在體內具有延長的半衰期和增強的紅細胞生成活性的重組人EPO-Fc融合蛋白的製作方法

2023-07-15 11:42:06 3

專利名稱：在體內具有延長的半衰期和增強的紅細胞生成活性的重組人EPO-Fc融合蛋白的製作方法
技術領域：
本申請涉及人促紅細胞生成素融合蛋白。 背景
人促紅細胞生成素(EPO)(造血生長因子家族的成員)主要在成 人腎臟和胎兒肝臟中作為對於由於減少的血氧可獲得性引起的組織缺 氧的響應而合成[l]。 EPO的主要功能是對骨髓中的某些紅細胞(RBC) 祖細胞和前體細胞直接作用以刺激血紅蛋白的合成和成熟RBC的產 生。其還控制RBC的增殖、分化和成熟。已產生了具有天然發生的EPO 的胺基酸序列的重組EPO,並且被批准用於治療與腎功能衰竭、癌症 和其他病理狀態相關的貧血症[2]。除了其紅細胞生成特性外，近來的 研究報導[3]表明，EP0還對非骨髓細胞例如神經元起作用，這暗示EPO 在中樞神經系統(CNS)和其他器官/系統中的其他可能的生理/病理功 能。因為已在許多不同的器官中發現EPO受體，因此EPO可具有多種 生物學效應，例如用作抗凋亡劑。
人EPO是分子量為30.4千道爾頓的糖蛋白。糖類佔其總質量的大 約39%。 EPO基因位於染色體7qll-22上，並且橫跨具有5個外顯子和4個內含子的5. 4kb區域[4]。 EP0的前體由193個胺基酸組成。通過 翻譯後修飾而進行的前導序列和最後的胺基酸Arg的切割產生了具有 165個胺基酸的成熟EP0。糖基化(在Asn24、 Asn38、 Asn83處的3 個N聯位點和在Serl26處的一個0聯位點)在EPO的生物合成、三級 結構和體內生物學活性中起著至關重要的作用[5]。 EPO通過給合至促 紅細胞生成素受體(分子量為72-78千道爾頓的糖基化且礴酸化的跨 膜多肽)來發揮功能。該結合觸發所述受體的同源二聚化，這導致幾 個信號轉導途徑的激活JAK2/STAT5系統、G-蛋白、鈣通道和激酶。 對於獲得最佳受體激活需要兩個分子的EP0蛋白同時結合一個受體分 子[6]。
作為第一個被批准用於人類治療的造血生長因子，重組人EP0 (rHuEP0)已被用於治療由慢性腎衰竭、癌症(主要是化療相關的貧 血)、自身免疫疾病、AIDS、手術、骨髄移植和骨髓增生異常症候群 等引起的貧血症。有趣地，近年來的研究已觀察到，rHuEPO具有非血 液系統功能，並顯示用作用於腦缺血、腦外傷、炎性疾病和神經變性 疾病的神經保護性藥物的潛能。
目前，商購可得三種類型的rHuEP0或rHuEPO類似物，即rHuEPO ot、 rHuEP0 P和darbepoetin oc [8]。這三種重組蛋白結合相同的 促紅細胞生成素受體，但在結構、糖基化程度、受體結合親和力和體 內代謝方面不同。自20世紀80年代開始引入rHuEPO-oc以來，臨床 醫生很快就認識到所述藥物的頻繁給藥/注射要求是個很大的缺點。 靜脈內和皮下施用的rHuEP0 ot和rHuEP0 P的平均體內半衰期分別 只有8. 5和17小時[9， 10]。因此患者需要每天1次、每周2次或每 周3次的注射方案，這對患者和衛生保健提供者(health care provider)都產生了負擔。因此，對開發具有更長的體內半衰期和/ 或增強的紅細胞生成活性的重組EP0類似物存在長久的需要。
在現有技術中已作出了嘗試，以遺傳改變或化學修飾天然EP0蛋 白的結構從而減慢其體內代謝或提高其治療特性。例如，EP0分子上 包含唾液酸的糖類的量與其體內代謝和功能活性之間看上去呈正相關性。因此，增加EPO分子的糖含量可導致體內更長的半衰期和增強的 活性[ll， 12]。 Amgen已設計了 rHuEP0類似物darbepoetin ct ，其 包含5個N聯糖鏈(比rHuEPO多兩個)。darbepoetin a也稱作新 型紅細胞生成刺激蛋白(NESP)，並且以商標AranespTM進行銷售。 darbepoetin cc與天然人EPO在5個位點(Ala30Asn、 His32Thr、 Pro87Val、 Trp88Asn、 Pro90Thr )上不同,這使得兩個額外的N聯寡 糖能夠附著在天冬醯胺殘基位點30和88上。darbepoetin oc以與天 然EP0相同的方式結合EP0受體從而誘導細胞內信號傳導，所述信號 傳導包括由JAK-2激酶和相同的細胞內分子Ras/MAP-k、 P13-k和 STAT-5引起的酪氨酸磷酸化。由於增加的糖類含量，darbepoetin oc 在動物和人中的的半衰期幾乎為rHuEP0-ot的三倍(25.3小時對8.5 小時)[9]。在體內，darbepoetin a ( Aranesp )還似乎展現出相 比天然發生的或重組的人EP0而言增強的生物學活性[13]，並且已被 FDA批准為第二代rHuEP0藥物；該藥物只需要每周施用1次即可獲得 與每周注射2至3次rHuEP0相同的治療效果[10， 14， 15]。
延長EPO的半衰期的其他努力已集中在通過化學綴合聚乙二醇 (PEG化)等來增加EPO蛋白的分子量。PEG化的EPO具有大得多的分 子量，並受到保護而免於被從循環中清除，從而具有更長的血漿半衰 期[16]。然而，PEG化可能改變蛋白的結構，從而導致EPO部分的功 能和特異性的不可預期的改變。還存在通過其他方法，例如將EPO分 子連接至載體蛋白(人白蛋白)，或者使用連接肽(3至17個胺基酸) 或經化學交聯劑形成兩個完整EPO分子的同源二聚化，來增加EPO的 分子量的報導U7， 18， 19， 20]。儘管所有這些方法已在延長EPO的 半衰期和增加其活性中獲得一定的成功，但在本申請所描述的融合蛋 白中將EP0分子與人免疫球蛋白(IgG)的Fc片段相結合獲得了獨特 的優點。
人免疫球蛋白IgG由4個通過二硫鍵共價連接的多肽(輕鏈和重 鏈的兩個相同拷貝)組成。通過木瓜蛋白酶來蛋白水解IgG分子產生 兩個Fab片段和一個Fc片段。所述Fc片段由通過二硫鍵連接在一起的兩個多肽組成。每個多肽，從N至C末端，由鉸鏈區、CH2結構域 和CH3結構域組成。所述Fc片段結構在所有亞型的人免疫球蛋白中幾 乎相同。IgG是人血液中最豐富的蛋白之一，其在組成了人血清中總 免疫球蛋白的70至75%。 IgG在循環中的半衰期在所有5種類型的免 疫球蛋白中是最長的，並且可達到21天。
已成功地將現代生物工程技術用於產生由治療性蛋白質片段例如 細胞因子和可溶性受體與人IgG的Fc片段組成的融合蛋白[21， 22， 23: 24]。這些融合蛋白具有顯著更長的體內半衰期，而同時保持其生物學 和治療性質。到目前為止，已成功地開發出兩種包含Fc片段的融合蛋 白作為生物藥物，並經FDA批准用於治療類風溼性關節炎和慢性斑塊 狀銀屑病[25， 26]。
在現有技術中已顯示，通過化學交聯或通過多肽連接的兩個EPO 分子的二聚體展現出增強的體內活性和延長的半衰期[17， 19]。所述 增強的活性可能是由於所述EPO二聚體與一種受體的更有效的結合而 產生的，和所述延長的體內半衰期可能是由於所述二聚體蛋白的大小 更大而引起的。然而，化學交聯過程不是有效的且難以控制。此外， EP0 二聚體中的連接肽可能改變EP0分子的三維結構，並且所述肽本 身可能刺激體內的免疫原性應答。這些缺點削弱了 EPO二聚體的治療 潛能，特別是由於腎病患者中的EP0替代療法是終生進行時尤其如此。
因此產生了對於具有顯著更長的體內半衰期和增強的體內紅細胞 生成活性但不具有增加的免疫原性特性的EP0類似物的需要。
發明概述
根據本發明，描述了包含連接至免疫球蛋白肽部分的人促紅細胞 生成素肽部分的重組融合蛋白。所述融合蛋白具有相比天然發生的或 重組的天然人促紅細胞生成素而言延長的體內半衰期。在本發明的一 個實施方案中，所述蛋白的體內半衰期為天然人促紅細胞生成素的至 少三倍。所述融合蛋白還展現出相比天然人促紅細胞生成素而言增強的紅細胞生成生物活性。
在本發明的一個實施方案中，所述免疫球蛋白肽部分是Fc片段， 例如IgGl片段。所述Fc片段包含CH2和CH3結構域和鉸鏈區。所述 EP0肽部分直接連接至鉸鏈區。優選地，所述鉸鏈區的長度為至少9 個胺基酸。在一個實施方案中，所述EPO肽部分具有臨近其C末端的 半胱氨酸殘基，並且所述鉸鏈區包含位於最靠近所述EP0肽部位的半 胱氨酸殘基。優選地，這兩個半胱氨酸殘基間隔至少12個胺基酸。在 一個實施方案中，所述EP0肽部分可包含直接連接至免疫球蛋白部分 的完整EP0分子(即在EP0和免疫球蛋白部分之間沒有插入外來肽連 接體)。
本發明還涉及包含多個單元的本發明融合蛋白的多聚體蛋白構建 體。例如，兩個融合蛋白可裝配為二聚體，其中所迷蛋白的鉸鏈區通 過二硫鍵連接。所述二聚體具有IgG分子的一般形狀，並且比游離的 EP0分子更穩定。
本發明還涉及編碼所述融合蛋白的核酸和胺基酸序列，以及用於 產生所述融合蛋白的經轉染的細胞系和方法。本發明進一步包括包含 所述融合蛋白的藥物組合物，和使用所述融合蛋白和/或所述藥物組合 物(例如在需要治療的受試者中刺激紅細胞生成)的方法。
附圖簡述
在舉例說明本發明的各種實施方案但不希望以限定性方式解釋的 附圖中


圖1A是示意圖，其顯示了本發明的重組人EP0-Fc融合蛋白 (rHuEP0-Fc)的一般結構。
圖1B是序列表，其顯示了 rHuEPO-Fc蛋白的核苷酸序列和推導的 胺基酸(aa)序列。DM的總長度為1281bp。在所述推導的蛋白質序 列中的426個胺基酸包括信號肽的27個aa和完整rHuEP0-Fc蛋白的 399個aa。所述完整的rHuEP0-Fc蛋白由人EPO結構域(166aa)以及人IgGl的Fc片段的鉸鏈區(16aa，加下劃線的)和CH2和CH3結構域 (217aa)組成。計算出的成熟rHuEP0-Fc融合蛋白的多肽的分子量為 44. 6kDa，其由18. 5kDa (41. 4%)的EP0片段和26. lkDa (58. 6%)的IgGl Fc片段組成。同源二聚體由鉸鏈區內的兩個半胱氨酸殘基(加框的) 通過兩個二硫鍵形成。在成熟融合蛋白的殘基172 (即鉸鏈區的第6 個胺基酸)處，天然的半胱氨酸殘基被甘氨酸(粗體)置換。
圖2是示意圖，其顯示了用於插入編碼rHuEPO-Fc融合蛋白的多 肽的DNA序列和用於轉染表達所述rHuEP0-Fc融合蛋白的CH0細胞的 哺乳動物表達質粒pCDl的結構和特徵。
圖3是SDS-PAGE圖像，其顯示了通過SDS-PAGE分析顯示的在非 還原條件下純rHuEP0-Fc蛋白的二聚體形式和在還原條件下純 rHuEPO-Fc蛋白的單體形式的大小。在非還原條件下，在8y。Bis-Tris 凝膠上，從表達rHuEP0-FC的培養的CH0細胞系的上清液中純化出的 rHuEPO-Fc蛋白主要以二聚體形式存在並且具有大約180 kDa的分子 量。在打斷二硫鍵的還原條件(100 mM 二硫蘇糖醇，DTT)下，所述 二聚體分成兩個相同的分子量為75 kDa的單體單元。
圖4A和4B所示的圖顯示了在通過每周3次皮下注射(s.c.) rHuEPO-Fc或rHuEP0進行處理的正常小鼠中血紅蛋白(Hb )水平的劑 量依賴性增加。每個點代表所述組(6隻小鼠)的平均Hb水平。第0 天的水平代表處理前的Hb水平。A:用rHuEPO-Fc處理的小鼠。B:用 天然rHuEPO處理的小鼠。
圖5A和5B所示的圖顯示了在通過每周1次皮下注射(s.c.) rHuEPO-Fc或rHuEP0進行處理的正常小鼠中血紅蛋白(Hb )水平的劑 量依賴性增加。每個點代表所述組(6隻小鼠)的平均Hb水平。第0 天的水平代表處理前的Hb水平。A:用rHuEPO-Fc處理的小鼠。B:用 天然rHuEPO處理的小鼠。
圖6A和6B所示的圖顯示了在通過靜脈內注射(i. v. ) 12. 5pg/kg rHuEPO-Fc或rHuEP0進行處理的正常小鼠中血紅蛋白(Hb )水平的增 加。每個點代表所述組(6隻小鼠)的平均Hb水平。第0天的水平代表處理前的Hb水平。A:每周l次處理的小鼠。B:每周3次處理的小鼠。
圖7所示的圖顯示了在通過每周l次皮下注射rHuEP0-Fc、rHuEP0 或darbepoetin-oc (縮寫為Darbe.)進行處理的並切除了 5/6的腎的 大鼠中血紅蛋白(Hb)水平的劑量依賴性增加。每個點代表所述組的 平均Hb水平。正常對照是用栽體溶液進行注射的正常大鼠。模型對照 是用載體溶液進行注射的並切除了 5/6的腎的大鼠。第0周的水平代 表處理前的Hb水平。*:處理後的周數。
圖8所示的圖顯示了在通過每兩周1次皮下注射rHuEP0-Fc、 rHuEP0或darbepoetin-a (縮寫為Darbe.)進行處理的並切除了 5/6 的腎的大鼠中血紅蛋白(Hb)水平的劑量依賴性增加。每個點代表所 述組的平均Hb水平。正常對照是用載體溶液進行注射的正常大鼠。模 型對照是用載體溶液進行注射的並切除了 5/6的腎的大鼠。第0周的 水平代表處理前的Hb水平。*:處理後的周數。
圖9所示的圖顯示了在通過每兩周1次靜脈內注射62. 5pg/kg rHuEPO-Fc或darbepoetin-a (縮寫為Darbe.)進行處理的並切除了 5/6的腎的大鼠中血紅蛋白(Hb)水平的劑量依賴性增加。每個點代 表所述組的平均Hb水平。正常對照是用載體溶液進行注射的正常大 鼠。模型對照是用載體溶液進行注射的並切除了 5/6的腎的大鼠。第 O周的水平代表處理前的Hb水平。*:處理後的周數。
圖10A-10C顯示了 rHuEP0-Fc、 rHuEP0和darbepoet in-ct在以 用不同劑量和方案進行處理的並切除了 5/6的腎的大鼠中刺激CFU-E 和BFU-E集落形成的效力比較。rHuEP0-Fc和darbepoietin-ct (縮 寫為Darbe.)處理顯示出相似的刺激CFU-E和BFU-E集落形成的劑量 依賴性效力，而rHuEP0的效力較低。A,每周l次皮下注射。B,每兩 周1次皮下注射。C，每兩周1次靜脈內注射。
圖11所示的圖顯示了在對獼猴靜脈內注射5 p g/kg rHuEP0-Fc或 rHuEP0後rHuEP0-Fc和rHuEP0的血清水平(5隻猴子的平均水平)。
圖12是序列表，其顯示了野生型rHuEPO-FcC蛋白的核苷酸序列和推導的胺基酸(aa)序列。除了天然的野生型半胱氨酸存在於成熟
的融合蛋白的殘基172 (即，鉸鏈區的第6個胺基酸)處之外，所述 序列的細節與圖1中所示的相同。
圖13所示的圖顯示了在通過每周3次皮下注射(s. c. ) rHuEP0-Fc (本發明的突變型融合蛋白)、rHuEPO-FcC (野生型融合蛋白)和 rHuEP0進行處理的正常水鼠中血紅蛋白(Hb )水平的劑量依賴性增加。 每個點代表所述組(8)的平均Hb水平。正常對照是用載體溶液進行 注射的正常小鼠。第O天的水平代表處理前的Hb水平。
圖14所示的圖顯示了在通過每周1次皮下注射(s.c.) rHuEP0-Fc、 rHuEP0-FcC和rHuEPO進行處理的正常水鼠中血紅蛋白 (Hb)水平的劑量依賴性增加。每個點代表所述組(8)的平均Hb水 平。正常對照是用載體溶液進行注射的正常小鼠。第0天的水平代表 處理前的Hb水平。
發明詳述
在整個下列描述中顯示了特定的詳細內容以便更全面地理解本發 明。然而，可實施本發明而不採用這些細節。在其他情況下，未詳細 顯示或描述熟知的元素以避免不必要地使本發明模糊不清。因此，本 說明書和附圖被認為是舉例說明性的而不是限制性的。
本申請涉及具有紅細胞生成特性的新型融合蛋白。所述融合蛋白， 此處稱為rHuEPO-Fc，包括重組連接至免疫球蛋白Fc片段的人促紅細 胞生成素(EPO)分子。如在下面進一步討論的，所述融合蛋白可以為 由兩個相同的多肽亞基組成的二聚體形式。在圖1A中示意性地顯示的 實施方案中，每個多肽亞基，從N末端至C末端，由人EPO分子的多 肽序列以及人免疫球蛋白IgGl的Fc片段的鉸鏈區、CH2結構域和CH3 結構域的多肽序列組成。所述兩個多肽亞基通過各自鉸鏈區之間的二 硫鍵連接在一起從而形成所述二聚體結構。因此，所述二聚體具有與 IgG分子相同的一般形狀，並且展示出比在下面實施例中所討論的游離的EP0分子更好的穩定性。
正如對於本領域技術人員來說將會是顯然的，完整的免疫球蛋白
的鉸鏈區為所述蛋白提供了用於有效的抗原-抗體結合的足夠的柔性。 類似地，在本發明中，在rHuEP0-Fc融合蛋白的設計包括了鉸鏈區以 保持其柔性，尤其是當融合蛋白以二聚體形式存在時。如下面所描述 的，這允許所述rHuEP0-Fc融合蛋白的EP0部分與EP0受體的正常結 合，從而激活EP0生物學功能。據認為rHuEP0-FC融合蛋白的二聚體 形式通過提供兩個EP0分子而能夠誘導EP0受體的最佳激活(例如， 通過促進受體交聯)。
正如在下面所示的實施例中所證明的，使用重組DNA技術已經成 功地合成了所述rHuEP0-Fc融合蛋白。已顯示，在小鼠、大鼠和靈長 類動物的研究中，所述融合蛋白展示出相比天然發生的或重組的天然 人EP0而言延長的體內半衰期和增強的紅細胞生成特性。如本專利申 請中所用的，術語"天然人促紅細胞生成素"和"天然人EP0"是指 具有未修飾的野生型結構的EP0。正如本領域技術人員將會認識到的， 天然人EP0可天然地發生或重組產生(例如rHuEP0 a )。術語"天 然人EP0"不包括rHuEP0類似物，例如darbepoetin oc，其中EPO 結構已被明顯修飾，例如通過高糖基化(hyperglycosylation)。
本發明的rHuEP0-Fc融合蛋白的核酸序列顯示於SEQ. ID. No. 1 中。相應的推導的胺基酸序列顯示於SEQ. ID. No. 2中。完整的 rHuEPO-Fc融合蛋白的長度為399個胺基酸。如圖IB中所示的，完整 的rHuEP0-Fc融合蛋白由EPO結構域(166個胺基酸)、鉸鏈區(16 個胺基酸，加下劃線的)以及CH2和CH3結構域(217個胺基酸)組 成。由27個胺基酸組成的信號或前導肽序列也顯示於圖IB中。信號 肽在rHuEPO-Fc的合成過程中被切割。包含信號肽或前導肽的 rHuEP0-Fc的核酸和胺基酸序列分別顯示於SEQ. ID. No. 3和SEQ. ID. No. 4中。
如圖IB和SEQ. ID. No. 2中所最佳顯示的，EPO結構域在氨基 酸編號161處具有接近其C末端的半胱氨酸殘基。鉸鏈區在胺基酸編號178和181 (在圖IB中用框標示)處包含2個半胱氨酸殘基。所述 鉸鏈區半胱氨酸殘基在上述同源二聚體的多肽亞基之間形成二硫鍵。 天然發生的人IgGl片段的鉸鏈區也在鉸鏈區部分的殘基編號6 (從N 末端測量的)處具有半胱氨酸。在本發明中，鉸鏈部分的半胱氨酸殘 基6已被非半胱氨酸殘基置換。特別地，在圖IB和SEQ. ID. No. 2 的實施方案中，所述胺基酸半胱氨酸已被甘氨酸(在rHuEP0-Fc的氨 基酸殘基172處，所述殘基相應於鉸鏈區的殘基6)置換。正如對於 本領域技術人員來說將是顯然的，其他非半胱氨酸殘基也可在該位置 上置換半胱氨酸以避免二硫鍵的形成。
由於在殘基172處的胺基酸置換，鉸鏈區的第一個半胱氨酸殘基 (在殘基178處)與EPO結構域的上述半胱氨酸殘基(在殘基161處) 相隔17個胺基酸。本發明者認為，EP0結構域的半胱氨酸殘基161與 鉸鏈區的第一個半胱氨酸殘基之間的最小間隔應當為至少12個氨基 酸，從而使得能夠成功地裝配rHuEP0-Fc的同源二聚體和/或使得EP0 受體能夠結合rHuEPO-Fc的同源二聚體。即，如果殘基172是半胱氨 酸殘基，則在例如在半胱氨酸殘基161和172之間可能形成不想要的 二硫鍵。這可能改變EPO分子的三維結構，從而導致無生物學活性或 生物學活性減少。
在本發明的一個實施方案中，將EP0結構域直接連接至融合蛋白 的Fc片段部分。通過避免提供外來連接體肽，rHuEP0-Fc融合肽的優 選三維結構得到保持，並且使觸發不希望的免疫原性應答的風險減少 至最低。Fc片段的鉸鏈區的長度優選為至少9個胺基酸，並且長度優 選地在大約10至20個胺基酸的範圍內。
實施例
下列實施例將進一步更詳細地舉例說明本發明，儘管將會認識到 本發明不限於所述特定的實施例。1.編碼HuEPO-Fc的融合蛋白的重組質粒pCdEpo-Fc的構建
通過使用下列oligo引物(QIAGEN Inc., US)的重疊PCR來產生
編碼rHuEPO-Fc多肽的胺基酸序列的全長DNA分子 EF5: 5" -ccggaattcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcct-3 ，，
EF3: 5 ， -ttttccttttgcggccgcttatttacccggagacagggagag-3 ，； EFL5: 5 ， -aggcctgcaggacaggggacagagttgagcccaaatctggtgaca-3 ，； EFL3: 5 ，-tgtcaccagatttgggctcaactctgtcccctgtcctgcaggcct-3'
上述引物的序列分別列於SEQ. I.D. No. 5-8中。 分別將EcoR I和Not I位點導入EF5和EF3中。為了在哺乳動物 細胞中最佳地表達HuEPO-Fc蛋白，還將Kozak序列(GCCACCATGG )導 入EF5中。EFL5和EFL3是由Epo的3'末端DNA序列(23bp)和IgGl 鉸鏈的5'末端DNA序列(22bp)組成的互補序列。
首先，分別地，使用引物EF5和EFL3通過PCR( Plat inumTaq DNA Polymerase High Fidelity)從包含全長人EPO cDNA的質粒p9E中 擴增出0. 6 kb的EPO DNA片段，使用引物EF3和EFL5從包含全長人 IgGl cDNA序列的質粒pD中擴增出0. 7 kb的Fc片段(p9E和pD來自 本發明者自已的實驗室)。然後純化這兩種片段，並將其以等量混合。 使用所述混合物作為模板，通過引物EF5和EF3擴增出1. 3kb的全長 rHuEPO-Fc腿。用EocR I和Not I (New England Biolab Inc. US) 消化經純化的1.3 kb片段，然後將其克隆入經EcoR I/Not I消化的 哺乳動物表達栽體pCDl (圖2)中。所得的重組載體稱為pCdEpo-Fc， 並通過DNA測序來驗證所插入的編碼HuEPO-Fc蛋白的胺基酸序列的核 酸序列。
2. rHuEPO-Fc表達細胞系的建立
將具有二氫葉酸還原酶(dhfr )缺陷的中國倉鼠卵巢細胞 (CH0/dhfr—， ATCC No. CRL-9096 )用作用於rHuEP0-Fc表達的宿主細 胞，所述中國倉鼠卵巢細胞經FDA批准用於生物物質的生產。
4吏用Lipofectamine (Gibco， Cat. No: 18292-037， USA)，用重組栽體pCdEpo-Fc轉染CH0-dhfr—細胞。通過ELISA (Roche, Cat. No: 1-693 417， Canada )就EPO活性來測定來自所選克隆的培養物的 上清液。在不斷增加的氨甲蝶呤(MTX)的壓力下進一步篩選陽性克隆。 選擇一個具有最高rHuEPO-Fc蛋白表達的細胞系作為表達rHuEPO-Fc 的CHO細胞系，並且使其逐漸地適應無血清培養基(CD CHO培養基， Gibco， Cat. No: 10743-029， USA)。該表達rHuEPO-Fc的CHO細胞 系用於產生rHuEPO-Fc蛋白。
3. rHuEPO-Fc蛋白的純化
首先通過A蛋白親和層析(Amersham， Cat. No: 17-0402-01， Canada)來分離上清液中所包含的rHuEPO-Fc蛋白分子，所述上清液 從培養表達rHuEPO-Fc的CHO細胞的無血清培養基中收集。通過在 HiLoad 16/60 Superdex 200pg柱(Amersham, Cat. No: 17-1069-01， Canada)中進行凝膠過濾來進一步純化所述分離的蛋白。如通過電泳 所測定的，rHuEPO-Fc蛋白的純度超過98yo。
4. 純rHuEPO-Fc蛋白的大小的測定
首先，進行SDS-PAGE以確定純rHuEPO-Fc蛋白的大小。如圖3中 所示，在非還原條件下，在8%Bis-Tris凝膠上看到具有大約180kDa 的分子量的單一條帶，這測量了存在有二硫鍵的蛋白的總體大小。這 表明，大多數rHuEPO-Fc蛋白分子以二聚體形式產生，如根據所述融 合蛋白的設計所預期的。當在打斷二硫鍵的還原條件(lOOmM 二硫蘇 糖醇，DTT)下進行SDS-PAGE分析時，只鑑定了具有75Kda的分子量 的條帶，這與估計的HuEP0-鉸鏈區-CH2-CH3的單個多肽鏈的分子量相 一致。
通過質鐠(MALDI-TOF-MS)測定的具有糖基化的純rHuEPO-Fc融 合蛋白的精確分子量是111099道爾頓(lll.lKda)。在該測定法中， 只觀察到單一蛋白峰，表明所述純化的rHuEPO-Fc蛋白幾乎具有100% 的純度。通過蛋白質序列分析測定純rHuEPO-Fc蛋白的N末端的15個胺基酸為APPRLICDSRVLERY。這與天然人EP0多肽的前15個氨基 酸的序列相一致，並驗證了所述純化的rHuEPO-Fc蛋白確實具有根據 編碼rHuEP0-Fc融合蛋白的胺基酸序列的DNA序列所預測的正確且完 整的EPO分子序列。
5.在正常小鼠中rHuEPO-Fc的增強的紅細胞生成活性 進行在小鼠中的體內實驗以驗證rHuEPO-Fc蛋白的紅細胞生成活 性的保持，和測定其與rHuEPO和darbepoetin-ot相比的功效。為了 進行比較，在本發明的所述動物實驗中使用的3種EP0 (我們的 rHuEPO-Fc、 rHuEPO (即天然人EPO)和darbepoetin-ct )的所有劑 量是基於摩爾基礎的單獨的EPO分子部分的量。對於rHuEPO-Fc蛋白， 如通過EPO的胺基酸重量在整個rHuEPO-Fc分子的總胺基酸重量中的 比例(399個aa中166個aa)所計算的，EPO部分貢獻了 41.4%的總 rHuEPO-Fc分子量。那麼就將rHuEPO-Fc的EPO量確定為rHuEPO-Fc 蛋白總量的41.4%。
將rHuEPO-Fc (母液濃度0. 5mg/ml， 98. 6%的純度)和天然人 rHuEPO (即具有天然的人EPO結構)(6000IU/0. 5ml，由Kirin Brewery Co. ， Japan生產)在載體溶液(2. 5mg/ml的人血清白蛋白、 5.8mg/ml檸檬酸鈉、0. 06mg/ffll檸檬酸和5. 8mg/ml氯化鈉， pH5. 5-5. 6 )中稀釋。根據其活性/數量比例來計算總計的rHuEPO劑量。 將BALB/c小鼠(6至8周齡，體重18-22g，雄性和雌性數目相等，購 自Experiment Animal Center, A醒S， China)隨機分組，每組6隻。 用一種劑量(O. 1、 0.5、 2.5、 12.5、 62.5jig/kg)、 一種注射途徑(通 過尾靜脈的靜脈內注射(i.v.)或皮下注射(s.c.))和一種注射方 案(每周3次或每周l次)的一個組合來處理各組小鼠。用等體積的 栽體溶液注射對照組小鼠。所述處理持續3周，並且總觀察時間為5 周。在處理前於每周的笫4天和第7天測量外周血樣品(尾靜脈)， 進行5周。通過吸光測定法將Hb測量為指數。根據各組的數據來計算 平均值土SD,並在不同組之間進行f檢驗。每周3次給小鼠施用EPO,條件是所述EP0具有正常的紅細胞生 成活性，這將誘導紅細胞生成的飽和刺激。如圖4中所示，每周3次 通過皮下注射進行處理的這兩個組即使在2. 5 n g/kg的劑量上也具有 顯著提高的Hb水平。該實驗證明，rHuEP0-Fc展示出與rHuEP0—樣 有效的體內紅細胞生成活性。處理組中Hb水平的提高是劑量依賴性 的。但是，在12.5MgAg rHuEPO-Fc的劑量上在小鼠中誘導了 Hb水 平的飽和提高，而只有在62. 5|Ltg/kg rHuEP0的劑量上才獲得了相似 的Hb水平的飽和提高。由2. 5yg/kg rHuEPO-Fc誘導的Hb水平的提 高也大於由2. 5pg/kg rHuEP0所誘導的提高。這些結果暗示，由 rHuEP0-Fc產生的紅細胞生成刺激比rHuEP0更有效。
通過將皮下注射次數減少至每周1次來進一步探究rHuEP0-Fc的 紅細胞生成效力。如圖5中所示，經rHuEPO-Fc處理的組在12.5或 62.5|ig/kg的劑量上顯示出劑量依賴性的Hb水平的提高。12.5和 62. 5 n g/kg rHuEPO的劑量還都誘導了相似程度的Hb水平的提高，所 述程度遠低於由62. 5jug/kg的rHuEPO-Fc所誘導的程度。這強有力地 表明，rHuEPO-Fc具有增強的體內紅細胞生成活性。據推測這是由於 所述rHuEPO-Fc蛋白中二聚體EPO分子導致的延長的rHuEPO-Fc的體 內半衰期或改善的EPO受體結合/激活，或兩者的組合效應。
當每周3次或每周1次靜脈內施用相同劑量(12. 5jug/kg)的 rHuEPO-Fc或rHuEPO時，對於所有處理組均觀察到Hb水平的提高(圖 6)。然而，每周1次靜脈內施用rHuEPO-Fc誘導了更大、更持久的 Hb水平的提高，其可在處理結束後持續更長的時間。該數據進一步支 持了，與具有天然發生的EPO蛋白的結構的rHuEPO相比，所述 rHuEPO-Fc蛋白具有增強的紅細胞生成特性。
6. rHuEPO-Fc在切除5/6的腎的大鼠中的增強的紅細胞生成活性 正常小鼠中的實驗證明了 rHuEPO-Fc具有增強的體內紅細胞生成 活性。為了進一步觀察rHuEPO-Fc在刺激紅細胞生成中的功效，在具 有實驗性腎臟貧血(通過切除5/6的腎臟來產生)的大鼠中進行藥效動力學研究。將rHuEPO-Fc的功效與rHuEPO和darbepoetin-ot (60 jug/ml， lot. No. N079,由Kirin Brewery Co. ， Japan生產)的功
效進行比較。
在本發明中使用Wistar大鼠(雄性和雌性的數目相等，體重 160-180g， 購自 Vitalriver Experiment Animal Inc., Beijing, China. Licence No. SCXK1 1-00-0008 )來建立由於通過兩步驟腎切 除術產生的腎功能衰竭而形成的貧血症模型[27]。通過在無菌條件下 的兩次分開的手術對全身麻醉的大鼠實施5/6的腎切除術。在切除2/3 的左腎後，讓大鼠恢復20天。然後小心地切除右腎。施用抗生素以在 每次手術後預防感染。最終切除總共5/6的腎臟組織。腎切除的大鼠 逐漸發生腎功能不全和貧血症。在腎切除術後50天大鼠進入穩定的貧 血狀態，然後將其隨機分組(9隻/組)以開始施用EPO。用一種劑量
(2.5、 12.5、 62. 5ug/kg)、 一種注射途徑(通過尾靜脈的靜脈內注 射或皮下注射)和一種注射方案(每周l次或每兩周l次)的一個組 合來處理各組大鼠。用體積的栽體溶液注射對照組和模型組的大鼠。 所述處理持續4周，總觀察時間為6周。
每周1次皮下施用的rHuEP0-Fc的所有劑量(2. 5、 12. 5、 62. 5
U g/kg )都誘導了相比未接受EP0處理的模型對照組而言Hb水平的劑 量依賴性提高。每周1次皮下施用的12. 5和62. 5 jag/kg的rHuEP0 或darbepoetin也誘導了 Hb水平的提高。在用12. 5或62. 5 n g/kg rHuEP0-Fc處理的兩個組中增加的Hb水平都分別顯著高於用12. 5或 62. 5 y g/kg rHuEP0處理的組。在用62. 5 m g/kg rHuEPO-Fc處理的組 中的Hb水平也稍微比在用62. 5 jag/kg darbepoetin處理的組中的Hb 水平高。在停止處理後，在用62. 5jjg/kg rHuEP0-Fc處理的組中的 Hb水平的降低比正常對照組和模型對照組慢得多，並且直至觀察結束 時(在處理後兩周)都保持了比正常對照組和模型對照組高的Hb水平， 從而表明更強和/或延長的紅細胞生成刺激作用(概括於圖7中)。
對於每兩周1次的皮下注射處理，只施用12. 5或62. 5 m g/kg的 所述三種EP0 (圖8 )。與模型對照組相比，12. 5 u g/kg rHuEP0僅僅增加Hb的水平，並且與正常對照組相比，在經62. 5jag/kg rHuEPO 處理的組中的弱紅細胞生成應答不能將Hb水平恢復至正常水平。以 12. 5或62. 5 y g/kg的劑量用rHuEPO-Fc或darbepoetin進4亍處理i秀 導了顯著的Hb水平的提高，其高於正常對照組，這表明rHuEPO-Fc 和darbepoetin都產生有效的貧血狀況的改正。就功效而言，在相同 劑量的rHuEP0-Fc和darbepoetin之間未觀察到顯著差異。62. 5 p g/kg的高劑量導致紅細胞生成的持續增加，直至觀察結束時(處理後 2周)。這進一步暗示，rHuEPO-Fc和darbepoetin展示出長效地刺激 體內紅細胞生成的特性，該特性反過來可轉化成在臨床上減少對患者 的施用頻率。
儘管已批准darbepoetin用於臨床應用(該應用具有較不頻繁的 注射以增加患者的順應性和減少衛生保健提供者的工作負擔)，但這 些實驗數據強烈地表明本發明中公開的rHuEPO-Fc具有至少相似的潛 在益處。如上所述，darbepoetin,作為包含額外的糖化合物(增加的 糖基化)的人EP0分子的突變型類似物，可能具有增加的誘導體內免 疫發生的風險，所述免疫發生是由於改變的三維結構引起的。只有長 期觀察經歷使用darbepoetin進行治療的患者才可作出對 darbepoetin的免疫原性風險的決定性回答。相反地，沒有修飾EPO 分子部分的rHuEP0-Fc的糖含量與天然人EPO相同或非常相似。在本 發明者的純rHuEP0-Fc蛋白中的唾液酸的量為大約10.0 mmol/mmol EP0，這與報導的rHuEPO的參數一致。無外來胺基酸/連接肽的 rHuEP0-Fc的Fc部分代表了人IgGl的一般結構，並且在理論上不會 導致免疫原性應答。如果在臨床上被批准，rHuEP0-Fc可能為患者(尤 其是需要長期施用的患者)提供比目前可獲得的rHuEPO和EP0類似物 更好的選擇。
每兩周l次進行靜脈內注射後，rHuEP0-Fc和darbepoetin ( 62. 5 Mg/kg)都能夠在具有腎臟貧血症的大鼠中誘導相同的、遠高於正常 對照大鼠中的正常Hb水平的Hb水平增加(圖9)。這進一步證明了 由rHuBP0-Fc產生的紅細胞生成的持續刺激作用，因為darbepoetin的功效已在臨床上得到證明。
來自骨髓細胞的細胞培養實驗的數據顯示rHuEPO-Fc、 rHuEPO和 darbepoetin都刺激了 CFU-E和BFU-E的形成，所述骨髓細胞是在處 理(每周1次或每兩周1次皮下或靜脈內施用)後從切除了 5/6的腎 的大鼠中收集的。rHuEPO-Fc和darbepoetin的效力相似，並且比 rHuEPO強(圖10)。
在處理組和模型對照組中血液urinonitrogen (BUN)和肌酐 (Crea)水平相似。所有處理組中的血清Fe水平比模型對照組高。病 理學檢查觀察到所有經EPO處理的小鼠的骨髓和脾臟中紅細胞(RBC) 相關細胞的分布增加。
7.獼猴中rHuEPO-Fc的藥物動力學研究
如上所述，本發明者以下列方式設計了 rHuEPO-Fc:融合蛋白的 EPO部分保持天然EPO的功能特性(例如刺激紅細胞生成)，和人IgGl 的Fc片段使得融合蛋白能夠在循環中穩定存在，從而延長了其體內半 衰期。上述動物研究已證明，與rHuEPO相比，rHuEPO-Fc的紅細胞生 成活性得到增強。本發明者還進行了藥物動力學研究以確定相比 rHuEPO而言的rHuEPO-Fc的體內半衰期。使用靈長類動物來產生數據， 因為它們在生物學上與人類非常相似。
研究設計是基於文獻報導的，並且按照藥物動力學的一般指導來 進行實驗。分別用5 n g/kg rHuEPO-Fc或rHuEPO靜脈內注射兩組獼猴， 每組5隻猴子(3-5kg，購自Experiment Animal Center, AMMS， China )。 在注射之前和注射之後0.017、 0.167、 0.5、 1、 2、 4、 8、 12、 24、 48、 96、 168、 240小時採集血液樣品。通過離心收集血清，並通過使 用人促紅細胞生成素酶聯免疫吸附測定法(ELISA)試劑盒(購自R&D Systems, Minneapolis, MN )來測定血清rHuEPO-Fc或rHuEPO水平。 通過靜脈內注射的rHuEPO-Fc和rHuEPO的平均半衰期(tl/2 )分別是 35. 24+/-5. 15小時和8. 72+/-1. 69小時(概括於圖11中)。
為了觀察rHuEPO-Fc的生物利用度，將5 ug/kg rHuEPO-Fc皮下注射給5隻獼猴。在注射前和注射後l、 2、 5、 8、 10、 12、 15、 24、 48、 72、 96、 168、 240小時採集血液樣品，並通過R&D試劑盒來測定 rHuEPO-Fc的血清水平。對於皮下注射，生物利用度指數計算為 35. 71+/-5. 37% 。這與報導的在慢性腎功能衰竭患者中的 darbepoetin-ot ( Aranesp )的生物利用度數據相一致[9， 15〗。
該數據證明，rHuEPO-Fc在靈長類動物中具有顯著延長的半衰期， 並且rHuEPO-Fc的體內半衰期為由Kirin Beer Brewing Co. of Japan 生產的rHuEPO的至少4倍。延長的體內半衰期可能有助於rHuEPO-Fc 的增強的紅細胞生成活性。
8. rHuEPO-Fc在食蟹猴(#acaca屍asc/c"/ar/s)中的免疫原性 如上面所指明的，在rHuEPO-Fc融合蛋白的設計中要注意有意地 避免或最小化rHuEPO-Fc融合蛋白的免疫原性特性的改變。本發明者 避免了在融合蛋白中包含/加入任何外來胺基酸或連接肽序列。圖IB 的實施方案的所發明的HuEPO-Fc融合蛋白只包含天然EPO蛋白和人 IgGl的Fc片段(鉸鏈區、CH2、 CH3)的多肽序列，並且在理論上不 誘導免疫原性應答和抗rHuEPO-Fc蛋白抗體的產生。正如本領域技術 人員將會認識到的，具有備選的結構的其他實施方案也包括在本發明中。
進行下列靈長類動物研究以觀察rHuEPO-Fc蛋白的免疫原性。每 周3次用5yg/kg純化的rHuEPO-Fc皮下注射10隻食蟹猴(雄性/雌 性=5/5，大約5歲，雄性平均體重為4. 0± 0. 3kg，雌性為2. 9 ± 0. 4kg, 購自Laboratory Animal Center, AMMS， China)，進行4周，並用 等體積的載體溶液注射兩隻食蟹猴作為對照動物。每周採集血清1次， 進行5周(處理後1周)，並使用純化的rHuEP0-Fc ( 5 jj g/ml )作為 包^皮抗原通過ELISA就抗rHuEPO-Fc的特異性抗體對其進行測試。此 外，還在實驗期間測定了外周血中的RBC計數和Hb水平。所得的數據 顯示，儘管在經rHuEP0-Fc處理的食蟹猴中觀察到被刺激的紅細胞生 成的增加(平均RBC數目從4. 74 x 107ml增加至6. 67 x 109/ml，並且平均Hb水平從12. 2g/dl增加至13. 7g/dl)，但rHuEP0-Fc不能誘導 可檢測的抗融合蛋白的特異性抗體。這些結果表明，rHuEP0-Fc融合 蛋白不在靈長類動物中引起免疫原性。
9. rHuEPO-Fc在正常小鼠中的急性毒性研究
為了評估rHuEP0-Fc融合蛋白的安全性，在動物中進行急性毒性研九。
分別用過量的純化的rHuEP0-Fc (雄性=13. 3 mg/kg，雌性=13. 2 mg/kg)或等體積的載體溶液通過其尾靜脈來靜脈內注射2組BALB/c 小鼠(n-20，等數目的雄性和雌性，5-6周齡，雌性平均體重為15.8 ±0. 4g，雄小生為15.9±0. 6g， 購自 Chinese Academy of Medicine, China) l次。除了觀察注射後的即時反應外，每天監控和記錄一般行 為和狀態、活動性、進食和排便模式以及變化，進行14天。在笫7 天和第14天還對所有小鼠稱重。在注射後第15天，對小鼠的主要器 官進行解剖檢查。如果觀察到器官的任何不尋常的改變或可疑的改變， 則進行病理學檢查。
在所述2個組中的所有小鼠在注射後都沒有明顯的即時反應。在 14天的時期內，未觀察到行為、活動性、進食和排便模式的明顯改變。 此外，在測試期間兩組小鼠的重量都穩定地增加，並且在注射後第7 天或第14天在2個組之間未發現明顯的差異。在腦、肺、心臟、肝臟 和腎臟組織中未檢測到異常的或病理性的改變。這些結果表明，施用 遠比對於展示正常紅細胞生成功能所需的量多的過量rHuEPO-Fc是安 全的，並且無顯著的毒性效應。
10. 野生型和突變型EPO融合蛋白的比較 還進行了用於比較野生型和突變型EP0蛋白的研究。如上所述，
在一個實施方案中，本發明包括在胺基酸殘基172處的單個胺基酸突 變(C172G)。為了進行比較，還製備了在殘基172處具有半胱氨酸氨 基酸的野生型融合蛋白(圖12)。以與上述實施例1至3中相同的方法製備了所述野生型融合蛋白。關於重組質粒的構建，使用下列oligo 引物(QIAGENInc. ， US)(與實施例1中的引物相比，EFL5w和EFL3w
中改變的胺基酸以粗體標示)
EF5: 5 ，-ccggaattcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcct-3 ，；
EF3: 5 ，掘ccttttgcggccgcttatttacccggagacagggagag-3 ，.
EFL5w: 5 ，誦aggcctgcaggacaggggacagagttgagcccaaatcttgtgaca-3 ，.
EFL3w: 5 ，-tgtcacaagatttgggctcaactctgtcccctgtcctgcaggcct-3'。
引物EFL5w和EFL3w的序列分別列於SEQ. I.D. No. 9-10中。 進行在小鼠中的體內實驗以將野生型融合蛋白(此處稱為 rHuEPO-FcC)的紅細胞生成活性與突變型融合蛋白(即上述的本發明 rHuEPO-Fc蛋白)和與重組人EPO ( rHuEPO )進行比較。為了進行比較， 用於該實施例的所述三種蛋白(即rHuEPO-Fc、 rHuEPO-FcC和rHuEPO ) 的所有劑量是基於摩爾基礎的單獨的EPO分子部分的量。對於 rHuEPO-Fc和rHuEPO-FcC蛋白，如通過EPO的胺基酸重量對整個 rHuEPO-Fc和rHuEPO-FcC分子的總胺基酸重量的比例(即399個aa 中166個aa)所計算的，EPO部分貢獻了總分子量的41. 4%。
將rHuEPO-Fc (母液濃度:300jLig/ml ) 、 rHuEPO-FcC (母液濃度: 90Mg/ml)和具有天然人EPO結構的rHuEPO ( 6000IU/0. 5ml，由 Kirin Brewery Co. ， Japan生產)在栽體溶液(2. 5mg/ml人血清白 蛋白，5. 8mg/ml檸檬酸鈉，Q. 06mg/ml檸檬酸和5. 8mg/ml氯化鈉， pH5. 5-5. 6 )中稀釋。根據其活性/數量比例來計算總計的rHuEPO劑量。 將BALB/c小鼠(9至10周齡，體重18-22g,雄性和雌性數目相等， 購自Experiment Animal Center, AMMS， China)隨機分組，每組8 只。用一種劑量(2. 5、 12.5、 62.5jLig/kg)、 一種注射途徑(s. c.) 和一種注射方案(每周3次或每周1次)的一種組合來處理各組小鼠。 用等體積的載體溶液注射對照組小鼠。所述處理持續26天。在處理前 以及在處理的第2、 6、 9、 13、 16、 19、 22和26天釆集用於測量的外 周血樣品(尾靜脈)。通過吸光測定法將Hb測量為指數。根據各組的 數據來計算平均值土SD,並在不同組之間進行,檢驗。如圖13中所示，以每周3次的間隔施用所有三種EP0蛋白刺激了 紅細胞生成。在2. 5 ju g/kg或12. 5 ju g/kg的劑量上，rHuEPO-Fc誘導 了比rHuEPO更高的Hb水平的提高。最高的Hb水平的提高通過12.5 Mg/kg劑量的rHuEP0-Fc獲得。如由經rHuEPO-FcC處理的組中的顯 著更低的Hb水平的提高所表明的，2. 5ug/kg和12.5yg/kg劑量的 rHuEPO-FcC誘導了相比等劑量的rHuEPO和rHuEP0-Fc而言弱得多的 紅細胞生成。事實上，12. 5Mg/kgrHuEP0-FcC誘導了相比2. 5jug/kg rHuEPO而言更低的Hb水平的提高。這些結果暗示，與具有天然EPO 分子序列的rHuEPO相比，rHuEPO-FcC削弱了體內紅細胞生成活性。 相反地，本發明的rHuEPO-Fc融合蛋白展示出更強的紅細胞生成功能。 以每周3次的間隔施用所述三種EPO蛋白大大地排除了所述蛋白的半 衰期差異的影響。
通過減少皮下注射次數至每周一次來進一步評估rHuEPO-Fc和 rHuEPO-FcC的紅細胞生成效力。如圖14中所示，在12. 5 yg/kg或62. 5 ju g/kg的劑量上，與經rHuEPO處理的組相比，經rHuEPO-Fc處理的 組顯示更高的Hb水平的提高。相反地，與由rHuEPO所誘導的Hb水平 的提高相比，rHuEPO-FcC誘導了弱得多的Hb水平的提高。例如，在 大多數時間點上，12. 5yg/kg rHuEPO誘導了相比62. 5 n g/kg rHuEPO-FcC而言更高的Hb水平的提高。這進一步表明，通過減少施 用次數至包括半衰期的影響，rHuEPO-FcC展示出相比具有天然EPO分 子序列的rHuEPO和本發明的rHuEPO-Fc融合蛋白而言弱得多的體內紅 細胞生成功能。
總之，這些結果證明，與具有天然EPO分子序列的rHuEPO相比， 由人EPO和人Fc片段(鉸鏈、CH2和CH3)的天然分子序列融合形成 的rHuEPO-FcC展示出弱得多的體內紅細胞生成功能。特別地，所述 rHuEPO-FcC融合蛋白的紅細胞生成活性低於天然EPO分子的紅細胞生 成活性的1/5。這表明，EPO分子和人Fc片段的天然序列之間的融合 削弱了 EPO分子的功能特性。通過在Fc片段的鉸鏈區中於第一個半胱 氨酸殘基處進行單個胺基酸替代，包含天然EPO分子序列和突變型Fc片段的本發明的rHuEP0-Fc融合蛋白顯示出相比天然EP0分子而言更 強的體內紅細胞生成功能。該數據暗示，野生型Fc片段的鉸鏈區中的 第一個半胱氨酸殘基不知何故幹擾了 EP0分子，可能是由於使EPO分 子的結構發生改變而導致的，並且這反過來削弱了 EPO分子在刺激紅 細胞生成中的功能特性。
正如依據上述公開內容而對於本領域技術人員來說將是顯然的， 在本發明的實施中可能進行許多改變和修飾，但不背離其精神或範圍。參考文獻
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權利要求
1.包含直接連接至人IgG Fc片段的人促紅細胞生成素分子的重組融合蛋白，其中所述融合蛋白具有相比天然發生的或重組的天然人促紅細胞生成素而言延長的體內半衰期。
2. 權利要求l的蛋白，其中所述蛋白的半衰期為所述天然人促 紅細胞生成素的至少3倍。
3. 權利要求2的蛋白，其中所述蛋白的半衰期為所述天然人促 紅細胞生成素的至少4倍。
4. 權利要求2的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有相比所述天 然人促紅細胞生成素而言增強的紅細胞生成生物活性。
5. 權利要求l的融合蛋白，其中所述Fc片段是IgGl片段。
6. 權利要求5的融合蛋白，其中所述Fc片段包含鉸鏈區和CH2 和CH3結構域。
7. 權利要求6的融合蛋白，其中所述鉸鏈區的長度為至少9個 胺基酸。
8. 權利要求l的融合蛋白，其中所述蛋白具有SEQ. I.D. No. 2 中所示的胺基酸序列或基本上與其同源的序列。
9. 包含多個權利要求1的融合蛋白的多聚體蛋白構建體。
10. 權利要求9的多聚體蛋白構建體，其中所述結構是二聚體。
11. 包含多個多肽的多聚體蛋白，所述多肽各具有SEQ. I.D. No. 2中所示的胺基酸序列或基本上與其同源的序列。
12. 權利要求ll的蛋白，其中所述蛋白是二聚體。
13. 權利要求12的蛋白，其中所述二聚體在所述多肽的鉸鏈結 構域之間包含二硫鍵。
14. 權利要求ll的蛋白，其中所述多肽中的每一個具有大約75 kDa的分子量。
15. 權利要求12的蛋白，其中所述二聚體具有大約180 kDa的 分子量。
16. 包含權利要求1的蛋白以及藥物學上可接受的載體、佐劑或 稀釋劑的藥物組合物。
17. 編碼與SEQ. I.D. No. 2具有至少90%的胺基酸序列同一性 的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有相比天然人促紅細胞生成素 而言延長的體內半衰期。
18. 重組DNA分子，其包含SEQ. I.D. No. 1中所示的核酸序列 或基本上與其同源的序列。
19. 用權利要求18的重組DNA分子轉染的細胞系。
20. 權利要求19的細胞系，其中所述細胞系是CHO細胞系。
21. 產生權利要求1的蛋白的方法，其包括培養用權利要求18 的DNA分子轉染的細胞系和純化由其編碼的多肽。
22. 在哺乳動物中刺激紅細胞生成的方法，其包括給所述哺乳動 物施用權利要求1的蛋白。
23. 權利要求22的方法，其中所述哺乳動物是靈長類動物。
24. 權利要求23的方法，其中所述靈長類動物是人。
25. 在哺乳動物中刺激紅細胞生成的方法，其包括給所述哺乳動 物施用權利要求16的藥物組合物。
26. 權利要求25的方法，其中所述哺乳動物是靈長類動物。
27. 權利要求26的方法，其中所述靈長類動物是人。
28. 權利要求22的方法，其中當靜脈內或皮下施用時，在所述 哺乳動物中所述蛋白的半衰期為天然人EPO的至少3倍。
29. 權利要求28的方法，其中當靜脈內或皮下施用時，在所述 哺乳動物中所述蛋白的半衰期為天然人EP0的至少4倍。
30. 重組融合蛋白，其包含(a) 具有臨近其C末端的半胱氨酸殘基的促紅細胞生成素肽部 分；和(b) 包含鉸鏈區的免疫球蛋白肽部分，其中位於最靠近所述促紅細胞生成素肽部分處的所述鉸鏈區的至少12個胺基酸。
31. 權利要求30的融合蛋白，其中促紅細胞生成素肽部分是完 整的人促紅細胞生成素分子。
32. 權利要求30的融合蛋白，其中所述免疫^l蛋白肽部分是包 含所述鉸鏈區和CH2和CH3結構域的人IgG Fc片段。
33. 權利要求32的融合蛋白，其中所述IgG Fc片段是IgGl片段。
34. 權利要求32的融合蛋白，其中所述鉸鏈區直接偶聯至所述 促紅細胞生成素肽部分。
35. 權利要求32的融合蛋白，其在所述鉸鏈區和所述促紅細胞 生成素肽部分之間包含肽連接體。
36. 權利要求30的融合蛋白，其中所述鉸鏈區的長度為至少9 個胺基酸。
37. 權利要求36的融合蛋白，其中所述鉸鏈區在從所述鉸鏈區 的N末端開始測量的第6位胺基酸處具有非半胱氨酸殘基。
38. 權利要求37的融合蛋白，其中所述非半胱氨酸殘基是中性 胺基酸。
39. 權利要求38的融合蛋白，其中所述非半胱氨酸殘基是甘氨酸。
40. 權利要求36的融合蛋白，其中所述鉸鏈區是在從所述鉸鏈 區的N末端開始測量的第6位胺基酸處具有非半胱氨酸殘基的人Fc 片段變體。
41. 權利要求34的融合蛋白，其中所述鉸鏈區具有SEQ. I.D. No. 5中所示的胺基酸序列，或與其具有至少90%序列同一性並且在從所述 鉸鏈區的N末端開始測量的第6位胺基酸處具有非半胱氨酸殘基的序列。
42. 權利要求30的融合蛋白，其中當給哺乳動物施用時，所述 蛋白的半衰期為以相同方式給所述哺乳動物施用的天然人促紅細胞生 成素的至少3倍。
43. 權利要求42的融合蛋白，其中當給哺乳動物施用時，所述 蛋白的半衰期為以相同方式給所述哺乳動物施用的天然人促紅細胞生 成素的至少4倍。
44. 權利要求42的融合蛋白，其中所述哺乳動物是人。
45. 包含第一和第二融合蛋白的二聚體，所述融合蛋白中的每一 個為權利要求30中所定義的，其中所述第一融合蛋白的所述鉸鏈區通 過二硫鍵結合至所述第二融合蛋白的所述鉸鏈區。
46. 包含多個經連接的融合蛋白的多聚體蛋白構建體，所迷融合 蛋白中的每一個為權利要求30中所定義的。
47. 包含SEQ. I.D. No. 1中所示的核酸序列的重組DNA分子。
48. 包含一對多肽的二聚體，所述多肽中的每一個具有SEQ. I.D. No. 2中所示的胺基酸序列。全文摘要
描述了包含連接至免疫球蛋白肽部分的人促紅細胞生成素肽部分的重組融合蛋白。所述融合蛋白具有相比天然發生的或重組的天然人促紅細胞生成素而言延長的體內半衰期。在本發明的一個實施方案中，所述蛋白質的體內半衰期為天然人促紅細胞生成素的至少3倍。所述融合蛋白還展現出相比天然人促紅細胞生成素而言增強的紅細胞生成生物活性。在一個實施方案中，所述融合蛋白包含人促紅細胞生成素(EPO)分子的完整肽序列和人免疫球蛋白IgG1的Fc片段的肽序列。在所述融合蛋白中的Fc片段包含人免疫球蛋白IgG1的鉸鏈區、CH2和CH3結構域。所述EPO分子可直接連接至Fc片段以避免外來肽連接體，並當在體內施用時減少免疫原性應答的風險。在一個實施方案中，所述鉸鏈區是在第6位胺基酸處具有非半胱氨酸殘基的人Fc片段變體。本發明還涉及編碼所述融合蛋白的核酸和胺基酸序列，以及用於產生所述融合蛋白的經轉染的細胞系和方法。本發明進一步包括包含所述融合蛋白的藥物組合物，和使用所述融合蛋白和/或所述藥物組合物(例如在需要治療的受試者中刺激紅細胞生成)的方法。
文檔編號A61K38/18GK101321870SQ200780000439
公開日2008年12月10日 申請日期2007年1月25日 優先權日2006年1月27日
發明者劉龍斌, 瑞 張, 靜 徐, 勇 杜, 王海濤 申請人:諾瓦根控股公司