膽石症易感性檢測方法和試劑盒的製作方法

2023-12-09 06:21:21 2

專利名稱：膽石症易感性檢測方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域。更具體地，本發明涉及利用細胞色素C氧化酶複合物亞基I(COXI)基因及其編碼產物診斷和治療膽石症的方法，以及含有COXI基因和/或蛋白的藥物組合物。
背景技術：
膽石症是一種常見的疾病，它是由於膽囊或膽總管的結石造成的。一般膽石症按膽石的成分分為三類膽固醇結石，膽色素結石和混合結石。其中以膽固醇結石最為常見。患有膽石症的病人一般會出現上腹部有悶脹不適，噁心，常伴有消化不良的症狀，用手深壓上腹部時，有疼痛的感覺。中國人群中膽石症的發病率約為7％-10％，其中女性發病率比男性高2倍以上，以50歲以上老年人發病較普遍。
線粒體疾病是比較特殊的一類遺傳疾病，它是由線粒體上基因發生突變而造成的遺傳疾病。其特徵是母系遺傳，即只能由母親遺傳給孩子。由於線粒體基因全部是能量代謝相關的基因，在氧化磷酸化和糖，脂類的代謝中起著至關重要的作用，所以線粒體遺傳病大多為與代謝相關的疾病，典型的如非胰島素依賴型線粒體糖尿病，神經性肌無力等。某些退行性疾病也與線粒體DNA(mtDNA)的突變有關，如Alzeimer綜合症、Parkinson綜合症、Huntington舞蹈症，衰老等。線粒體疾病可以是由於線粒體基因的突變引起，也可以是由於線粒體所編碼的tRNA或相對風險NA發生突變引起的。
迄今為止，本領域還缺乏診斷膽石症的有效方法以及非手術治療膽石症的有效手段。因此，本領域迫切需要開發新的診斷和治療膽石症的有效方法，以及相關的治療藥物，診斷技術和試劑。

發明內容
本發明的一個目的就是提供一種新的診斷(尤其是早期診斷)膽石症的方法及檢測試劑盒。
本發明的另一目的是提供一種新的治療膽石症的方法。
本發明的再一目的是提供一種治療膽石症的藥物組合物。
在本發明的第一方面，提供了一種檢測人細胞色素C氧化酶複合物亞基I基因的單核苷酸多態性的方法，它包括步驟(a)確定在人細胞色素C氧化酶複合物亞基I基因的SEQ ID NO1所示序列的第6024，6217，或6414位的核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態性。
在另一優選例中，所述的單核苷酸多態性是在6024位存在A，在6217位存在C，和6414存在C。
在本發明的第二方面，提供了一種核酸引物對，其長度為15-50bp，且特異性地雜交並擴增出含人細胞色素C氧化酶複合物亞基I基因的SEQ ID NO1所示序列中第6024，6217，和/或6414位單核苷酸多態性的擴增產物。
還提供了一種核酸引物對，其長度為15-50bp，且特異性地雜交並擴增出含人線粒體DNA的SEQ ID NO1所示序列中第16137、16189和16219位單核苷酸多態性的擴增產物。
在本發明的第三方面，提供了一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其長度為15-500bp，且特異性地雜交並檢測含人細胞色素C氧化酶複合物亞基I基因的SEQ ID NO1所示序列中第6024，6217，和/或6414位單核苷酸多態性。
在本發明的第四方面，提供了一種檢測膽石症的試劑盒，它包括特異性擴增COXI基因或轉錄本的引物；和/或特異性擴增線粒體DNA第一高變區的引物。
在另一優選例中，所述的試劑盒還含有與突變部位結合的探針。
在另一優選例中，所述的突變選自下組(a)SEQ ID NO1中6024 G→A，6217 T→C，和6414 T→C；(b)線粒體DNA第16137、16189和16219位變為C。
更佳地，所述的突變是同時發生SEQ ID NO1中6024 G→A，6217 T→C，和6414 T→C的突變。
一種優選的試劑盒包括(1)特異性擴增人細胞色素C氧化酶複合物亞基I基因的引物對，(2)檢測擴增產物與正常的細胞色素C氧化酶複合物亞基I基因相比是否存在變化所需的試劑，所述的變化是SEQ ID NO1所示序列中6024，6217，或6414位的單核苷酸多態性。
較佳地，所述的單核苷酸多態性是在6024位存在A，在6217位存在C，和6414存在C。
另一種優選的試劑盒包括(1)特異性擴增含人線粒體DNA的SEQ ID NO1所示序列中第16137、16189和16219位的引物對，(2)檢測擴增產物是否存在變化所需的試劑，所述的變化是SEQ ID NO1所示序列中第16137、16189和16219位的核苷酸突變為C。
在本發明的第五方面，提供了一種對個體的膽石症易感性進行診斷的方法，它包括步驟(a)檢測該個體的COXI基因、轉錄本和/或蛋白，並與正常的COXI基因、轉錄本和/或蛋白相比較，其中，存在差異就表明該個體患膽石症的可能性高於正常人群；或者(b)檢測該個體的SEQ ID NO1所示線粒體DNA的序列以下位點的核苷酸16137、16189和16219位；其中，16137、16189和16219位點的核苷酸為C就表明該個體患膽石症的可能性高於正常人群。
在另一優選例中，在所述的方法中檢測的是COXI的基因或轉錄本，並與正常COXI核苷酸序列比較差異。較佳地，所述的差異選自下組SEQ ID NO1中6024 G→A，6217 T→C，和6414 T→C。
在本發明的第六方面，提供了一種治療膽石症的方法，包括步驟給需要所述治療的病人施用安全有效量的正常COXI蛋白。
在本發明第七方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的COXI蛋白以及藥學上可接受的載體。


圖1顯示了B4b1的系統演化關係。
具體實施例方式
能源物質的氧化磷酸化為類固醇的合成的提供了前體物質NADPH和乙醯輔酶A，而類固醇的代謝產物也要通過氧化磷酸化途徑完成徹底的代謝。線粒體基因通過控制氧化磷酸化過程直接或間接的控制著類固醇的代謝。因此，線粒體基因的異常可能會導致包括膽石症在內的許多與類固醇代謝類疾病。本發明人經過多年深入和廣泛的研究，首次發現和證明了細胞色素C氧化酶複合物亞基I(COXI)與膽石症密切相關，細胞色素C氧化酶複合物亞基I的改變將直接導致膽石症。在此基礎上完成了本發明。
細胞色素C氧化酶複合物亞基I基因(COXI)是參與氧化磷酸化的最後一步，即把電子傳遞給氧。整個COX複合物由八個亞基組成，其中的三個COXI，COXII和COXIII定位在線粒體上。本發明的研究首先證實，COXI的突變與膽石症密切相關。
如本文所用，術語「本發明蛋白」或「本發明多肽」指細胞色素C氧化酶複合物亞基I，即COXI。
如本文所用，術語「本發明基因」指細胞色素C氧化酶複合物亞基I基因，即COXI基因。COXI的基因序列示於SEQ ID NO2，對應於SEQ ID NO1中第5905-7446位。
基於本發明的發現，COXI蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限於)直接做為藥物治療或輔助膽石症，和用於篩選促進COXI蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人COXI蛋白篩選多肽庫可用於尋找有治療價值的能刺激人COXI蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發明還包括對人COXI DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab』或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的人COXI基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人COXI蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備。一類特別優選的抗體是對正常COXI蛋白和變異的COXI蛋白有不同結合力或結合特性抗體。
抗人COXI蛋白的抗體可用於免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人COXI蛋白。利用特異性結合於正常COXI蛋白但不結合於變異的COXI蛋白的抗體，或者特異性結合於變異COXI蛋白但不結合於正常的COXI蛋白的抗體，可以快速檢測和區分正常和異常的COXI蛋白。
利用本發明蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與COXI蛋白發生相互作用的物質，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
正常的COXI多肽可直接用於疾病治療，例如，用於膽石症方面的治療。在使用本發明COXI蛋白時，還可同時使用其他治療膽石症的藥劑。
本發明COXI蛋白，當在治療上進行施用(給藥)時，可緩解或消除膽石症。通常，可將COXI蛋白配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、靜脈內、皮下、或局部給藥。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明COXI蛋白以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如藥膏、片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如藥膏、針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的COXI蛋白施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
本發明還涉及定量和定位檢測人COXI蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。
一種檢測樣品中是否存在COXI蛋白的方法是利用COXI蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與COXI蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在COXI蛋白。
COXI蛋白的多聚核苷酸可用於COXI蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，COXI蛋白的多聚核苷酸可用於檢測COXI蛋白的表達與否或在疾病狀態下COXI蛋白的異常表達。
檢測COXI基因的突變也可用於診斷COXI蛋白相關的疾病。COXI蛋白突變的形式包括與正常野生型COXI DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本領域的技術人員知道，有大量的分析技術可用於檢測犬尿氨酸水解酶基因中所述位點是否存在單核苷酸多態性。這些技術包括(但並不限於)DNA測序、雜交測序；酶促錯配切割、異源雙鏈分析、點雜交、寡核苷酸陣列(DNA晶片)、Mini-sequencing、Taqman技術、分子信標等，變性高效液相色譜法(DHPLC)。
用於本發明的測試樣品沒有特別限制，對於檢測SNP而言，可以是從血液、組織等樣品中抽提出的線粒體DNA或RNA。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
在本發明中，關於COXI序列及其他一些有用信息，可在如下電子資料庫信息中找到GenBank Overview，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank/GenbankOverview.html[NC_001807(gi17981852)]，具體序列示於SEQ ID NO1。其中第5905-7446為COX I基因(SEQ ID NO2)，第16024-16383為第一高變區(SEQ IDNO3)。
實施例1
COXI與膽石症的相關性在本實施例中，從上海地區採集了101例膽石症患者血樣，並與759個隨機抽取的人群樣本(上海地區535個，北京地區224個)進行對照，試圖進行線粒體DNA與膽石症的相關分析。對照組的759個隨機樣本，並不知道他們是否是膽石症病人。
在本實施例中檢測了細胞色素C氧化酶複合物亞基I基因(COXI)。這個基因參與氧化磷酸化的最後一步，即把電子傳遞給氧。整個COX複合物由八個亞基組成，其中的三個COXI，COXII和COXIII定位在線粒體上。
通過常規PCR反應擴增和377測序儀測序，在COXI的編碼區發現了3個頻率比較高的單核苷酸多態(SNP)6024 G→A，6217 T→C和6414 T→C(見SEQID NO1)。這3個SNP在膽石症患者中的頻率明顯高於對照人群。在膽石症病人中頻率分別為6024 A5/101；6217 C4/101；6414 C6/101。而在對照人群中6024 A8/759；6217 C7/759；6414 C7/759(表1)。
經Fisher’s精確檢驗，兩者具有顯著性差異(6024 G→A，p＜0.01；6217 T→C，p＜0.05；6414 T→C，p＜0.01。
此外，還發現膽石症病人組中，這三種SNP集中出現在了六個人身上，即擁有6414C的六個人中，五人同時擁有6024A，四人同時擁有6217C。在對照組中情況相似，有六個人同時擁有6024A，6217C和6414C。從而，這三個位點組成了一個單倍型(A-C-C)，在膽石症病人和對照組中的頻率分別為5.9％(6/101)和0.8％(6/759)，兩組間存在顯著性差異(p＜0.01)。
COXI的這三個突變及其組成的單倍型具有明顯的地區特異性，759個對照樣本中，224個北京所採集的樣本沒有一個擁有這三種SNP，所有對照樣本中的三種SNP和六個COXI A-C-C單倍型都來自上海地區的樣本。由於膽石症病人樣本都取自上海，我們針對上海地區的對照樣本重新計算的結果表明兩者之間仍然具有顯著性差異(6024 G→A，p＜0.05；6414 T→C，p＜0.01)。
表1B4b1單倍群和COXI基因突變的頻率個體數 單倍群COXI基因突變B4b1 6024A6217C6414C病人1018546對照759 8** 7* 7**北京224 0** 0** 0**上海53512** 8* 77**Fisher’s精確測驗*P＜0.05，**P＜0.01實施例2B4b1單倍群和COXI基因突變的相關性從進化的角度看，任何一個致病的突變都是在一定的遺傳背景下產生。如果在人類進化過程中某一女性的mtDNA發生了突變，增加了患某些疾病的可能性，在不影響生殖能力的情況下，這一突變將有可能流傳到現代，導致攜帶該類型mtDNA的個體都具有該疾病的高度易感性。mtDNA在傳代過程中不發生重組，因此相對容易追溯某一特定線粒體疾病患者共同祖先的mtDNA序列組合狀態。但是由於mtDNA的全序列比較長(16K)，對所有的病人都進行全序列分析將消耗大量的人力和財力。目前一般的做法是對mtDNA的高變區進行測定，通過高變區與致病突變的共同遺傳來搜索可能的致病突變和祖先mtDNA的狀態。
基於這一策略，在本實施例中，對所有病人以及上海地區的對照樣本進行了第一高變區(HVS1)的測序分析。
結果列於表2。數據表明，所有具有以上三個COXI突變的病人均屬於一個東亞地區特殊的單倍群(Haplogroup，在進化譜系上相近的一組單倍型)B4b1，其特徵是同時具有16137C-16189C-16219C三個高變區位點的突變(SEQ ID NO1)。這一單倍群在膽石症患者中比例與對照樣本相比，具有較顯著差異(病人8/101，對照12/535，p＜0.01)。
表2在B4b1單倍群中COXI基因和HVS1的多態樣本 COXI基因多態 HVS1多態(Minus 16000)6024 6217 6414病人P13ACC137C-189C-219C-225CP20GCC137C-189C-219C-225CP46ATC137C-189C-219C-225C-262TP79ACC137C-189C-219C-225CP92ACC137C-189C-219C-225CP93ATC137C-189C-219C-225C-262TP74GTT137C-189C-219C-225C-357TP83GTT137C-189C-219C-225C對照C01GTT137C-189C-219C-272T-300CC02GTT137C-155C-189C-219C-220TC03ACC137C-189C-199T-216T-219CC04ACC137C-189C-219CC05GTT137C-219C-220TC06ACC137C-189C-219CC07GTT137C-189C-219C-220TC08GTT137C-189C-219C-220TC09ACC137C-189C-219CC10ACC137C-189C-219C-262TC11ACC137C-189C-219C-262T-263TC12GTT137C-189C-219C-220T實施例3B4b1 mtDNA之間的系統演化關係為了近一步闡明B4b1 mtDNA之間的系統演化關係，對實施例1獲得的測序結果，利用NETWORK軟體(Fluxus Technology Ltd.)構建了Median-joining網絡圖。
結果表明，B4b1可以再分為2支，B4b1a和B4b1b，8個具有B4b1單倍群的病人全部落在B4b1a(如圖1)。
實施例4B4b1單倍群與正常人群患膽石症的相對風險比較對病人和對照的比較分析表明B4b1和B4b1a的相對風險(Relative risk，相對風險)分別為3.807(x2＝8.910，P＜0.01)和7.405(x2＝15.043，P＜0.001)，即具有B4b1和B4b1a線粒體類型的人群患膽石症的可能性是不具有該類型線粒體人群的3.8倍和7.4倍。
由於本發明人並不清楚對照組是否患有膽石症，所以以上的相對風險的計算是過低估計。本發明人對帶有B4b1線粒體的對照進行了電話回訪，由於聯繫方式的限制，只能成功的回訪到3個對照個體，其中的一位本身就是膽石症患者，其他的2位具有家族史(C11的2個兄弟和C12的母親和外婆患有膽石症)。把這3例對照個體放入病人組重新計算的結果顯示B4b1的相對風險為6.778(x2＝18.695，P＜0.0001)，B4b1a為13.049(x2＝21.754，P＜0.00001)。提示攜帶B4b1和B4b1a線粒體的人群患膽石症的可能性分別是其他人群的6.8倍和13倍。
值得注意的是這仍然是過低估計，因為其他具有B4b1的對照還沒有回訪到。就是說如果本發明人可以知道這些對照的情況，其中還有膽石症患者的話，攜帶B4b1和B4b1a線粒體的人群患膽結石的可能性將進一步增大。
此外，為了進一步驗證膽石症可能的母系遺傳特徵，本發明人對8個B4b1的膽石症患者進行了家系調查，傳遞連鎖不平衡檢驗(TransmissionDisequilibrium Test，TDT)。結果表明膽石症在這些家系中的傳遞具有非常明顯的母系遺傳偏向(p＝0.0017)，即膽石症在這些家系中大部分在母親與子女之間傳代。
綜上所述，中國人中攜帶B4b1線粒體單倍群的群體患膽石症的危險度有非常明顯增高，為膽石症高危人群。通過對HVS1區和COXI基因單倍型的檢測，本發明人可以對具有B4b1單倍型的個體及其相關家屬提出膽石症的預警，通過注意飲食調理或者醫學手段，降低其發病的可能。並且這一發現為最終查清膽石症發生的遺傳原因以及發病機理提供了線索和可以進一步研究的方向。線粒體B4b1單倍群(特徵為16137C-16189C-16219C突變)可作為膽石症患病危險度的一個有效的預警指標。
實施例5膽石症易感性的檢測試劑盒如實施例1-4所述，SEQ ID NO1中6024 G→A，6217 T→C，和6414 T→C的突變以及線粒體DNA第16137、16189和16219位變為C，與膽石症密切相關。因此，可基於這些突變設計引物在以病人的mtDNA為模板進行擴增進行檢測，例如SEQ ID NO4和5，以及SEQ ID NO6和7。

在一對引物所擴增出的片段中有三個位點，可對擴增產物直接用測序檢測。
製備一檢測SEQ ID NO1中6024 G→A，6217 T→C，和6414 T→C的突變試劑盒(100人次)，它含有名稱 編號 數量正向引物 SEQ ID NO3 100pmol反向引物 SEQ ID NO4 100pmolPCR緩衝液 若干此外，還製備一檢測線粒體DNA第16137、16189和16219位變為C的試劑盒(100人次)，它含有以下組份名稱 編號 數量正向引物 SEQ ID NO6 100pmol反向引物 SEQ ID NO7 100pmolPCR緩衝液 若干使用試劑盒時，可以通過擴增產物的有無、與特異性探針的雜交與否，以及對擴增產物的測序等方法，來確定是否存在本發明所述的與膽石症相關的突變。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110國家人類基因組南方研究中心復旦大學上海第二醫科大學附屬瑞金醫院120膽石症易感性檢測方法和試劑盒1300328501607170PatentIn version 3.1210121116571212DNA213智人(Homo sapiens)4001gatcacaggt ctatcaccct attaaccact cacgggagct ctccatgcat ttggtatttt60cgtctggggg gtgtgcacgc gatagcattg cgagacgctg gagccggagc accctatgtc 120gcagtatctg tctttgattc ctgcctcatt ctattattta tcgcacctac gttcaatatt 180acaggcgaac atacctacta aagtgtgtta attaattaat gcttgtagga cataataata 240acaattgaat gtctgcacag ccgctttcca cacagacatc ataacaaaaa atttccacca 300aacccccccc tccccccgct tctggccaca gcacttaaac acatctctgc caaaccccaa 360aaacaaagaa ccctaacacc agcctaacca gatttcaaat tttatcttta ggcggtatgc 420acttttaaca gtcacccccc aactaacaca ttattttccc ctcccactcc catactacta 480atctcatcaa tacaaccccc gcccatccta cccagcacac acacaccgct gctaacccca 540taccccgaac caaccaaacc ccaaagacac cccccacagt ttatgtagct tacctcctca 600aagcaataca ctgaaaatgt ttagacgggc tcacatcacc ccataaacaa ataggtttgg 660tcctagcctt tctattagct cttagtaaga ttacacatgc aagcatcccc gttccagtga 720gttcaccctc taaatcacca cgatcaaaag ggacaagcat caagcacgca gcaatgcagc 780tcaaaacgct tagcctagcc acacccccac gggaaacagc agtgattaac ctttagcaat 840aaacgaaagt ttaactaagc tatactaacc ccagggttgg tcaatttcgt gccagccacc 900gcggtcacac gattaaccca agtcaataga agccggcgta aagagtgttt tagatcaccc 960cctccccaat aaagctaaaa ctcacctgag ttgtaaaaaa ctccagttga cacaaaatag 1020actacgaaag tggctttaac atatctgaac acacaatagc taagacccaa actgggatta 1080gataccccac tatgcttagc cctaaacctc aacagttaaa tcaacaaaac tgctcgccag 1140aacactacga gccacagctt aaaactcaaa ggacctggcg gtgcttcata tccctctaga 1200ggagcctgtt ctgtaatcga taaaccccga tcaacctcac cacctcttgc tcagcctata 1260taccgccatc ttcagcaaac cctgatgaag gctacaaagt aagcgcaagt acccacgtaa 1320agacgttagg tcaaggtgta gcccatgagg tggcaagaaa tgggctacat tttctacccc 1380agaaaactac gatagccctt atgaaactta agggtcgaag gtggatttag cagtaaactg 1440agagtagagt gcttagttga acagggccct gaagcgcgta cacaccgccc gtcaccctcc 1500tcaagtatac ttcaaaggac atttaactaa aacccctacg catttatata gaggagacaa 1560gtcgtaacat ggtaagtgta ctggaaagtg cacttggacg aaccagagtg tagcttaaca 1620caaagcaccc aacttacact taggagattt caacttaact tgaccgctct gagctaaacc 1680tagccccaaa cccactccac cttactacca gacaacctta gccaaaccat ttacccaaat 1740aaagtatagg cgatagaaat tgaaacctgg cgcaatagat atagtaccgc aagggaaaga 1800tgaaaaatta taaccaagca taatatagca aggactaacc cctatacctt ctgcataatg 1860aattaactag aaataacttt gcaaggagag ccaaagctaa gacccccgaa accagacgag 1920ctacctaaga acagctaaaa gagcacaccc gtctatgtag caaaatagtg ggaagattta 1980taggtagagg cgacaaacct accgagcctg gtgatagctg gttgtccaag atagaatctt 2040
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221misc_feature222(1)..(22)223引物
4007aggaaccaga tgtcggatac ag2權利要求
1.一種檢測人細胞色素C氧化酶複合物亞基I基因的單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，它包括步驟(a)確定在人細胞色素C氧化酶複合物亞基I基因的SEQ ID NO1所示序列的第6024，6217，或6414位的核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態性。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的單核苷酸多態性是在6024位存在A，在6217位存在C，和6414存在C。
3.一種核酸引物對，其特徵在於，其長度為15-50bp，且特異性地雜交並擴增出含人細胞色素C氧化酶複合物亞基I基因的SEQ ID NO1所示序列中第6024，6217，和/或6414位單核苷酸多態性的擴增產物。
4.一種核酸引物對，其特徵在於，其長度為15-50bp，且特異性地雜交並擴增出含人線粒體DNA的SEQ ID NO1所示序列中第16137、16189和16219位單核苷酸多態性的擴增產物。
5.一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其特徵在於，其長度為15-500bp，且特異性地雜交並檢測含人細胞色素C氧化酶複合物亞基I基因的SEQ ID NO1所示序列中第6024，6217，和/或6414位單核苷酸多態性。
6.一種檢測膽石症的試劑盒，其特徵在於，它包括特異性擴增COXI基因或轉錄本的引物；和/或特異性擴增線粒體DNA第一高變區的引物。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於，它還含有與突變部位結合的探針。
8.如權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於，它包括(1)特異性擴增人細胞色素C氧化酶複合物亞基I基因的引物對，(2)檢測擴增產物與正常的細胞色素C氧化酶複合物亞基I基因相比是否存在變化所需的試劑，所述的變化是SEQ ID NO1所示序列中6024，6217，或6414位的單核苷酸多態性。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特徵在於，所述的單核苷酸多態性是在6024位存在A，在6217位存在C，和6414存在C。
10.如權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於，它包括(1)特異性擴增含人線粒體DNA的SEQ ID NO1所示序列中第16137、16189和16219位的引物對，(2)檢測擴增產物是否存在變化所需的試劑，所述的變化是SEQ ID NO1所示序列中第16137、16189和16219位的核苷酸突變為C。
全文摘要
本發明公開了一種診斷膽石症的方法，它包括檢測個體的COXI基因、轉錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明該個體患膽石症的可能性大於正常人群。本發明還公開了檢測膽石症的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1570138SQ03141618
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月16日 優先權日2003年7月16日
發明者黃薇, 金力, 牛振民, 文波, 韓天權 申請人:國家人類基因組南方研究中心, 復旦大學, 上海第二醫科大學附屬瑞金醫院