一種雙競爭法適配體檢測試紙條及其應用的製作方法

2023-12-09 10:04:01 2

本發明涉及生物醫學檢測領域，具體而言，涉及一種雙競爭法適配體檢測試紙條及其應用。

背景技術：

核酸適配體(Aptamer)是一種單鏈的寡核苷酸，多為單鏈DNA，長度在10～100bp之間，通常是利用特異的靶標從隨機序列的寡核苷酸文庫中通過體外篩選獲得，作為一種新型生物識別分子，可以與靶標物質高親和力特異性結合。目前文獻報導的已經篩選到適配體的靶標有幾百種，建立的基於適配體的檢測方法主要包括比色法、螢光法、電化學等上百種方法，但到目前為止基於適配體的商品化的檢測產品還幾乎沒有。

膠體金免疫層析試紙條技術是目前最常見最成熟也最受歡迎的快速檢測產品形式之一，被廣泛應用與臨床診斷、食品安全以及環境分析等，比如著名的早孕試紙條、瘦肉精試紙條等。適配體作為一種特異性的識別分子，也可以被用來開發基於試紙條形式的快速檢測產品，但是目前有關適配體試紙條的文獻報導卻很少，僅有幾篇文獻。這些文獻一般採用的原理是在試紙條檢測線處固定適配體的互補鏈，樣品中含有靶標時，標記有螢光或膠體金的適配體和樣品中的靶標結合，則不能和試紙條檢測線處的互補鏈結合，檢測線處螢光信號降低或不出信號；反之，樣品中沒有靶標時，標記有螢光或膠體金的適配體流經試紙條時和檢測線處的互補鏈結合，檢測線處出現較強的信號，從而根據螢光或膠體金信號大小判斷樣品中靶標含量。

然而，在實際的應用中，由於該檢測方法的原理主要是基於適配體-靶標和適配體-互補鏈的競爭來實現的，因此很難設計比較可靠的檢測方法。由於不同適配體長度不同，因此其互補鏈的長度也不同，從而適配體與互補鏈的的親和力也不同。由於適配體鏈一般比較長，所以適配體與互補鏈的親和力經常大於適配體與靶標的親和力，從而導致無法檢測；目前文獻的解決方法都是通過將互補鏈截短，僅將部分互補鏈固定到檢測線上，從而降低互補鏈和適配體的親和力，但是這種方法需要繁雜的摸索，且互補鏈長度過短時適配體無法與互補鏈雜交，從而也導致無法檢測。

有鑑於此，特提出本發明。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種雙競爭法適配體檢測試紙條，以解決上述問題。

為了實現本發明的上述目的，特採用以下技術方案：

一種雙競爭法適配體檢測試紙條，所述試紙條包括底板和依次設置在底板上的樣品吸收墊、標記物墊、反應膜以及吸水墊；

所述標記物墊包被有檢測探針，所述檢測探針為標有用於顯示信號強度的指示劑的檢測靶標物的適配體；

所述反應膜上設置有檢測區和質檢區；

所述檢測區固定包被有靶標物抗原；

所述質檢區固定包被有質控探針；所述質控探針的核酸序列與所述適配體的核酸序列互補。

本發明這種雙競爭模式適配體試紙條具有設計簡單、靈敏度高、特異性強、線性範圍廣等優點，且實驗條件也更簡單，摸索起來更容易。

優選的，如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條，當所述靶標物為有機物大分子靶標時，所述靶標物抗原即為靶標物本身；

當所述靶標物為無機小分子靶標時，所述靶標物抗原為所述無機小分子靶標與載體蛋白的偶聯物。

本發明所指的大分子是指可以直接固定到膜上並暴露抗原表位的物質，小分子是指需要通過偶聯載體蛋白才能固定到膜上並暴露抗原表位的物質。

優選的，如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條，所述載體蛋白包括酪蛋白、牛血清白蛋白或雞卵清白蛋白。

雞卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)由386個胺基酸組成，分子量約43Kd。OVA作為載體蛋白可以協助小分子物質固定到硝酸纖維素膜上並暴露其抗原表位，從而利於抗原與適配體的結合。

同樣的，載體蛋白也可選用酪蛋白(Casein)或牛血清白蛋白(BSA)等。

優選的，如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條，所述質控探針通過末端修飾生物素-親和素固定到所述質控區。

優選的，如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條，所述顯示信號強度的指示劑包括螢光物質、量子點、地高辛標記探針、生物素、放射性同位素、電子緻密物質、膠體金或酶中的任一種。

優選的，如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條，所述螢光物質包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基螢光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯螢光素、5-羧基螢光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺醯氯、螢光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯並-2-氧雜-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚藍紫、亮甲酚藍、對氨基苯甲酸、赤蘚紅、酞菁、偶氮甲鹼、花青、黃嘌呤、琥珀醯螢光素、稀土金屬穴狀化合物、三雙吡啶基二胺銪、銪穴狀化合物或螯合物、二胺、雙花青苷、La Jolla藍染料、別藻藍蛋白、allococyanin B、藻藍蛋白C、藻藍蛋白R、硫胺、藻紅青蛋白、藻紅蛋白R、REG、羅丹明綠、羅丹明異硫氰酸酯、羅丹明紅、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基羅丹明異硫醇)、四甲基羅丹明和德克薩斯紅中的任一種。

優選的，如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條，所述放射性同位素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr中的任一種。

優選的，如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條，所述酶包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一種。

如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條在檢測黃麴黴毒素B1中的應用。

如上所述的雙競爭法適配體檢測試紙條檢測靶標物含量的方法，其特徵在於，包括：

1)、用試紙條檢測靶標物標準品，得到標準品在試紙條的檢測區和質控區的信號強度比值，製作靶標標準品的濃度對應信號強度比值的線性回歸曲線，計算回歸方程；

2)、用試紙條檢測待測樣品，得到待測樣品在試紙條的檢測區和質控區的信號強度比值，根據步驟1)得到回歸方程，得到所述待測樣品中靶標物的含量。

用上述的試紙條檢測靶標標準品或待測樣品，得到標準品在所述試紙的檢測區和質控區的螢光或顯色信號比值包括如下步驟：取靶標標準品或待測樣品滴加到試紙的樣品吸收墊上，10分鐘後，將試紙條放入試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3中進行檢測，分別測定檢測區和質控區的螢光或顯色信號強度；將檢測區的螢光信號強度(T)比上質控區的螢光信號強度(C)，得到T/C值，為檢測區和質控區的螢光信號比值。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：

1)、由於採用了雙競爭法，在檢測區固定靶標抗原，使得靶標-適配體與適配體-靶標抗原的親和力一致，T線可以正確反映樣品中靶標的含量，避免了原來由於適配體互補鏈親和力過大而無法設計試紙條或檢測結果不準確不穩定的問題；

2)、變原來由於適配體互補鏈親和力過大需要繁瑣優化不容易開發試紙條的劣勢為優勢，將適配體互補鏈固定到質控區，當適配體靶標複合物移動到質控區時，由於適配體與互補鏈結合力更強，因此複合物解離，適配體與互補鏈結合，作為第二重檢測提高了檢測的特異性；

3)、本方法採用T/C值對靶標濃度做標準曲線計算樣品中的靶標含量，比單獨用T線和C線計算提高了信噪比、靈敏度，擴大了檢測範圍；

4)、本發明採用雙競爭模式進一步增強了本方法的可靠性，樣品中靶標濃度高，則T線螢光強度弱C線強，若樣品中樣品濃度低，則T線螢光強度強C線弱，也就是說無論樣品中是否含有靶標，T、C中至少有一條線螢光信號較強，也如果兩條線均沒有螢光，則表明試紙條失效或檢測方法有誤，需要重新測定；

5)、本雙競爭模式適配體試紙條採用比值作為數據歸一化方法，降低了不同紙條間不同操作人員乃至不同儀器掃描的實驗誤差，將不同紙條測得的樣品值代入標準曲線，即可以達到精確定量的效果；

6)、由於採用了適配體作為識別分子，基於適配體對靶標的高親和力和高特異性，因此本發明試紙條具有高靈敏高特異性的優點；

7)、核酸適配體具有非常好的熱穩定性，因此本發明的試紙條還可以常溫儲運，具有貨架期長、結果可靠等優點；

8)、本發明避免了傳統的繁瑣的互補鏈截短優化過程，直接採用抗原和互補鏈固定，使得適配體試紙條開發更簡單，且性能更優異。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發明提供的試紙條的結構示意圖；

圖2為本申請實施例中不同濃度AFB1水溶液下檢測區和質控區處螢光強度檢測結果圖；

圖3為本申請實施例中AFB1濃度與T/C值線性關係的標準曲線；

圖4為申請實施例中用試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3分別測定不同物質檢測區和質控區處的螢光強度，進而計算出的T/C值。

附圖標記：

1 樣品吸收墊；

2 標記物墊；

3 反應膜；

4 吸水墊；

5 底板；

6 檢測區；

7 質控區；

8 待檢靶標；

9 標有用於顯示信號強度的指示劑的檢測靶標物的適配體；

10 固定包被在檢測區的靶標物抗原；

11 固定包被在質控區的質控探針。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。

實施例 檢測黃麴黴毒素B1試紙條的製備及在檢測黃麴黴毒素B1(AFB1)中的應用

一、檢測黃麴黴毒素B1試紙條的製備

1、檢測探針和質控探針的合成

分別設計合成螢光素標記的檢測探針和生物素標記的質控探針。

其中檢測探針為螢光素Cy5標記的黃麴黴毒素B1適配體；黃麴黴毒素B1適配體可以和檢測區的黃麴黴毒素B1半抗原結合，具體序列如下：

5'-Cy5-GTT-GGG-CAC-GTG-TTG-TCT-CTC-TGT-GTC-TCG-TGC-CCT-TCG-CTA-GGC-CCA-CA-3′

質控探針為生物素標記的黃麴黴毒素B1適配體的互補序列，可以與檢測探針適配體序列通過鹼基互補結合。

質控探針的核酸序列為：

5'-biotin-TGT-GGG-CCT-AGC-GAA-GGG-CAC-GAG-ACA-CAG-AGA-GAC-AAC-ACG-TGC-CCA-AC-3'

2、AFB1半抗原和載體蛋白BSA的偶聯物AFB1-BSA製備

首先經過肟化反應製備AFB1肟(AFB1-O)；然後用碳二亞胺法製備AFB1人工抗原，然後與陽離子化牛血清蛋白(C-BSA)的反應得到偶聯產物，即偶聯物AFB1-BSA。

3、製備試紙條

1)、標記物墊製備

將檢測探針包被在標記物墊(上海傑一生物技術有限公司，JY-BX101)上(包被濃度為0.02μM)，得到包被檢測探針的標記物墊,37度過夜烘乾。

2)、反應膜製備

反應膜包括檢測區和質控區。

將偶聯物AFB1-BSA按照包被濃度為5μM包被在反應膜形成檢測區；

質控探針為標記生物素的適配體的互補序列，其通過鏈酶親和素與其上的生物素偶聯形成共價鍵包被在反應膜上形成質控區，包被濃度為1μM。

3)、試紙條組裝

試紙條由樣品吸收墊(上海傑一生物技術有限公司，JY-BX111)、上述1)製備的包被檢測探針的標記物墊、上述2)製備的反應膜、吸水墊依次按照順序黏貼在底板上，且反應膜的檢測區與標記物墊相鄰，反應膜的檢質控區與吸水墊相鄰，如圖1所示。

二、試紙條檢測原理

如圖1所示，當不含黃麴黴毒素B1的樣品加入樣品吸收墊1上時，樣品在毛細作用下流動到標記物墊2，並帶著螢光標記的探針混合物一起繼續向前流動。當流動到檢測區6時，檢測探針會與檢測區6處固定的半抗原結合，經試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3檢測出高螢光強度；由於固定在標記物墊2上的檢測探針濃度較低，絕大部分被檢測區結合，只有少數在層析作用下來不及結合的會流動到質控區7與質控探針11結合，因此質控區7出現很弱的螢光強度。

如圖1所示，當含有黃麴黴毒素B1的樣品加入樣品吸收墊1上時，樣品在毛細作用下流動到標記物墊2，黃麴黴毒素B1與檢測探針(適配體)結合，並在毛細作用下一起向前流動。當流動到檢測區6時，剩餘未與黃麴黴毒素B1結合的檢測探針會與半抗原結合；樣品中的AFB1越多，結合的檢測探針也就越來越多，剩餘的游離檢測探針就會越來越少，和檢測區6半抗原結合的檢測探針也就越少，螢光強度越低。反之，樣品中的黃麴黴毒素B1越少，剩餘的游離檢測探針就會越來越多，和檢測區6處半抗原結合也就越多，螢光強度越強，AFB1濃度與檢測區6(T)的螢光強度成反比。和AFB1結合的檢測探針在液體流動下急需上行至質控區7，由於質控區7適配體互補鏈和適配體的結合力大於適配體與靶標的結合力，因此檢測探針適配體/AFB1複合物解離，檢測探針適配體結合到質控區7互補鏈上，因此樣品的靶標AFB1越多，帶到質控區7供互補鏈結合的檢測探針也就越多，螢光信號越強，反之樣品中的AFB1越少，帶到質控區7可供質控探針互補鏈結合的檢測探針適配體就越少，螢光強度越低，因此樣品中AFB1濃度與質控區7(C)螢光信號成反比。利用檢測區6螢光強度(T)和質控區7螢光強度(C)比值對AFB1濃度做標準曲線，根據回歸方程即可計算樣品中的AFB1濃度。

三、試紙條檢測方法

1)、黃麴黴毒素B1標準品滴加到試紙的樣品吸收墊上，10分鐘後，將試紙條放入試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3中，進行檢測，分別測定檢測區和質控區的螢光信號強度；將檢測區的螢光信號強度(T)比上質控區的螢光信號強度(C)，得到T/C值，製作黃麴黴毒素B1標準品的濃度對應螢光信號T/C比值的線性回歸曲線，計算回歸方程；

2)、黃麴黴毒素標準品B1替換為待測樣品，用上述試紙檢測待測樣品，記錄在所述試紙的檢測區和質控區的螢光信號比值，根據步驟(1)的回歸方程，得到待測樣品中黃麴黴毒素的濃度。

四、黃麴黴毒素B1試紙條在檢測黃麴黴毒素B1中的應用

1、檢測黃麴黴毒素B1靈敏度與線性範圍研究

配製圖2所示的不同濃度AFB1(Fermentek Ltd，AF028)水溶液，分別用實施例1製備的試紙條進行測定。

用試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3分別測定檢測區和質控區處的螢光強度。結果如圖2所示，可以看出，隨著AFB1濃度增加，檢測區處螢光強度逐漸變小，質控區螢光強度逐漸增加。利用檢測區螢光強度與質控區螢光強度比值T/C值和黃麴黴毒素B1濃度對數做標準曲線(表1)，繪製檢測黃麴黴毒素B1的標準曲線如圖3所示，結果表明，試紙條的靈敏度0.1ng/mL；線性檢測範圍為0.1ng/mL-1000ng/mL，線性回歸方程為y＝-1.8196x+5.2694，R2＝0.9846。

表1黃麴黴毒素B1標準品的檢測結果

2、特異性研究

配製濃度為100ng/mL的AFB1溶液、100ng/mL的AFM1(百靈威科技有限公司)溶液、濃度為100ng/mL的黃麴黴毒素G1和G2(百靈威科技有限公司)、濃度為100ng/mL的黃麴黴毒素B2(百靈威科技有限公司)、濃度為100ng/mL的赭曲酶毒素Ochratoxin A(OTA,Fermentek Ltd)溶液、濃度為100ng/mL的玉米赤酶烯酮Zearalenone(ZEN，百靈威科技有限公司)溶液，濃度為100ng/mL的嘔吐毒素Vomitoxin(DON，百靈威科技有限公司)，濃度為100ng/mL的磺胺二甲氧嘧啶(SDM，百靈威科技有限公司)溶液，濃度為100ng/mL的卡那黴素(KAN，百靈威科技有限公司)溶液，濃度為100ng/mL的鉛離子溶液和空白樣品分別用試紙條進行測定。

用試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3分別測定檢測區和質控區處的螢光強度，計算T/C值。結果如圖4所示，其中AFM1為AFB1代謝物，結構相似，表現出了近90％的交叉，而AFG1、AFB2、OTA、ZEN、DON等物質以及空白樣品等均不能引起檢測區處螢光變化，這也說明本方法對黃麴黴毒素B1/M1具有很好的特異性。

五、黃麴黴毒素B1試紙條在飼料樣品中黃麴黴毒素B1檢測中的應用

1、標準曲線繪製

同本實施例第一部分中檢測黃麴黴毒素B1靈敏度與檢測範圍研究中的標準曲線方法，得到的回歸方程為：0.1ng/mL-1000ng/mL，線性回歸方程為y＝-1.8196x+5.2694，R2＝0.9846，為黃麴黴毒素B1標準曲線指數回歸方程。

2、樣品提取

選擇5份經進口黃麴黴毒素B1酶聯免疫試劑盒(美國ROMER試劑盒)測定為陽性或陰性的飼料樣品，用本試紙條進行測定。首先稱取2g樣品於50mL離心管中，加入8mL正己烷和10mL70％的甲醇水溶液，振蕩5min，室溫4000轉/分離心10min；去除上層液體，取0.5mL下層液體加入0.5mL去離子水，混勻，再取混勻液體0.5mL加入0.5mL35％的甲醇水溶液，振蕩30s；取100μL進行分析(樣品稀釋倍數為20倍)。

3、樣品測定

取上述製備好的待測樣品100μL滴加到所述試紙的樣品吸收墊上，觀察樣品層析沿著硝酸纖維素膜流動，直到被上面的吸水墊吸附；10分鐘後，將試紙條放入試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3中，進行檢測，分別測定檢測區和質控區的螢光信號強度；將檢測區的螢光信號強度(T)比上質控區的螢光信號強度(C)，將得到的計算值代入上述步驟1的回歸方程，計算得到待測樣品中黃麴黴毒素B1的濃度。

4、檢測結果：

5份飼料實際樣品檢測結果如表2所示。從結果可以看出，本發明試紙條結果與進口試劑盒相比，回收率在92.7％～134.4％之間，回收率較好，說明本發明試紙條和進口試劑盒具有非常好一致性，因此可以用於實際樣品中黃麴黴毒素B1的檢測。

表2本發明試紙條檢測玉米中AFB1結果與LC-MS方法比較

最後應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；儘管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，但本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的範圍。