一種檢測腫瘤相關基因的方法

2023-12-09 04:56:51 1

專利名稱：一種檢測腫瘤相關基因的方法
技術領域：
本發明屬生物化學及分子生物學領域，具體涉及一種檢測腫瘤相關基因的方法。
相關文獻有(1)Leon，S.A.，Shapiro，B.，Sklaroff，D.M.，et.al.，Free DNA in the serum of cancerpatients and the effect of therapy.Cancer Res.，37646-650，1977.
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本發明通過對腫瘤患者如肺癌患者血漿中分離純化DNA，用PCR方法進行檢測其中P16基因表達的改變，為臨床預測和預後分析提供參考資料。
本發明方法通過下述方法和步驟進行，1)取腫瘤患者血漿標本肝素抗凝，離心後，血漿保存備用；2)分離純化提取血漿DNA；取備用血漿直接加等量生理鹽水，重複加入Tris-飽和酚和氯仿∶異戊醇混合液，混勻、分層後，離心，取上層液；再加入氯仿∶異戊醇混合液，混勻、分層後，離心取上層液，加冷無水乙醇和乙酸鈉(pH5.2)混勻，冰箱過夜。次日離心，棄上清，加乙醇洗滌，離心棄上清，自然乾燥，乾燥管內加雙蒸水溶解沉澱DNA，用核酸測定儀定量DNA，並計算吸光度A260/A280的比值。
3)PCR方法檢測P16外顯子2基因表達。
P16外顯子2基因的引物序列為5`--TGGCTCTGACCATTCTGT(Sense)，5`--AGCTTTGGAAGCTCTCAG(Antisense)，取樣本DNA，Taq酶，PCR反應儀(P.E.-TC1.美國公司生產)進行反應，反應條件94-95℃變性3-5分鐘；按94-95℃45-60秒、55-60℃45-60秒、72℃1分鐘，40-45個循環後，72℃延伸5-10分鐘。同時用β-actin基因作內參照，其引物序列為5``--ATCATGTTTGAGACCTTCAACA(Sense)，5`--CATCTCTTGCTCGAAGTCCA(Antisense)。PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳，圖象分析。
本發明方法特異性高，能為臨床預測和預後分析提供參考資料，並且操作簡單，成本低，可在一般實驗室開展。
其中，M是100bp DNA Ladder Marker(Promega公司)，4、6、8為P16外顯子2基因缺失肺癌患者血漿標本，1-3，5-7為P16外顯子2基因表達肺癌患者血漿標本。
分離純化提取血漿DNA 取出備用血漿，室溫融化，加入等量生理鹽水，分管1ml/每管。分別加入Tris-飽和酚250ul和250ul氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分混勻至乳白色，置4℃30分鐘待分層後，在4℃離心儀上，以12000rpm離心15分鐘，吸取上層液放入新管；再加入Tris-飽和酚250ul和250ul氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分混勻至乳白色，置4℃30分鐘待分層後，在4℃離心儀上，以12000rpm離心15分鐘，吸取上層液放入新管；再加入500ul氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分混勻至乳白色，置4℃20分鐘待分層後，在4℃離心儀上，以12000rpm離心15分鐘，吸取上層液放入新管；每管400ul分別加入1ml冷無水乙醇和200ul3M乙酸鈉(pH5.2)混勻，置-20℃冰箱過夜。次日在4℃離心儀上，以12000rpm離心15分鐘，棄去上清液，加入75％乙醇1ml洗滌，在4℃離心儀上，以12000rpm離心15分鐘，棄去上清液，用紙吸乾管口液體後，在超淨工作檯上風機自然乾燥。乾燥的管內分別加入雙蒸水溶解沉澱DNA，應用eppendrof核酸測定儀定量DNA，並計算吸光度A260/A280的比值。
PCR方法檢測P16外顯子2基因PCR反應總體積為25ul，反應體系為10×PCR buffer2.5ul，內含15mM氯化鎂，dNTPs其中dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mM，P16外顯子2基因的引物序列為5`--TGGCTCTGACCATTCTGT(Sense)，5`--AGCTTTGGAAGCTCTCAG(Antisense)，濃度均為50pMol.各取1ul，樣本DNA量為1ug左右，Taq酶2單位，加雙蒸水至25ul。石蠟油20ul封蓋液體。在PCR反應儀(P.E.-TC1.美國公司生產)上，94℃變性5分鐘後；按94℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃1分鐘，40個循環；72℃延伸10分鐘。同時用β-actin基因作內參照，其引物序列為5`--ATCATGTTTGAGACCTTCAACA(Sense)，5`--CATCTCTTGCTCGAAGTCCA(Antisense)。PCR擴增產物採用1.6％瓊脂糖凝膠(含EB)電泳，以電壓100V，電泳30分鐘。在GIS圖象分析系統上，分析PCR擴增條帶，以promega公司生產的PCR標準品為對照，P16外顯子2基因為400bp，β-actin基因為318bp。
本發明方法檢測結果表明，在58例肺癌患者血漿中分離純化DNA含量為374.0±307.2ug/ml，濃度範圍36.0～1491.0ug/ml。吸光度A260/A280的比值為0.93±0.11，其比值範圍0.71～1.17。在58例肺癌患者血漿中β-actin基因表達率為100％(58/58)。P16基因的表達率為43.1％(25/58)。其中肺腺癌的表達率為21.7％(5/23)，肺鱗癌為61.5％(16/26)，腺鱗癌混合型為44.4％(4/9)。按分期，其中I期肺癌患者血漿中P16基因的表達率為30％(6/20)，II期患者的表達率為54.5％(6/11)，III期的表達率為47.8％(11/23)，IV期為25％(1/4)。在對照組10例心臟科患者血漿中β-actin基因表達率為90％(9/10)。P16基因的表達率為90％(9/10)。經統計學分析，肺癌患者血漿中P16基因的表達率明顯低於對照組心臟科患者(P＜0.05)。
結果證實本發明方法可利用腫瘤患者的血漿或血清中分子信息抑癌基因P16外顯子2表達的變化，判斷腫瘤患者治療效果及復發轉移。
權利要求
1.一種檢測腫瘤相關基因的方法，其特徵是採用PCR方法檢測血漿DNA中P16基因表達。
2.按權利要求1所述的檢測腫瘤相關基因的方法，其特徵是所述的血漿是腫瘤患者血漿。
3.按權利要求1和2所述的檢測腫瘤相關基因的方法，其特徵是通過下述步驟進行，1)取腫瘤患者血漿標本肝素抗凝，離心後，血漿保存備用；2)分離純化提取血漿DNA；3)PCR方法檢測P16外顯子2基因表達
4.按權利要求3所述的檢測腫瘤相關基因的方法，其特徵是所述的分離純化提取血漿DNA中，取備用血漿直接加等量生理鹽水，重複加Tris-飽和酚和氯仿∶異戊醇混合液後，再加氯仿∶異戊醇混合液後，加冷無水乙醇和乙酸鈉pH5.2。
5.按權利要求3所述的檢測腫瘤相關基因的方法，其特徵是所述的P16外顯子2基因的引物序列為5`--TGGCTCTGACCATTCTGT，5`--AGCTTTGGAAGCTCTCAG，內參照β-actin基因引物序列為5`--ATCATGTTTGAGACCTTCAACA，5`--CATCTCTTGCTCGAAGTCCA。
6.按權利要求3所述的檢測腫瘤相關基因的方法，其特徵是所述的PCR反應條件為94-95℃變性3-5分鐘，按94-95℃45-60秒、55-60℃45-60秒、72℃1分鐘，40-45個循環後，72℃延伸5-10分鐘。
7.按權利要求3所述的檢測腫瘤相關基因的方法，其特徵是所述的PCR反應條件為94℃變性5分鐘，按94℃60秒、55℃60秒、72℃1分鐘，40個循環後，72℃延伸10分鐘。
全文摘要
本發明屬生物化學及分子生物學領域，具體涉及一種檢測腫瘤相關基因的方法。本發明通過對腫瘤患者血漿中分離純化DNA，用PCR方法檢測其中P16基因表達的改變。本發明方法特異性高，可判斷腫瘤患者治療效果及復發轉移，能為臨床預測和預後分析提供參考資料，並且操作簡單，成本低，可在一般實驗室開展。
文檔編號C12Q1/68GK1439724SQ0311595
公開日2003年9月3日 申請日期2003年3月21日 優先權日2003年3月21日
發明者包國良, 董強剛 申請人:上海市胸科醫院