一種黃芩的組織培養快速繁殖方法與流程
2023-12-02 15:29:21 4
本發明涉及一種黃芩的組織培養快速繁殖方法，屬於生物繁殖
技術領域：
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背景技術：
：黃芩具有清熱解毒，鎮痛消炎等藥理作用，近年來研究表明，黃芩還具有較強的抗癌抗氧化、抗病毒抗hiv的作用，且生物安全性高等特點，使得黃芩的應用和開發受到醫學界的關注，市場需求量逐年上升，野生資源遭到掠奪性破壞，雖有栽培，但是市場仍然供不應求，加上黃芩種子出芽率低，繁殖速度慢，近年來，黃芩作為宿根花卉也逐漸用於園林綠化方面，如何快速有效繁殖黃芩成為目前制約其發展的重要因素之一。技術實現要素：本發明的目的是為了解決黃芩種子出芽率低，繁殖速度慢的問題，提供了一種黃芩的組織培養快速繁殖方法，通過組織培養的方法，縮短黃芩的培養時間，使黃芩能夠快速、大規模繁殖緩解了市場上供不應求的困境。本發明採用如下技術方案：一種黃芩的組織培養快速繁殖方法，包括如下步驟：(1)無菌外植體的獲得：將野外採集健壯新鮮的黃芩的莖，經多次漂洗後置於超淨工作檯紫外燈下照射處理10-25min，得到無菌外植體；(2)誘導培養：將無菌外植體取莖段切除葉片，將莖節段切成1-2cm節段，保留一個節，每個莖段上帶有腋芽；將切好的莖節段接種到不定芽的誘導培養基上；首先暗培養3-5天，然後在20-25℃溫度下光培養25-30天；(3)增殖培養：將長出的叢生不定芽切下，切成小的叢生芽，接種到增殖培養基中，6-7天後，叢生芽基部長出新的叢生芽，25-30天轉接一次，將新的叢生芽接種到增殖培養基中繼續增殖培養；(4)生根培養：選取生長健壯，高度為3-5cm的叢生苗切成單株接種到生根培養基中，然後置於4-5℃環境暗期培養1-2天，然後置正常環境培養，培養條件為白天20-25℃，夜間10-15℃，保持溫差5-10℃，光照為2000-3000lx，光照時間為10-12h，待無菌苗下部長出根；(5)煉苗與移栽：將步驟(4)中健壯的，葉片較多，根系壯的，根系長度大於2cm的無菌苗進行煉苗；在組培室擰松瓶蓋2-3天後打開瓶蓋3-4天，使其逐漸適應環境，並用注射器澆灌；6-7天後清洗乾淨根部的培養基，移栽入營養缽，置於光照培養箱培養5-7天，光強為2000-3000lx，照射10-12h，溫度為15-25℃；然後將其移至大棚內，遮陰。進一步的，所述步驟(1)中漂洗前用自來水衝洗2-3h；在滅菌燒杯中用70-75％的乙醇漂洗15-45s、無菌水漂洗4-6次、0.1％氯化汞消毒4-8min、再用無菌水漂洗4-6次後，將消毒並漂洗多次後的黃芩莖全部浸泡在無菌水中，用無菌濾紙吸乾多餘水分。進一步的，所述步驟(2)中的光培養條件為：光照強度為2000-3000lx，光照時間為10-12h。進一步的，所述步驟(2)中的誘導培養基為ms+1-3mg/lba+0.1-0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph為5.8。進一步的，所述步驟(3)中的增殖培養基為ms+0-0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph為5.8。進一步的，所述步驟(4)中的生根培養基為1/2ms+0.5-1mg/liaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph為5.8。進一步的，所述步驟(3)中增殖培養條件為：白天20-25℃，夜間10-15℃，保持溫差5-10℃，光照為2000-3000lx，光照時間為10-12h。步驟(1)中無菌外植體的獲得時採用紫外線照射處理誘導的不定芽明顯粗壯，且腋芽數量多；經過紫外照射處理的平均誘導率為62.37％，而不經紫外照射處理的平均誘導率僅為39.5％；步驟(2)中經過暗培養的處理明顯高了黃芩不定芽的誘導率，且不定芽芽點明顯是不進行暗培養對照組的1.5倍以上；步驟(3)中切成叢生不定芽接種增殖效果比切單株培養的增殖效果提高了1.5倍以上，其原因是小的叢生芽基部能完好的保留未完全分化或已分化的小的芽原基，而切成單株破壞了基部還未完全分化的芽原基；步驟(3)中適度的溫差促進有機物質的積累，促進植物的生長；步驟(5)中適當的擰松瓶蓋2-3天後打開瓶蓋3-4天，使得植物與外界環境逐漸適應，起到過渡期的作用，有效的提高了黃芩小苗移栽的成活率，最高能達到98.5％。本發明發方法簡單，步驟易於操作，能夠克服黃芩出芽率低、繁殖速度慢的缺點，通過組織培養的方法，建立黃芩組織培養體系，有效提高繁殖係數，促進生長，提高黃芩的繁殖力度。具體實施方式下面將結合具體實施方式對本發明作進一步的說明。實施例一：一種黃芩的組織培養快速繁殖方法，包括如下步驟：(1)無菌外植體的獲得：將野外採集的健壯新鮮的黃芩的莖，完全浸入水中，用自來水衝洗2h；取出後置於超淨工作檯上，取滅菌過的燒杯將幼苗放入，用75％的乙醇漂洗15s、無菌水漂洗4次、0.1％氯化汞消毒4min、再用無菌水漂洗4次後，用無菌濾紙吸乾多餘水分後，獲得無菌外植體進行接種；(2)誘導培養：將處理好的無菌外植體，取莖段，切除葉片，將莖節段切成1cm節段，保留一個節，每個莖段上帶有腋芽；將切好的莖節段接種到不定芽的誘導培養基上；誘導培養基為：ms+1mg/lba+0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8，誘導條件為20℃光培養，光照為2000lx，光照時間為12h，培養30天；(3)增殖培養：將長出的叢生不定芽切下，切成小的叢生芽，接種到增殖培養基中，6天後叢生芽基部會長出很多叢生芽，30天轉接一次，將新的叢生芽接種到增殖培養基中繼續增殖培養；增殖培養基為：ms+1mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8；培養條件為20℃光培養，光照為2000lx，光照時間為12h；(4)生根培養：選取生長健壯，高度在3cm的叢生苗切成單株接種到生根培養基中，生根培養基為1/2ms+0.5mg/liba+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8，25d後，無菌苗下部長出根，主根長度4cm。(5)煉苗與移栽：將健壯的，葉片較多，根系壯且根系長度大於2cm的無菌苗進行煉苗；在組培室擰松瓶蓋3天後打開瓶蓋3天，使其逐漸適應環境，期間適當用注射器澆灌少量水；6天後清洗乾淨根部的培養基，移栽入營養缽，置於光照培養箱培養5天，光強為3000lx，照射10h，溫度為15℃；之後將其移至大棚內，適當遮陰。實施例二：一種黃芩的組織培養快速繁殖方法，包括如下步驟：(1)無菌外植體的獲得：將野外採集的健壯新鮮的黃芩的莖，完全浸入水中，用自來水衝洗3h；取出放入盤子置於超淨工作檯上，取滅菌過的燒杯將幼苗放入，用70％的乙醇漂洗30s、無菌水漂洗5次、0.1％氯化汞消毒6min、再用無菌水漂洗5次後，用無菌濾紙吸乾多餘水分後，獲得無菌外植體進行接種。(2)誘導培養：將處理好的無菌外植體，取莖段，切除葉片，將莖節段切成2cm節段，保留一個節，每個莖段上帶有腋芽；將切好的莖節段接種到不定芽的誘導培養基上；誘導培養基為：ms+2mg/lba+0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8，誘導條件為25℃光培養，光照為2500lx，光照時間為12h，培養25天。(3)增殖培養：將長出的叢生不定芽切下，切成小的叢生芽，接種到增殖培養基中，一周以後，叢生芽基部會長出很多叢生芽，25天轉接一次，將新的叢生芽接種到增殖培養基中繼續增殖培養；增殖培養基為：ms+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8；培養條件為25℃光培養，光照為2500lx，光照時間為12h。(4)生根培養：選生長健壯，高度在4cm左右的叢生苗切成單株接種到生根培養基中，生根培養基為1/2ms+0.5mg/liaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8，25天後，無菌苗下部長出根，主根長度5cm。(5)煉苗與移栽：取健壯的，葉片較多，根系壯且根系長度大於4cm的無菌苗進行煉苗；在組培室擰松瓶蓋2天後打開瓶蓋4天，使其逐漸適應環境，期間可以適當用注射器澆灌少量水；7天後清洗乾淨根部的培養基，移栽入營養缽，置於光照培養箱培養6天，光強為3000lx，照射12h，溫度為20℃；之後將其移至大棚內，適當遮陰。實施例三：一種黃芩的組織培養快速繁殖方法，包括如下步驟：(1)無菌外植體的獲得：將野外採集的健壯新鮮的黃芩的莖，完全浸入水中，用自來水衝洗2h；取出放入盤子置於超淨工作檯上，取滅菌過的燒杯將幼苗放入，用75％的乙醇漂洗45s、無菌水漂洗6次、0.1％氯化汞消毒8min、再用無菌水漂洗6次後，用無菌濾紙吸乾多餘水分後，獲得無菌外植體進行接種。(2)誘導培養：將處理好的無菌外植體，取莖段，切除葉片，將莖節段切成2cm節段，保留一個節，每個莖段上帶有腋芽；將切好的莖節段接種到不定芽的誘導培養基上；誘導培養基為：ms+3mg/lba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8，誘導條件為25℃光培養，光照為3000lx，光照時間為12h，培養30天。(3)增殖培養：將長出的叢生不定芽切下，切成小的叢生芽，接種到增殖培養基中，一周以後，叢生芽基部會長出很多叢生芽，30天轉接一次，將新的叢生芽接種到增殖培養基中繼續增殖培養；增殖培養基為：ms+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8；培養條件為5℃光培養，光照為3000lx，光照時間為12h。(4)生根培養：選生長健壯，高度在5cm左右的叢生苗切成單株接種到生根培養基中，生根培養基為1/2ms+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+8g/l瓊脂粉，ph5.8，25天後，無菌苗下部長出根，主根長度4.2cm。(5)煉苗與移栽：選生長健壯的，葉片較多，根系壯且根系長度大於3cm的無菌苗進行煉苗；在組培室擰松瓶蓋3天後打開瓶蓋4天，使其逐漸適應環境，期間可以適當用注射器澆灌少量水；7天後清洗乾淨根部的培養基，移栽入營養缽，置於光照培養箱培養7天，光強為3000lx，照射12h，溫度為25℃；之後將其移至大棚內，適當遮陰。不同濃度的誘導培養基、增殖培養基和生根培養基對黃芩的組織培養過程中具有不同的影響，具體見表1-表3。表1為誘導培養基對黃芩不定芽的誘導作用由表1可知，當誘導培養基中ba含量為1-3mg/l且naa含量為0.1-0.5mg/l時對黃芩不定芽的誘導作用最佳。表2為不同濃度增殖培養基對黃芩無菌苗增殖的影響處理基本培養基naa(mg/l)生長情況1ms0不定芽生長健壯，基部新鮮2ms0.25不定芽生長健壯，基部有少許老化3ms0.5不定芽生長較為健壯，基部組織較多老化4ms0.75不定芽較為細弱，基部組織較多老化5ms1不定芽生長細弱，基部老化嚴重由表2可知，當naa濃度為0.1-0.5mg/l時，黃芩無菌苗的不定芽生長健壯，當不添加naa或是naa濃度達到0.75mg/l以上時，不定芽生長細弱，基部組織老化現象逐漸嚴重。表3為生根培養基對黃芩無菌苗生根誘導的影響由表3可知，生根培養基為1/2ms+0.5-1mg/liaa時對黃芩無菌苗生根的誘導效果最佳，此時黃芩無菌苗根長，粗壯、岔根少，生長旺盛，地上部分新鮮。表4所示為，增殖培養時採用不同接種類型且培養溫差不同對增殖係數的影響。表4由表4可知，選用叢生芽為接種對象，且培養溫差為5-10℃的條件下平均增殖係數最大為9.34，採用單株時同樣溫差情況下，平均增殖係數僅為5.95。表5為生根培養過程中不同暗期培養和不同晝夜溫差對黃芩生根率的影響，表5由表5可知，生根培養過程中經過1-2天的暗期培養後保持溫差為5-10℃能使得黃芩的生根率達到85％以上，當暗期培養1天，溫差為5℃時生根率最高能達到98.9％。表6為煉苗與移栽過程中擰松瓶蓋打開瓶蓋使幼苗適應外界環境對移栽成活率的影響。表6由表6可知，適當的擰松瓶蓋3-4d，使得植物與外界環境逐漸適應，起到過渡期的作用，有效的提高了黃芩小苗移栽的成活率，最高能達到98.5％。當前第1頁12