用dna指紋判別家蠶雜交率的鑑定方法
2023-12-10 03:58:16 1
專利名稱：用dna指紋判別家蠶雜交率的鑑定方法
技術領域：
本發明涉及採用DNA指紋技術對家蠶(Bombyx mori L.)雜交率進行鑑定的方法。
家蠶雜交種是蠶繭生產高產穩產的基本保證，雜交種的雜交率(蠶種中雜交種的比率)的高低，與蠶農的經濟效益關係密切。為了維護蠶農的利益，蠶種的雜交率已作為蠶種質量檢驗的法定項目，經檢驗不合格的蠶種被限制使用。目前對雜交率的鑑定方法是採用直接飼養二匾蠶(約1000頭蠶)、以大蠶期蠶體的斑紋為依據進行親本和雜交種的判別，按樣本實際檢出的親本個體數為依據計算樣本雜交率，以樣本雜交率作為總體雜交率。這種鑑定方法存在以下五個問題1)由於日×中的雜交品種，其雜交種與日系親本的斑紋一樣，都為普通斑紋，所以依靠斑紋不可能作出正確判別。即現行的判別方法，只能對中×日的雜交種進行判別，不能對日×中的雜交種進行判別；2)由於原種生命力比雜交種虛弱，容易發生病小蠶，在養蠶期間已被淘汰，降低了原種在雜交種中的比率，所以使鑑定得到的雜交率數值偏高；3)按照數理統計的抽樣分布理論，親本在蠶種中的分布屬超幾何分布、二項分布、或普松分布，雖然親本在總體中的比率為一定值，但樣本中親本出現的個體數各種各樣，親本的比例按一定概率出現，並不永遠與總體中的比例相同，所以按樣本實際檢出的親本個體數，推斷總體雜交率，結果常常是不正確的；4)春制秋用種，由於制種結束至用種期的時間較短，在鑑定結果出來之前，蠶種已被發到農村飼養，失去了檢驗的目的；5)為了對春用品種進行鑑別，需要在春蠶期以前，將蠶種空運到南方比較溫暖的省市提前催青飼養，使非南方省份的蠶區化費大量人力、物力。
利用PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應)技術建立的DNA指紋親子判斷方法，是利用個體的DNA為模板，採用能夠擴增出特徵DNA片斷的引物，根據DNA分子水平的異同點，進行親子鑑別。方法先進，結論正確。但為了獲取個體的DNA，常用的抽提方法都需要經過多步反應，並用有機溶劑，如酚、氯仿、異戊醇等除去蛋白質，方法繁瑣，時間較長，花費較大。
將DNA指紋親子判斷方法應用於家蠶雜交率的鑑定方面，能夠獲得全面、正確的鑑定結果。但由於家蠶雜交率鑑定需要檢測很多樣本，常規的DNA抽提方法不能適應需要。所以必須建立一種快速、經濟的抽提DNA的方法。另外還需要用幾種能夠擴增出用於親子鑑別的特異性DNA片斷的引物。為了能夠由樣本的結果正確地推斷總體，需要應用數理統計的原理，制定適當的抽樣比例，建立由樣本雜交率推斷總體雜交率的方法。
本發明的目的是建立一種快速、合理、正確、實用、取材方便、適合於所有生產用家蠶品種的用DNA指紋判別家蠶雜交率的鑑定方法。
為了達到上述目的，本發明採用的技術方案是(1)DNA模板的提取第一步取1粒蠶卵或1條蟻蠶，加入10～100μl 0.1～1.0mol/LNaOH,0.5～2.5％ME緩衝液，冰浴研磨10～30min，加50～200μl 50～200mmol/LTris-HClpH6～9緩衝液，攪拌10min,10000～15000×g、4℃離心5～20min。
第二步取上清液10～100μl，加2.5倍99％酒精，-20℃中放置15～60min,10000～15000×g、4℃離心5～30min，用10～100μl無菌去離子水溶解，即得到PCR反應所需的DNA模板。
(2)PCR反應的引物如下隨機引物，可在目前生產用蠶品種的親本與雜交種之間形成特徵性的譜帶，用於雜交率的鑑定。
(3)PCR反應條件PCR反應體系上述抽提得到的DNA模板液1～5μl；Taq DNA聚合酶0.2～5u；按總體積1/10的量加入10倍PCR反應緩衝液，組成成分100mM/LTris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40pH9.0；dNTP 0.15～0.25 mmol/L；加上述DNA合成引物，使終濃度為0.1～1.5μmol/L；加無菌去離子水，使總體積達到10～100μl；PCR反應條件94～95℃預熱4～5min；變性解鏈94℃ 0.5～2min；復性30～50℃ 0.5～2min；合成延伸70～75℃1～5min；循環30～45次；保存70～75℃,5～10min；4℃,0.5～12h；反應設備PCR反應儀；(4)DNA電泳採用0.8～1.5％瓊脂糖凝膠，電泳緩衝液用0.5～1％TAE或TBE。(5)樣本容量取100～1000粒蠶卵或蟻蠶作為樣本，供雜交率鑑定用，用樣本的結果推斷總體的結果，正確率可達到95～99％。
本發明具有的有益效果是1)用胚胎形成到蟻蠶孵化的任何時期的蠶卵或蟻蠶為材料，取材方便；2)用2步方法提取DNA模板，快速、簡單；3)所用DNA合成引物能在現行生產用蠶品種的親本與雜交種之間擴增特異性的DNA片斷，建立的每一品種的親本和雜交種的特徵性DNA電泳參照圖譜，可作為雜交率鑑別的依據；4)按照數理統計的原理設定樣本數，按照抽樣分布的理論，計算出由樣本雜交率推斷總體雜交率的概率，設定的正確率為95～99％，正確性高。
下面結合實施例對本發明作進一步說明。
取上清液20μl，加50μl 99％酒精，-20℃中放置15min,15000×g、4℃離心15min，沉澱用20μl無菌去離子水溶解，作為PCR反應所需的DNA模板。
(2)PCR反應引物採用ZHD0020引物，序列為TAGGTCTTGGG。
(3)PCR反應條件設定PCR反應體系上述抽提得到的DNA模板液2μlTaq DNA聚合酶2.5u10×PCR反應緩衝液(成分組成100mM/L Tris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40 pH9.0)10μldNTP各0.2mmol/LZHD0020引物，使終濃度為0.5μmol/L加無菌去離子水，使總體積達到100μlPCR反應條件94℃預熱4min變性解鏈94℃ 1min復性37℃ 1min合成延伸72℃ 1.5min循環35次保存72℃,5min,4℃,5h。
(4)DNA電泳採用1％瓊脂糖凝膠，電泳緩衝液用1％TAE。
(5)結果PCR反應合成的DNA片斷，經瓊脂糖凝膠電泳分離，秋豐品種具有1、2、3和5共4條帶，白玉品種具有1、2和4共3條帶，秋豐×白玉、白玉×秋豐兩個雜交種都具有1、2、3、4和5共5條帶。兩個親本的DNA片斷在兩個雜交種中都存在，結果符合遺傳規律。親本與雜交種的DNA電泳圖譜的特徵具有明顯差異，所以可用於雜交種的雜交率鑑定。10次實驗結果都相同，故確定這種電泳圖譜為秋豐、白玉及其雜交種的電泳參照圖譜。
實驗從浙江大學動物科學學院蠶蜂科學系遺傳育種教研組繁育的蠶種秋豐×白玉中抽取200粒蠶卵，按上述PCR反應獲得每一粒蠶卵的DNA片斷，經瓊脂糖電泳發現，有4粒蠶卵的DNA電泳圖譜與秋豐品種的電泳圖譜相同，其他196粒蠶卵的DNA電泳圖譜與秋豐×白玉品種的電泳圖譜相同，按二項分布統計分析原理，推斷該批蠶種的雜交率在95％以上，並得知這一結論的正確率(概率值)在95％以上。
取上清液40μl，加100μl 99％酒精，-20℃中放置15min,15000×g、4℃離心20min，沉澱用20μl無菌去離子水溶解，作為PCR反應所需的DNA模板。
(2)PCR反應引物採用ZHD0029引物，序列為GCAGCACTGAC(3)PCR反應條件設定PCR反應體系上述抽提得到的DNA模板液2μlTaq DNA聚合酶5u10×PCR反應緩衝液(成分組成100 mM/L Tris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40 pH9.0)20μldNTP各0.22mmol/LZHD0029引物，使終濃度為0.8μmol/L加無菌去離子水，使總體積達到200μlPCR反應條件94℃預熱4min變性解鏈94℃ 1.5min復性40℃ 1min合成延伸72℃ 1.5min循環35次保存72℃,5min,4℃,4h。
(4)DNA電泳採用1％瓊脂糖凝膠，電泳緩衝液用1％TAE。
(5)結果PCR反應合成的DNA片斷，經瓊脂糖凝膠電泳分離，華秋品種具有1、3和4共3條帶，松白品種具有1、2和4共3條帶，華秋×松白、松白×華秋兩個雜交種都具有1、2、3和4共4條帶。兩個親本的DNA片斷在兩個雜交種中都存在，結果符合遺傳規律。親本與雜交種的DNA電泳圖譜的特徵具有明顯差異，所以可用於雜交種的雜交率鑑定。50次實驗結果都相同，故確定這種電泳圖譜為華秋、松白及其雜交種的電泳參照圖譜。
實驗從浙江省湖州蠶桑科學研究所繁育的蠶種華秋×松白中抽取100粒蠶卵，按上述PCR反應獲得每一粒蠶卵的DNA片斷，經瓊脂糖電泳發現，有1粒蠶卵的DNA電泳圖譜與華秋品種的電泳圖譜相同，其他99粒蠶卵的DNA電泳圖譜與華秋×松白品種的電泳圖譜相同，按二項分布統計分析原理，推斷該批蠶種的雜交率在95％以上，並得知這一結論的正確率(概率值)在95％以上。
取上清液20μl，加50μl 99％酒精，-20℃中放置30min,10000×g、4℃離心18min，沉澱用20μl無菌去離子水溶解，作為PCR反應所需的DNA模板。
(2)PCR反應引物採用ZHD0013引物，序列為AGTGCCTAACC。
(3)PCR反應條件設定PCR反應體系上述抽提得到的DNA模板液2μlTaq DNA聚合酶2.5u10×PCR反應緩衝液(成分組成100mM/L Tris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20 mM/L MgCl2,0.5％NP-40 pH9.0)10μldNTP各0.18mmol/LZHD0013引物，使終濃度為0.7μmol/L加無菌去離子水，使總體積達到100μlPCR反應條件
94℃預熱4min變性解鏈94℃ 1min復性38℃ 1min合成延伸72℃ 1.5min循環35次保存72℃,5min,4℃,3h。
(4)DNA電泳採用1％瓊脂糖凝膠，電泳緩衝液用1％TAE。
(5)結果PCR反應合成的DNA片斷，經瓊脂糖凝膠電泳分離，華豐品種具有1、2和4共3條帶，雪松品種具有1、2和3共3條帶，華豐×雪松、雪松×華豐兩個雜交種都具有1、2、3和4共4條帶。兩個親本的DNA片斷在兩個雜交種中都存在，結果符合遺傳規律。親本與雜交種的DNA電泳圖譜的特徵具有明顯差異，所以可用於雜交種的雜交率鑑定。20次實驗結果相同，故確定這種電泳圖譜為華豐、雪松及其雜交種的電泳參照圖譜。
實驗從浙江大學動物科學學院蠶蜂科學系遺傳育種教研組繁育的蠶種華豐×雪松中抽取300粒蠶卵，按上述PCR反應獲得每一粒蠶卵的DNA片斷，經瓊脂糖電泳發現，有8粒蠶卵的DNA電泳圖譜與華豐品種的電泳圖譜相同，其他292粒蠶卵的DNA電泳圖譜與華豐×雪松品種的電泳圖譜相同，按二項分布統計分析原理，推斷該批蠶種的雜交率在95％以上，並得知這一結論的正確率(概率值)在95％以上。
取上清液30μl，加75μl99％酒精，-20℃中放置30min,12000×g、4℃離心20min，沉澱用20μl無菌去離子水溶解，作為PCR反應所需的DNA模板。
(2)PCR反應引物採用ZHD0004引物，序列為TGGATGAGACC。
(3)PCR反應條件設定PCR反應體系
上述抽提得到的DNA模板液1μlTaq DNA聚合酶2.3u10×PCR反應緩衝液(成分組成100mM/L Tris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40pH9.0)5μldNTP各0.17mmol/LZHD0004引物，使終濃度為0.4μmol/L加無菌去離子水，使總體積達到50μlPCR反應條件94℃預熱4min變性解鏈94℃ 1min復性39℃ 1.5min合成延伸72℃ 1.5min循環35次保存72℃,5min,4℃,1h。
(4)DNA電泳採用1％瓊脂糖凝膠，電泳緩衝液用1％TAE。
(5)結果PCR反應合成的DNA片斷，經瓊脂糖凝膠電泳分離，豐1品種具有1、2、4和5共4條帶，富日品種具有1、2、3和5共4條帶，豐1×富日、富日×豐1兩個雜交種都具有1、2、3、4和5共5條帶。兩個親本的DNA片斷在兩個雜交種中都存在，結果符合遺傳規律。親本與雜交種的DNA電泳圖譜的特徵具有明顯差異，所以可用於雜交種的雜交率鑑定。100次實驗結果相同，故確定這種電泳圖譜為豐1、富日及其雜交種的電泳參照圖譜。
實驗從浙江省湖州蠶桑科學研究所繁育的蠶種豐1×富日中抽取200粒蠶卵，按上述PCR反應獲得每一粒蠶卵的DNA片斷，經瓊脂糖電泳發現，有3粒蠶卵的DNA電泳圖譜與豐1品種的電泳圖譜相同，其他197粒蠶卵的DNA電泳圖譜與豐1×富日品種的電泳圖譜相同，按二項分布統計分析原理，推斷該批蠶種的雜交率在96％以上，並得知這一結論的正確率(概率值)在95％以上。
權利要求
1．用DNA指紋判別家蠶雜交率的鑑定方法，其特徵在於它的方法是(1)DNA模板的提取第一步取1粒蠶卵或1條蟻蠶，加入10～100μl 0.1～1.0mol/L NaOH,0.5～2.5％ME緩衝液，冰浴研磨10～30min，加50～200μl 50～200mmol/LTris-HCl pH6～9緩衝液，攪拌10min,10000～15000×g、4℃離心5～20min；第二步取上清液10～100μl，加2.5倍99％酒精，-20℃中放置15～60min,10000～15000×g、4℃離心5～30min，用10～100μl無菌去離子水溶解，即得到PCR反應所需的DNA模板；(2)PCR反應的引物如下隨機引物，可在目前生產用蠶品種的親本與雜交種之間形成特徵性的譜帶，用於雜交率的鑑定
(3)PCR反應條件PCR反應體系上述抽提得到的DNA模板液1～5μl；Taq DNA聚合酶0.2～5u；按總體積1/10的量加入10倍PCR反應緩衝液，組成成分100mM/LTris-HCl,100mM/L KCl,80mM/L(NH4)2SO4,20mM/L MgCl2,0.5％NP-40pH9.0；dNTP各0.15～0.25mmol/L；加上述DNA合成引物，使終濃度為0.1～1.5μmol/L；加無菌去離子水，使總體積達到10～100μl；PCR反應條件94～95℃預熱4～5min；變性解鏈94℃ 0.5～2min；復性30～50℃ 0.5～2min；合成延伸70～75℃1～5min；循環30～45次；保存70～75℃,5～10min；4℃,0.5～12h；反應設備PCR反應儀；(4)DNA電泳採用0.8～1.5％瓊脂糖凝膠，電泳緩衝液用0.5～1％TAE或TBE；(5)樣本容量取100～1000粒蠶卵或蟻蠶作為樣本，供雜交率鑑定用，用樣本的結果推斷總體的結果，正確率可達到95～99％。
全文摘要
用DNA指紋判別家蠶雜交率的鑑定方法,是以蠶卵或蟻蠶為材料,以每一品種的親本和雜交種為一個組合,分別快速提取DNA模板,與適當的DNA合成引物構成反應體系,擴增特異性的DNA片斷,建立每一品種的親本和雜交種的特徵性DNA片段電泳參照圖譜,作為雜交率鑑別的依據。再抽取100～1000粒的蠶卵或蟻蠶構成樣本,用上述方法建立每一個體的DNA片段電泳圖譜,並與參照圖譜比較,判斷是否是雜交種子,算出樣本的雜交率。用數理統計的原理算出由樣本雜交率推斷總體雜交率的正確性,並設定其為95～99%。
文檔編號C12Q1/68GK1311337SQ0110327
公開日2001年9月5日 申請日期2001年1月19日 優先權日2001年1月19日
發明者鍾伯雄, 丁農 申請人:浙江大學, 浙江省湖州蠶桑科學研究所