一種新型檢測評估腫瘤病人的試劑盒和方法

2023-12-09 01:51:16

專利名稱：：一種新型檢測評估腫瘤病人的試劑盒和方法
技術領域：
：本發明涉及一種非侵入性檢測、評估腫瘤病人試劑盒的新方法，其特徵是採用質譜法對樣品中已被磁珠或抗體捕獲的變異的補體蛋白C3a進行精確地鑑別、檢測的方法。本發明提供的方法能夠檢測三種不同腫瘤的病人，其靈敏度為84%,特異性為100%。
背景技術：
：隨著人類基因組計劃的實施和完成,科學家們提出了後基因組(post-genome)計劃的概念，研究要點轉移到功能基肉組學上，而生物功能主要體現物質是蛋白質。1994年，澳大利亞Macquarie大學的Wilkins和Williams首先提出蛋白質組(proteome)的概念，指的是"一種基肉組所表達的全部蛋白質"，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質。對於蛋白質組的研究是功能基丙組學研究的核心，稱為蛋白質組學(proteomics)。蛋白質組學被認為是後基丙組研究中最主要的部分。與基肉組相比，蛋白質組的組成更複雜，功能更活躍，應用前景更廣泛。蛋白質組學從細胞整體水平進行蛋白質屬性的研究，如表達水平、翻譯後修飾及相互作用等，並由此獲得對於疾病過程、細胞生理生化特徵和調控M絡的廣泛完整的認識。所以，蛋白質組學技術正在逐步成為生物學、醫學及製藥學等的重要研究手段。不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決於細胞所表達的蛋白質功能。因此，鑑定人體內表達的蛋白質的區別，可用於體外疾病樣本診斷及篩查，並最終用於藥物開發和疾病治療。而要進行蛋白質表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細胞內分子的複雜混合物的程度。但細胞內許多物質往往以微量存在，目前用於分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規手段難以進行化學結構及蛋白質序列鑑定分析。用抗體及質譜聯合可克服這一技術缺點。
發明內容本發明的目的是建立一種在生物樣品中檢測正常人與某種或多種疾病在離體血液中生物標誌的試劑盒和方法。該方法為疾病的早期檢測提供了新的途徑，並為進一步發現新的變異的生物標誌提供了基礎。本發明涉及一種非侵入性檢測、評估腫瘤病人的新方法，其特徵是採用質譜法對樣品中已被WCX/SAX磁珠或抗體捕獲的變異的補體蛋白C3a進行精確地鑑別、檢測的方法。本發明中的變異的補體蛋白C3a生物標誌是利用一臺質譜儀來發現的。該設備的質量精確度約為+/_0.1%。變異的補體蛋白C3a生物標誌物首先能夠被具有能與生物標誌物結合的抗體或磁珠基質WCX/SAX吸附表面捕獲，非吸附物能從基質上洗脫，吸附到底基的生物標誌物在飛行質譜儀中被檢測。生物標誌物通過離子發生源，如雷射，被離子化，產生的離子被一個離子感受集合器收集，然後質量分析器分析那些通過的離子。之後，檢測器將檢測的離子信息轉換為質荷比。定量性控制及質譜雷射能量調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血清中用於定量的標準峰4091.1Da或6634.0Da強度調至50%質譜信號強度的最大值。生物標誌物的檢測明顯地將與信號強度的檢測有關。這樣，生物標誌物的數量與質量都可以被檢測出來。飛行質譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析並不表示離子化能量攻擊一個樣本產生的單獨的脈衝信號，而是一系列脈衝的信號之和。這樣降低了幹擾，並增加了動態範圍。該飛行時間數據受數據處理軟體的影響。軟體中數據處理主要包括轉換飛行時間與質荷比而產生質譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。通過對生物標誌物的吸附和檢測而產生的數據可利用計算機的數據分析程序進行分析。該電腦程式分析這些數據以顯示檢測出的標記物的數量，並顯示信號的強度和確定被檢測的每個生物標誌物的分子量。數據分析還能包括一系列的確定生物標誌物的信號強度和矯正數據對預定統計分布狀態的偏離。例如，通過計算與某些參數相關的每個峰值的高度，可規範觀測到的峰。該參數可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學成分產生的不重要的^^擾，這可以設置調零。計算機可以將計算結果數據轉換成各種形式來表現。其標準譜可以表示，但在一種形式中只有峰高和質量信息可以在譜帶中保留，產生一個較清晰的圖，並使具有幾乎相同分子量的生物標誌物更易顯現。在另一種形式中，兩個或更多的譜比較，便於突顯獨特的生物標記物和那些高於或低於校準樣本的生物標誌物。分析一般包括展示從待分析物得到的信號的圖譜中峰的鑑定。峰可以通過視圖進行選擇，軟體是可用的，它可自動檢測峰。一般情況下，該軟體通過鑑定信號具有信噪比高於一個選擇閾值並標記出在峰信號的質心處的峰的質量這樣的方式操作。在一個有效的程序中，比較許多譜線以認定出現在質譜中某一選定範圍內同樣的一些峰。該軟體的一個版本聚集所有出現在確定的質量範圍內的各條光譜的峰，對所有在質量(質荷比)中值附近的峰指定一個質量(質荷比)簇。對生物標誌的檢測需要將一個樣本放基質的一個吸附點上，接著進行清洗。向吸附點上加入SINAPINIC酸等並讓其乾燥。而後，用質譜測定法對基質進行分析，而一個顯示了蛋白質分子的遺留物圖將生成，這張圖是在蛋白質分子的質量-電荷比的基礎上，以彼此分開的峰圖的形式顯示出來的。因為本項發明中的生物標記是通過質量和抗體來標識的，因而它們可通過質譜測定法進行檢測而直接知道它們特定的身份。這種方法比抗體為基礎的ELISA及免疫螢光法更準確。然而，如果有必要，這些生物標誌也可通過，比如，確定多肽的胺基酸序列來進行鑑別。例如，一個生物標誌能用許多酶描繪出來，例如V8蛋白酶(V8protease)或胰蛋白酶，而且消化片段(digestionfragments)的分子量可被用來在資料庫中搜索序列，這些序列與由多種酶生成的消化片斷的分子量相吻合。或者，如果此生物標誌不是已知資料庫中的蛋白質分子，在生物標誌的N極胺基酸序列(N-terminalAminoAcidSequence)的基礎上，可使用降解探針，而後，這些探針會被用來描繪由探測到了生物標誌的樣本所生成的基閒組或cDNA庫。最後，蛋白質生物標誌可用蛋白質梯狀排序法(proteinladdersequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片並將碎片用酶解作用或其他可按順序從碎片末端除去一個單個胺基酸分子的方法進行處理後，可生成蛋白質梯度(proteinladders)。然後，用質譜對此梯度進行分析。階梯狀碎片(ladderfragments)在質量上的差異可鑑別出從分子末端被除去的胺基酸。特異性是指某一物質或某種疾病的專一屬性，它是代表某種物質或某種疾病的特徵。通過某些特徵可以識別某種物質或某種疾病，從而把它和其他物質或疾病區分開來。對專有特徵的識別往往依賴於特殊的檢測方法，例如要了解某種疾病是否存在有特異性抗原就要用有關特異性抗體來檢測。自蛋白質組學研究有新發展以來，這種傳統意義上特異性檢測和界定方法有了很大的突破。如一個蛋白質不同片段變異是不同類型腫瘤的標誌。根據基因到蛋白質表達的複雜過程，一種特異性基閒的產物一蛋白質必定有相關多組分蛋白質的表達。通過對這些不同組分的檢測形成一個綜合模式圖(蛋白指紋圖譜)，將這種圖譜(如某種腫瘤)與其他圖譜(如正常人或其他疾病)相比較，進而識別這種特異蛋白(如腫瘤抗原或其片段)，從而將正常人與忠某種疾病病人血液區分開來。將來自具有統計意義腫瘤病人群的樣品與對照組(正常樣品)比較，用WCX磁珠所捕獲的893S土15Da峰或抗補體蛋白C3a抗體吸附表面所捕獲的變異的補體蛋白C3a生物標誌是一致的。抗補體蛋白C3a的抗體吸附表面所捕獲的新型變異的補體蛋白C3a或用WCX磁珠所捕獲的8938i15Da峰的試劑盒可檢測、評估腫瘤病人。本發明提供方法能夠檢測人群中三種不同腫瘤的病人肝癌病人、乳腺癌病人、腸癌病人，其靈敏度為84%,特異性為100%。所述的變異的補體蛋白C3a化學結構(76個胺基酸)Ser—Val—Gln—Leu—Thr—Glu—Lys—Arg—Met—Asp—Lys—VaJ—Gly—Lys—Tyr—Pro—Lys—Glu—Leu—Arg-Lys-Cys-Cys-Glu-Asp-Gly-Met-Arg-Glu-Asn-Pro-Met-Arg-Phe-Ser-Cys-Gin-Arg-Arg-Thr-Arg-Phe-Ile-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Cys-ILys-Lys-Val-Phe-Leu-Asp-Cys-Cys-Asn-Tyr-Ile-Thr-Glu-Leu-Arg-Arg-Gln-His-Ala-Arg-Ala-Ser-His-Leu-Gly-Leu-Ala。具體操作步驟以下是用本發明提供的一個操作方案實例。1.樣品處理及標準化質控血清製備將生物樣品稀釋在稀釋緩衝溶液中，視需要離心澄清樣品。質譜的標準化質控血清製備定義符合如下標準供血者10人，5男5女，血型為0型；年齡為18-30歲；民族漢。生化指標正常，包括總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、B肝表面抗原、肝功檢査、腎功檢査；無遺傳病家族史無重大傳染病史。女性不能懷孕，男性為不吸菸者。2.樣品上樣將質譜的標準化質控血清及樣品點樣在磁性珠子(磁珠)f乍為支持物的基質上[a.可用WCX或SAX基質的磁珠，陰離子表面(WCX，WeakCationicExchanger,—羧酸基團)基質磁珠(實施例l)及陽離子表面(SAX,StrongAnionicExchanger,一氨基基團)；或用b.已標記上抗補體蛋白C3a的抗體基質的磁珠(實施例2)]。可以將質譜的標準化質控血清用於質譜的定量方法。基質的支持物可以是陶瓷珠、磁性珠、多聚體或S印harosebeads。3.洗滌用結合緩衝液洗滌。在樣品完全千燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重複以上步驟。0.52%三氟乙酸徹底洗滌整個磁珠陣列點，將生物標誌洗脫至質譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然乾燥金屬片，加0.5pL吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的製備的標準溶液)。吸能分子可用Sinapinicacid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamicacid等。4.質譜的定量控制及測試試劑盒用雷射解吸/離子化飛行時間質譜儀，用氮雷射儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析滯留與各位點的生物標誌或蛋白質。用計算機分析數據進行數據重疊展示。用質譜峰8938土15Da檢測三種不同腫瘤肝癌病人、乳腺癌病人、腸癌病人的試劑盒。定量性質譜調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血清中用於定量的標準峰4091.1Da或6634.0Da強度調至50%信號強度的最大值。將來自具有統計意義腫瘤病人群的樣品與對照組(正常樣品)比較，用WCX磁珠所捕獲的893Si15Da或抗補體蛋白C3a的抗體吸附表面所捕獲的變異的補體蛋白C3a生物標誌是一致的。抗補體蛋白C3a的抗體吸附表面所捕獲的新型變異的補體蛋白C3a或用WCX磁珠所捕獲的8938土15Da的試劑盒可檢測、評估腫瘤病人。本發明提供方法能夠檢測人群中三種不同腫瘤的病人肝癌病人、乳腺癌病人、腸癌病人，其靈敏度為84%，特異性為100%。所述的變異的補體蛋白C3a化學結構(1-76個胺基酸)(實施例3變異的補體蛋白C3a的排序鑑定)Ser-Val-Gln-Leu-Thr-Glu-Lys-Arg-Met-Asp-Lys-Val-Gly-Lys-Tyr-Pro-Lys-Glu-Leu-Arg-Lys-Cys-Cys-Glu-Asp-Gly-Met-Arg-Glu-Asn-Pro-Met-Arg-Phe-Ser-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr-Arg-Phe-Ile-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Cys-Lys-Lys-Val-Phe-Leu-Asp-Cys-Cys—Asn-Tyr-Ile-Thr-Glu-Leu-Arg-Arg-Gln-His-Ala-Arg-Ala-Ser-His-Leu-Gly-Leu-Ala。己知變異的補體蛋白C3a化學結構,可ffl於製備其抗體(實施例4變異的補體蛋白C3a抗體的製備)。本發明與其他非侵入性的體外檢測方法比較，具有以下的特點(1)準確及精確用抗體及質譜聯合精確檢測多種生物標誌方法的一個特點是能夠從複雜的樣品混合物中準確地分辨出分析物。抗體與抗原結合的準確率超過95%。這是ELISA及免疫螢光試劑盒等的基楚。質譜直接分析有很強的精確性，一般誤差率只有0.1Da。因為蛋白質是由胺基酸組成的，而胺基酸的平均質量是己知的，如果知道了抗原或生物標誌的總分子量，那麼抗原的變異(指胺基酸變化)就很容易被推測出來。但ELISA及免疫螢光試劑盒無法知道抗原的變異。所以，用抗體及質譜聯合精確檢測生物標誌方法可提供被分析物(抗原或生物標誌)化學或結構特徵的直接信息。舉例己知纖維蛋白肽A分子的分子量為1536Da，化學結構為16個胺基酸(N端Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端)。纖維蛋白肽A的抗體與質譜儀聯合應用發現分子量為1536Da的纖維蛋白肽A。則100%可確定被分析物是纖維蛋白肽A,即最精確鑑別(金標準)。用纖維蛋白肽A的抗體與質譜儀聯合應用發現被分析物是分子量為1465±1Da變異的纖維蛋白肽A。則化學結構可以(從N端至C端)推測為15個胺基酸N端Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端。(2)方便本方法將蛋白質分成了陰離子、陽離子、抗體作用的蛋白質。這樣，可用質譜儀直接進行分析。蛋白質被鑑定以後可以用數碼格式(條碼帶)永遠地保留下來。這樣可以節省標本庫的面積。(3)快捷用本發明提供的已知抗體及質譜聯合精確檢測生物標誌方法進行疾病血清檢測時，無需對蛋白質進行測序即可知"變異的生物標誌"。不像免疫螢光法試劑盒，無法知道"變異的生物標誌"。用本發明提供的蛋白指紋法進行疾病血清診斷時，無需對蛋白質進行測序。本發明提供試劑盒的方法能夠同時檢測三種不同腫瘤的病人(附畜病人、乳腺癌病人、腸癌病人)，其靈敏度為84%，特異性為100%。具體實施例方式本發明將結合具體實施例作進一步說明，這些實例僅用於說明目的，而不用於限制本發明範圍。實施例1一種新型檢測評估腫瘤病人的試劑盒和方法(1)實驗方法一、材料1.標本來源A.50例正常人對照組的血清；B.75例三種不同腫瘤的病人的血清。2.質量控制A.人標準化質控血清B.質譜雷射能量調控每次測試前，用上述標準化質控血清。二、方法1.樣品的收集全血採集後吸取血清，置於一8(TC保存；-8(TC冰箱中取出血清樣品，置冰盒上融解；以10，000轉/分，4t:離心2分鐘；取上清液。2.樣品的準備每個吸附劑基質支持物點需要血清2.5W，將血清用2倍體積U9緩衝液(9MUrea,2%C,S，50mMTris-HCL,pH9.0)稀釋(例如:10W血清用20W緩衝液稀釋)。將樣品充分混勻。將30W上述樣品加入370W相應的結合緩衝液，使得血清的總稀釋倍數達到約40倍。將處理好的血清樣品IOOW上樣到吸附劑基質上。3.樣品檢測上樣，在WCX基質磁珠陣列點中加入100W處理好的樣品，置振蕩器，400-600轉/分，4'C震蕩1小時。甩出樣品，每孔加入200W的結合緩衝液50mMNaAC,pH4.0-5.0。室溫置振蕩器400-600轉/分，震蕩5分鐘，甩去孔中液體，再次加入結合緩衝液200W，重複操作一次。每孔加入200WHPLC水，立刻甩出。0.5%三氟乙酸徹底洗滌整個WCX磁珠陣列點，將生物標誌洗脫至質譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然千燥金屬片，加0.5吸能分子SINAPINIC酸(以50%乙腈，0.5%二氟乙酸的製備的標準溶液)。4.將上述樣品加入質譜中，就會生成質譜蛋白指紋峰。外部使用多肽分子質量標準來校正質量精確性。(2)實驗結果用統計學方法，通過分析血清蛋白指紋峰，發現下述一種分子量為8938i15Da蛋白指紋可以用於區分正常人血清、腫瘤病人的血清tableseeoriginaldocumentpage1050例正常人對照組的血清陰性22例肝癌病人的血清陽性21例乳腺癌病人的血清陽性20例腸癌病人的血清陽性發現分子量為8938i15Da蛋白指紋的變化對於鑑別腫瘤病人具有重要意義。通過這個峰的鑑別，本實驗中25例肝癌病人的血清樣品中有22例被準確的檢出；25例乳腺癌病人的血清樣品中有21例被準確的檢出；25例腸癌病人的血清樣品中有20例被準確的檢出。此結果表明，該方法的靈敏度為84%(63/75)，特異性100%(50/50)。查已知cDNA資料庫中的補體蛋白C3a分子的分子量(77個胺基酸時，分子量為9094Da，pI9.5):Ser-Val-Gln-Leu-Thr-Glu-Lys-Arg-Met-Asp-Lys-Val-Gly-Lys-Tyr-Pro-Lys-Glu-Leu-Arg-Lys-Cys-Cys-Glu-Asp-Gly-Met-Arg-Glu-Asn-Pro-Met-Arg-Phe-Ser-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr-Arg-Phe-Ile-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Cys-Lys-Lys-Val-Phe化eu-Asp-Cys-Cys-Asn-Tyr-Ile-Thr-Glu-Leu-Arg-Arg-Gln-His-Ala-Arg-Ala-Ser-His化eu-Gly-Leu-Ala-Arg實施例2血液中變異的補體蛋白C3a分子鑑定用Carbodiimide方法(CarbodiimideMethod)將帶有羧酸基團標記的磁性珠上基質與抗補體蛋白C3a抗體的氨基基團結合(GunnDL，etal.PreparationofsensitiveandstableerythrocytesbythecarbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JImmunolMethods.1972;1(4):381-389.)。將樣品點樣在一個抗補體蛋白C3a抗體基質的位點上。用結合緩衝液洗滌。在樣品完全下燥前將第一份洗漆溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重複以上步驟。用1%三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點，將生物標誌洗脫至質譜專ffl金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然千燥金屬片，加0.5Sinapinicacid吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的製備的標準溶液)。用質譜儀，用氮雷射儀(337nra)和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析各位點的生物標誌或蛋白質。用計算機分析數據進行數據重疊展示。(3)實驗結果用抗補體蛋白C3a抗體基質與質譜儀聯合應用發現被分析物是分子量與實施例1一致，而非已知cDNA資料庫中的血液中補體蛋白C3a分子的分子量(9094Da)。則8938土15Da化學結構可以推測為變異的補體蛋白C3a(76個胺基酸，C端切除精氨酸，Arginine):Ser-Val-Gln-Leu-Thr-Glu-Lys-Arg-Met-Asp-Lys-Val-Gly-Lys-Tyr-Pro-Lys-Glu-Leu-Arg-Lys-Cys-Cys-Glu-Asp-Gly-Met-Arg-Glu-Asn-Pro-Met-Arg-Phe-Ser-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr-Arg-Phe-11e-Ser《eu-Gly-Glu-Ala-Cys-Lys化ys-Val-Phe-Leu-Asp-Cys-Cys-Asn-Tyr-Ile-Thr-Glu-Leu-Arg-Arg-Gln-His-Ala-Arg-Ala-Ser-His-Leu-Gly-Leu-Ala。發現下述變異的補體蛋白C3a可以用於區分正常人血清、腫瘤病人的血清tableseeoriginaldocumentpage1250例正常人對照組的血清陰性22例肝癌病人的血清陽性21例乳腺癌病人的血清陽性20例腸癌病人的血清陽性實施例3變異的補體蛋白C3a的排序鑑定將8938i15Da生物標誌用多級質譜(MS/MS)、源後裂解(PSD)及蛋白質梯狀排序法(proteinladdersequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片，可生成蛋白質梯度(proteinladders)。然後，用質譜對此梯度進行分析。鑑別出8938i15Da生物標誌為變異的補體蛋白C3a。其化學結構為(從N端至C端排列為76個胺基酸，C端切除第77個精氨酸，Arginine):N端Ser-Val-Gin-Leu-Thr-Glu-Lys-Arg-Met-Asp-Lys-Val-Gly-Lys-Tyr-Pro-Lys-Glu-Leu-Arg-Lys-Cys-Cys-Glu-Asp-Gly-Met-Arg-Glu-Asn-Pro-Met-Arg-Phe-Ser-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr-Arg-Phe-Ile-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Cys-Lys-Lys-Val-Phe-Leu-Asp-Cys-Cys-Asn-Tyr-Ile-Thr-Glu-Leu-Arg-Arg-Gln-His-Ala-Arg-Ala-Ser-His-Leu-Gly-Leu-AlaC端。用實施例2"血液中變異的補體蛋白C3a分子鑑定"，即抗體及質譜聯合，可省去變異的補體蛋白C3a的排序鑑定。實施例4變異的補體蛋白C3a抗體的製備變異的補體蛋白C3a的合成及序列N端Ser-Val-Gln-Leu-Thr-Glu-Lys-Arg-Met-Asp-Lys-Val-Gly-Lys-Tyr-Pro-Lys-Glu-Leu-Arg-Lys-Cys-Cys-Glu-Asp-Gly-Met-Arg-Glu-Asn-Pro-Met-Arg-Phe-Ser-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr-Arg-Phe-Ile-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Cys-Lys-Lys-Val-Phe-Leu-Asp-Cys-Cys-Asn-Tyr-Ile-Thr-Glu-Leu-Arg-Arg-Gln-His—Ala-Arg-Ala-Ser-His-Leu-Gly-Leu-AlaC端。將合成的變異的補體蛋白C3a免疫小鼠，待免疫反應出現後，從外周血中分離B細胞。用溶血噬菌斑分析法選擇並分離出能分泌所需抗體的單個淋巴細胞。將單個細胞擴增至1X10'個以上，用QuickmRNAPurificationKit提取mRNA。以提取的mRNA為模板，合成cDNA鏈。以此cDNA為模板，加入鼠抗體重鏈可變區(V)通用引物，輕鏈可變區(V,)通用引物，進行聚合酶鏈反應，獲得擴增的Vu基因片段和V,基因片段。將擴增產物在15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑑定和分離。用glassmilk回收擴增的Vn基岡片段和V,.基因片段。與等摩爾嘗試的LimkerPrimerMix混合，進行聚合酶鏈反應，逢接Vh和Vl。擴增產物分離純化後，獲得特異性單鏈抗體(ScFV)。此ScFV可用於製備檢測所需DNA片。將此擴增產物兩端加限制性酶切位點，純化定量後，連接到P""載體上。將連接產物轉化感染大腸桿菌TOPIO。經藍白斑篩選及酶切鑑定，篩選出重組質粒。在96孔板形成單克隆抗體。用ELISA法篩選出效價最高的單克隆抗體株，大量製備，並從培養上清中提取所需抗體。此抗體可用於製備檢測所需試劑盒。結論將來巨具有統計意義腫瘤病人群的樣品與對照組(正常樣品)比較，用WCX磁珠所捕獲的8938i15或抗補體蛋白C3a的抗體吸附表面所捕獲的變異的補體蛋白C3a生物標誌是一致的。抗補體蛋白C3a的抗體吸附表面所捕獲的新型變異的補體蛋白C3a或用WCX磁珠所捕獲的8938i15Da的試劑盒可檢測、評估腫瘤病人。本發明提供方法能夠檢測三種不同腫瘤的病人，其靈敏度為84%，特異性為100%。本方法用WCX基質、補體蛋白C3a的抗體吸附表面基質及質譜法進行鑑別檢測發現一種新型變異的補體蛋白C3a。變異的補體蛋白C3a可用於腫瘤病人的檢測及評估。通過WCX基質及被抗體吸附表面基質上捕獲的變異的補體蛋白C3a，用標準化質控血清控制下的定量性質譜分析來檢測，可以應用到已經脫離人體的體液中的生物標誌組合的檢測方法或試劑盒開發。本方法準確、方便且快捷。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。權利要求1.本發明涉及一種檢測、評估腫瘤病人的試劑盒和新方法，其特徵是採用質譜法對樣品中已被基質捕獲的變異的補體蛋白C3a生物標誌進行精確地鑑別、檢測的方法。該方法通過以下步驟實現；(1)樣品處理及質譜標準化質控血清製備；(2)樣品上樣至磁珠基質上；(3)洗滌；(4)質譜的定量控制及質譜檢測；其中所述步驟(1)將生物樣品稀釋在稀釋緩衝溶液中。用O型血，男女相等，混合製備質譜的標準化質控血清；所述步驟(2)將質譜的標準化質控血清及樣品點樣在磁珠基質上。所述步驟(3)用結合緩衝液洗滌。在樣品完全乾燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重複以上步驟。用0.5～2％三氟乙酸徹底洗滌磁珠，將生物標誌洗脫至質譜專用的金屬片上，自然乾燥金屬片，加0.5μL以50％乙腈，0.5％二氟乙酸製備的吸能分子標準溶液。吸能分子可用Sinapinicacid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamicacid等；所述步驟(4)用雷射解吸/離子化飛行時間質譜儀，用氮雷射儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析變異的補體蛋白C3a生物標誌。用計算機分析數據為8938±15Da峰值。定量性質譜調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血清中用於定量的標準峰4091.1Da或6634.0Da強度調全50％信號強度的最大值。2.權利要求1所述變異的補體蛋白C3a生物標誌試劑盒和分析方法，所捕獲的變異的補體蛋白C3a或8938土15Da生物標誌來源於已經脫離人體的全血、血清和血漿。3.權利要求l所述的基質包含陰離子表面基質、陽離子表面基質、抗變異的補體蛋白C3a抗體基質及其試劑盒用途。基質的支持物包含陶瓷珠、磁性珠、多聚體或S印harosebeads。4.一種權利要求1所述的生物標誌的用途，其特徵在於，用於製備變異的補體蛋白C3a的抗體及用質譜峰8938i15Da檢測三種不同腫瘤肝癌病人、乳腺癌病人、腸癌病人的試劑盒。5.—種權利要求4所述的檢測變異的補體蛋白C3a的試劑盒，其特徵在於，tT包括一容器以及裝於容器中的權利要求4所述的檢測變異的補體蛋白C3a的抗體(組)。6.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵於，所述的抗體(組)為單克隆抗體(組)或多克隆抗體(組)。7.—種權利要求1所述的變異的補體蛋白C3a的化學結構(1-76個胺基酸)Ser-Val-Gln-Leu-Thr-Glu-Lys-Arg-Met-Asp-Lys-Val-Gly-Lys-Tyr-Pro-Lys-Glu-Leu-Arg-Lys-Cys-Cys-Glu-Asp-Gly-Met-Arg-Glu-Asn-Pro-Met-Arg-Phe-Ser-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr-Arg-Phe-Ile-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Cys-Lys-Lys-Val-Phe-Leu-Asp-Cys-Cys-Asn-Tyr-Ile-Thr-Glu-Leu-Arg-Arg-Gln-His-Ala-Arg-Ala-Ser-His-Leu-Gly-lveu-Ala。全文摘要本發明涉及一種檢測、評估腫瘤病人的試劑盒和新方法，為一種非侵入性生物標誌蛋白的體外檢測方法。本方法用抗體吸附表面基質及質譜法進行鑑別檢測發現一種新型變異的補體蛋白C3a。變異的補體蛋白C3a或8938±15Da峰值可用於腫瘤病人的檢測及評估。本發明提供方法能夠同時檢測三種不同腫瘤的病人，其靈敏度為84％，特異性為100％。通過8938±15Da峰值或被抗體吸附表面基質上捕獲的變異的補體蛋白C3a，用標準化質控血清控制下的定量性質譜分析來檢測，可以應用到已經脫離人體的體液中的生物標誌組合的檢測方法或試劑盒開發。本方法準確、方便且快捷。文檔編號G01N33/543GK101165489SQ20061014051公開日2008年4月23日申請日期2006年10月16日優先權日2006年10月16日發明者洋許申請人:洋許