乙醇診斷/測定試劑(盒)及乙醇濃度測定方法

2023-12-09 04:30:21 3

專利名稱：乙醇診斷/測定試劑(盒)及乙醇濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種乙醇診斷/測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定乙醇濃度的方
法，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
乙醇具成癮性，酒濫用和酒依賴是當今世界範圍內最嚴重的社會經濟和公共衛生
問題之一。在西方國家，酒精相關性肝病已成為死亡的第六位原因。在我國，近20年來，隨
著社會經濟發展，人均酒消耗量大幅度上升，酒依賴的患病率日趨增高。 生物樣品中乙醇的定量測定方法主要有化學比色法，酶終點比色法，均相酶免疫
測定法(EIA)，氣相色譜法(GC)和呼出氣乙醇分析。此外血清滲透量法可作乙醇半定量分析。 有多種化學比色法曾用於乙醇定量測定，微量擴散法是其中較簡單實用的一種，微量溢出的乙醇可使鉻酸還原成藍色的氧化鉻。 根據所用的試劑酶不同，乙醇的酶法測定分為二種乙醇氧化酶法和乙醇脫氫酶法，與乙醇氧化酶法相比，乙醇脫氫酶法的專一性高，不會與甲醇和丙酮起催化反應。
—般認為氣相色譜法可作為參考方法，尤其在準確性和精密度要求高的法醫學乙醇測定中應用最廣。GC法的獨特優點在於特異、靈敏，且能同時分析多種揮發性醇類物質，如乙醇、甲醇、丙酮、乙醛和異丙醇。 其他乙醇的測定方法還有均相酶免疫分析(Homogeneous enzymeimm皿oassay)、滲透量法、呼出氣乙醇分析法；用呼出氣乙醇分析儀檢測乙醇操作簡單、快速，在交通執法部門應用較多。這類儀器中一種是根據紅外光吸收原理設計的，該法測定的乙醇濃度與酶法測得的血乙醇濃度相關性很好。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶循環倍增法(EnzymaticRecycling
& Doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法
(Couple Reaction)技術，監測還原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的
變化，得以測定乙醇濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的乙醇診斷/測定
試劑(盒)，採用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行乙
醇濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發明乙醇濃度測定方法如下 乙醇+氧酒精氧化酶乙醛+過氧化氡 乙醛+還原型輔酶酒精脫氡酶乙醇+輔酶 過氧化氫+還原型輔酶NADH過氧化物酶輔酶+2水 這種方法應用酒精氧化酶(alcohol oxidase ;EC 1. 1. 3. 13)酶(偶)聯酒精脫氫酶(alcohol dehydrogenase ;EC 1. 1. 1. 1)、膽H過氧化物酶(NADH peroxidase ;EC1. 11. 1. 1 ;EC 1. 11. 1. 2)酶促反應連續監測法。酒精氧化酶作為作用酶，功能為將乙醇酶
解產生乙醛。酒精脫氫酶作為循環酶酒精脫氫酶再將乙醛再次變回乙醇，使乙醇不斷地被
重複循環利用。酒精脫氫酶與NADH過氧化物酶作為顯色酶，將乙醛、過氧化氫與還原型輔 酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定 還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算 乙醇的濃度大小。 實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單
劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明乙醇診斷/測定試劑(盒)較為理想 緩衝液 10Ommol/L 穩定劑 500mmol/L 還原型輔酶 0. 25mmol/L 酒精氧化酶 6000U/L 酒精脫氫酶 8000U/L NADH過氧化物酶10000U/L 本發明的乙醇診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過氧化物酶。 試劑(盒)可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩衝液、穩定劑、還原型輔酶。
試劑2 緩衝液、穩定劑、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過氧化物酶。 還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過氧化物酶在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。試劑(盒)可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試 劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑l 緩衝液、穩定劑、還原型輔酶。
試劑2 緩衝液、穩定劑、酒精脫氫酶、NADH過氧化物酶。
試劑3 緩衝液、穩定劑、酒精氧化酶。 還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過氧化物酶在試劑1、試劑2或試劑3 中的位置可以不限。試劑(盒)可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成 液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定乙醇濃度的方法，其還原型輔酶可以是 NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的乙醇診斷/測定試劑為單試劑，包括[OO42]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液100mmol/L
穩定劑 500mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 酒精氧化酶 6000U/L
酒精脫氫酶 8000U/L
NADH過氧化物酶 10000U/L 試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑；使用前，加入純淨水，復溶後使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乙醇樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向
為負反應(下降反應)，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。 加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出乙醇的濃度大小。 實施例二
本實施例的乙醇診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷
穩定劑
還原型輔酶
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷穩定劑酒精氧化酶酒精脫氫酶NADH過氧化物酶
鹽酸緩衝液lOOmmol/L50mmol/L0. 25,1/L
鹽酸緩衝液lOOmmol/L500,1/L6000U/L8000U/L10000U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乙醇樣品與試劑1 、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出乙醇的濃度大小。
實施例三 本實施例的乙醇診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液lOOmmol/L
穩定劑
還原型輔酶
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷
穩定劑
酒精脫氫酶
NADH過氧化物酶
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷
穩定劑
酒精氧化酶
鹽酸緩衝液lOOmmol500,1/L6000U/L
鹽酸緩衝液lOOmmol
50mmol/L0. 25,1/L
500,1/L8000U/L10000U/L 試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。 測定乙醇濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C ，反應時間10分鐘，起始
吸光度1. 8±0. 7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乙醇樣品與試劑1、試劑2、試
劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約1分鐘左右，
檢測時間2分鐘左右。 加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出乙醇的濃度大小。 申請人:經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達到本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0005 ;吸光度時間反應曲線應呈下降曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形範圍可達20mmol/L ;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重複性)的變異係數(CV)《1% ;試劑的靈敏度可達O. 030±0. 015 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩定一年；——本發明靈敏度高、精確度好，線形範圍寬廣，穩定期長，足以便於推廣應用。
權利要求
一種利用酶循環倍增法、酶比色法及酶聯法技術的乙醇濃度測定方法，其方法如下乙醇+氧 酒精氧化酶 乙醛+過氧化氫乙醛+還原型輔酶 酒精脫氫酶 乙醇+輔酶過氧化氫+還原型輔酶 NADH過氧化物酶 輔酶+2水將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出乙醇的濃度大小測定結果。
2. —種乙醇診斷/測定試劑(盒)，主要成分包括緩衝液 20-500mmol/L穩定劑 1-4000mmol/L還原型輔酶 0. 1-0. 35mmol/L酒精氧化酶 1000——80000U/L酒精脫氫酶 1000——80000U/LNADH過氧化物酶1000——80000U/L試劑成分的濃度不一定只限於上述範圍；在此範圍內效果較好，在此範圍外，試劑仍會反應作用。其特徵在於試劑(盒)可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述乙醇診斷/測定試劑(盒)，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過氧化物酶組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述乙醇診斷/測定試劑(盒)，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過氧化物酶組成雙劑試劑；試劑1，由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶組成；試劑2，由緩衝液、穩定齊U、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過氧化物酶組成。還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過氧化物酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述乙醇診斷/測定試劑(盒)，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過氧化物酶組成多劑試劑；試劑1，由緩衝液、穩定齊U、還原型輔酶組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、酒精脫氫酶、NADH過氧化物酶組成；試劑3，由緩衝液、穩定劑、酒精氧化酶組成。還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過氧化物酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述乙醇診斷/測定試劑(盒)，其特徵在於還包括穩定劑l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一
全文摘要
本發明涉及一種利用酶循環倍增法、酶比色法及酶聯法技術的乙醇診斷/測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定乙醇濃度的方法、試劑的組成及成分，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑(盒)主要成分包括緩衝液、還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過氧化物酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出乙醇的濃度大小。
文檔編號C12Q1/26GK101762541SQ20081024426
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月10日 優先權日2008年12月10日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司