質的分離效果。
文檔編號C07D499/18GK101497620SQ200910095880
公開日2009年8月5日 申請日期2009年2月16日 優先權日2009年2月16日
發明者任其龍, 盧昕博, 楊亦文, 雲 蘇, 蘇寶根, 邢華斌 申請人:浙江大學