大熊貓冷凍精液製備新方法
2023-11-08 02:25:02 2
專利名稱：大熊貓冷凍精液製備新方法
技術領域：
本發明涉及ー種圈養動物精液的冷凍保存，特別是涉及ー種大熊貓冷凍精液製備新方法。
背景技術：
大熊貓冷凍精液技術首先在1980年由成都動物園建立，當時採用的是顆粒凍精製備技術，所用的方法借鑑了牛冷凍精液製備技術，結果由於存在冷凍精液質量較差，重複性差以及無法直接標記等問題，該方法現在已經被淘汰，從上世紀90年代末期開始大熊貓細管凍精逐漸應用到大熊貓繁殖中，大熊貓細管凍精通常採用手工冷凍、程序降溫與液氮運輸罐冷凍法製備，具體情況如下: (I)手工冷凍法《大熊貓電刺激採精及精液冷凍保存研究》(黃炎等，四川師範學院學報.自然科學版.2000年9月第21卷第3期)，採用蔗糖-卵黃-甘油液或者Test液等冷凍稀釋液，將精液稀釋及平衡好後，用0.25ml細管將精液分裝並封ロ，採用兩步法冷凍精液。第一歩:將細管放置在預冷好的冷凍架上層(距液氮面7.5cm),時間I分鐘。第二步:將上層的細管移到冷凍架下層(距液氮面2.5cm),放置I分鐘，然後將細管直接投入液氮完成冷凍過程。(2)程序降溫法程序降溫法與手工細管法的主要區別在於使用的冷凍工具不同。程序降溫法採用程序冷凍儀進行冷凍，手工細管法利用簡易冷凍架進行冷凍。採用程序降溫法，由於同一批次凍精冷凍條件完全一致，穩定性要高於後者，同時可設計不同的冷凍程序冷凍精液，但程序冷凍儀價格昂貴、毎次冷凍需耗用大量液氮，冷凍成本較高是其缺點。( 3 )液氮運輸罐冷凍法該法利用專門的液氮運輸罐中的液氮蒸氣進行精液冷凍。操作簡單，不需額外添加液氮，只需將平衡井分裝好的精液細管直接投入罐內樣品筒內即可，特別適合於野外使用。主要缺點在於可製備的凍精數量有限。以上三種大熊貓細管凍精製備方法中，第一種方法即手工冷凍法以其操作簡單，方便，快捷，液氮耗費少，效果良好在生產上得到廣泛應用與報導，但是該方法尚存在ー些問題:主要問題在於用該方法製備的凍精質量在不同製作批次間重複性較差，原因在於該凍精製備方法主要根據液氮面距離冷凍架的高度來進行冷凍，而液氮面到冷凍架的高度是ー個非常粗略的指標，難以確切把握，導致每次冷凍凍精時冷凍面溫度實際上是不確定的，而冷凍面溫度不確定可直接導致不同批次間凍精冷凍速度差異較大，而冷凍速度差異可直接影響凍精質量，這是導致現報導的大熊貓細管凍精製備方法製作的凍精質量不穩定的重要原因
發明內容
本發明要解決的技術問題是ー種在簡單、快速、經濟的條件下如何保障各批次間高質量冷凍精液的穩定製備的大熊貓冷凍精液製備新方法。為解決上述技術問題，本發明ー種大熊貓冷凍精液製備新方法，包括以下步驟:A.採集雄性大熊貓精液，對精液進行稀釋，將稀釋的精液保存在冷藏裝置中；B.經冷藏平衡數小時後，對稀釋的精液進行檢查；所述平衡的作用是讓甘油充分地滲透到精液中，在冷凍時對精液起到保護作用；C.將經檢查合格的精液吸入細管內，並將細管封ロ ；D.將至少有上下兩層的冷凍支架放入冷凍箱體內，往冷凍箱體內倒入低於下層冷凍支架頂端面的液氮，即在冷凍箱體內，液氮面低於下層冷凍支架頂端面；E.檢測、調整上層冷凍支架頂端面的冷凍面溫度，當所述的冷凍面溫度為-100°C至 _70°C時，將細管放置在上層冷凍支架頂端面上，用冷凍箱蓋封蓋冷凍箱體達30 90秒後，揭開冷凍箱蓋，將細管挪置下層冷凍支架頂端面上，再次用冷凍箱蓋封蓋冷凍箱體達30 90秒後，揭開冷凍箱蓋，將細管挪入冷凍箱體內的液氮中，待平衡後，將細管從冷凍箱體內的液氮中取出，然後放置在液氮罐內長期保存；所述的平衡是指細管溫度與液氮溫度相等。所述的冷凍面是指上層冷凍支架頂端的整個平面；冷凍面的溫度用低溫溫度計檢測，檢測吋，低溫溫度計探頭直接放在上層冷凍支架頂端面上；當冷凍面溫度過高吋，往冷凍箱體內倒入適當量的液氮，當冷凍面溫度過低時，適當敞開冷凍箱體一段時間讓液氮自然揮發提高冷凍面溫度。所述的ー種 大熊貓冷凍精液製備新方法，其冷凍支架的上下兩層的高度差為^cm 8cm0所述的ー種大熊貓冷凍精液製備新方法，其冷凍支架的上下兩層分別由兩部分單獨構成，上層冷凍支架的高度為12cm，下層冷凍支架的高度為6cm。下面就常規冷凍法和本發明的冷凍面溫度冷凍法的詳細情況進行說明。常規冷凍法:第一歩:將細管放置在預冷好的冷凍架上層(距液氮面7.5cm),時間I分鐘；第二歩:將上層的細管移到冷凍架下層(距液氮面2.5cm)，放置I分鐘，然後將細管直接投入液氮完成冷凍過程。冷凍面溫度冷凍法:第一步調整上層冷凍面溫度為-70 _100°C (冷凍面溫度用液氮調整);第二步將細管放置在已調整好冷凍面溫度的冷凍架上層，時間I分鐘；第ニ步是將上層的細管移到冷凍架下層(距液氮面I 4cm)，放置I分鐘，然後將細管直接投入液氮完成冷凍過程。將採用冷凍面溫度作為冷凍指標(方法2)與距離液氮面的高度(方法I)作為冷凍指標的效果進行比較，結果表1:表1.不同冷凍方法冷凍效果比較
權利要求
1.一種大熊貓冷凍精液製備新方法，包括以下步驟: A.採集雄性成年大熊貓精液，對精液進行稀釋，將稀釋的精液保存在冷藏裝置中； B.經冷藏平衡數小時後，對稀釋的精液進行檢查； C.將經檢查合格的精液吸入細管(2)內，並將細管(2)封ロ； D.將至少有上、下兩層的冷凍支架放入冷凍箱體(5)內，往冷凍箱體(5)內倒入低於下層冷凍支架(4)頂端面的液氮(3); E.檢測、調整上層冷凍支架(I)頂端面的冷凍面溫度，當所述的冷凍面溫度為-100°C至 -70°C時，將細管(2)放置在上層冷凍支架(I)頂端面上，用冷凍箱蓋(6)封蓋冷凍箱體(5)達30 90秒後，揭開冷凍箱蓋(6)，將細管(2)挪置下層冷凍支架(4)頂端面上，再次用冷凍箱蓋(6 )封蓋冷凍箱體(5 )達30 90秒後，揭開冷凍箱蓋(6 )，將細管(2 )挪入冷凍箱體(5)內的液氮(3)中，待平衡後，將細管(2)從冷凍箱體(5)內的液氮(3)中取出，然後放直在液氣te內保存。
2.根據權利要求1所述的ー種大熊貓冷凍精液製備新方法，其特徵在於:冷凍支架的上下兩層的高度差為3cm 8cm。
3.根據權利要求3所述的ー種大熊貓冷凍精液製備新方法，其特徵在於:冷凍支架的上下兩層分別由兩部分單獨構成，上層冷凍支架(I)的高度為12cm，下層冷凍支架(4)的高度 為6cm。
全文摘要
本發明公開了一種大熊貓冷凍精液製備新方法，其在冷凍箱體(5)內放置上、下兩層冷凍支架後，往冷凍箱體(5)內倒入液氮(3)，當上層冷凍支架(1)頂端面達到-100℃至～-70℃時，將裝有成年大熊貓精液的細管(2)依次放置在上、下兩層冷凍支架上，各放置30～90秒後，將細管(2)挪入冷凍箱體(5)內的液氮(3)中，待平衡後，將細管(2)再放置在液氮罐內長期保存；由於本發明將大熊貓精液的初次冷凍溫度由離液氮面的距離確定改為由低溫溫度計測定的冷凍面溫度範圍確定，既簡單、快速、經濟，還使得不同批次間的冷凍精液因冷凍條件一致，從而實現了高質量的冷凍精液的穩定製備，極大地推動了國寶大熊貓保護工作的進步。
文檔編號A01N1/02GK103120156SQ20131007130
公開日2013年5月29日 申請日期2013年3月6日 優先權日2013年3月6日
發明者侯蓉, 張志和, 劉玉良, 王海瑞, 蔡志剛, 蘭景超 申請人:成都大熊貓繁育研究基地