蠶電壓門控鈉通道基因、編碼蛋白及其克隆方法

2023-12-10 01:50:51 1

專利名稱：：蠶電壓門控鈉通道基因、編碼蛋白及其克隆方法
技術領域：
：本發明涉及鱗翅目昆蟲家蠶(大造)的電壓門控鈉通道基因、編碼蛋白及其克隆方法。
背景技術：
：電壓門控鈉通道(VGSC)在神經元以及其它可興奮性細胞動作電位形成和傳導過程中扮演著極為重要的角色。當細胞膜去極化時，VGSC被電壓依賴性的激活，使胞外鈉離子選擇性通透進入胞內，形成動作電位的去極化相；VGSC在開放後幾個毫秒時段裡就會失活，失活的VGSC需要回到靜息狀態後才能再開放(Catteml，1992)。VGSC的細微突變或變化，將影響生理功能的異常(Laietal.，2003)。哺乳動物鈉通道基因亞型較多，如Navl.l-Navl.9和NavX，而昆蟲鈉通道基因的亞型相對較少，只發現2種亞型，即；^ra基因和A9C基因。其中，僅/ara基因編碼的鈉通道在體外得以表達和功能鑑定，而ASU基因功能尚未得到鑑定(GoIdin，2002)。目前已克隆和測序的昆蟲para直系同源鈉通道基因(para-orthologoussodiumchannelgene)有果蠅(Draso盧7a靴/cmogtwfer)的para基因、家蠅(她5:ccic/麵es"o)的Kssc/基因(也稱Mc基因)、菸草頓蟲CHeto決^w'r^ce""的/wcp基因、德國小蠊(5/ato//agmnam'ca)的para，基因、東亞鉗蠍(5w/n^mw加"w7)的5mWav7基因以及虎紋捕鳥蛛(O"油o"o麵/j,函)的OZi/Vav7基因(Loughneyetal"1989;Inglesetal.,19%;Miyazakietal.,19%;Parketal.,1999Zuoetal.,2002)。昆蟲鈉通道存在於包括感覺神經元在內的昆蟲神經系統，一般不表達在肌肉組織。細胞水平上的研究表明，昆蟲鈉通道在神經元的胞體與軸突上均有表達(Wicheretal.,2001)。鈉通道呈現出的亞型多樣性，為理解鈉通道在生理/病理下的功能特性及其動態平衡調控帶來了複雜性，同時，也正在引發通道藥理與毒理基因組學研究的挑戰性。在神經系統中，各亞型的鈉通道通常共表達於同一個細胞上(例如DRG神經元)，為了闡明各亞型參與的生理活動，有必要將各通道介導的電流成分分離，但由於鈉通道各亞型介導的宏觀電流性質接近，單用不同刺激方式無法獲得單一電流；而體外表達雖可以獲得單一亞型的信息，但表達體系以及輔助亞基的存在與否都會對通道的性質產生重大影響，而且失去了通道在體內時的複雜環境，增加了對鈉離子通道認識的難度以及應用。例如，目前臨床上癲癇、神經病理性痛等的治療藥物通常以鈉通道為靶器，但由於其選擇性不高，可能產生嚴重的副作用；昆蟲鈉通道是DDT和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的主要作用靶點，但長期使用和濫用會導致昆蟲產生抗藥性，昆蟲的para鈉通道基因突變與抗藥性密切相關(Williamsonetal.,1996;Soderlund&Knipple，2003)。因此，解析新型鈉通道亞型的基因編碼特徵，不僅有利於各亞型生理功能的闡明與藥理價值的評估，同時也為鈉通道關聯的臨床疾病治療藥物以及高效生物殺蟲劑的研製提供理論的可行性和新分子先導物的開發。
發明內容本發明的目的之一在於提供一種家蠶電壓門控鈉通道基因。本發明的目的之二在於提供該電壓門控鈉通道基因的編碼蛋白。本發明的目的之三在於提供該電壓門控鈉通道基因的克隆方法。為達到上述目的，本發明採用如下技術方案一種家蠶電壓門控鈉通道基因，其特徵在於該基因具有下列核苷酸序列之一(1)具有SEQNO1所示的DNA序列；(2)與序列表中SEQNOl限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。一種上述的家蠶電壓門控鈉通道基因的編碼蛋白，其特徵在於該編碼蛋白具有序列表中SEQNO2的胺基酸殘基序列或者是將SEQNO1的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQNO1的胺基酸殘基序列相同活性的由SEQNO1衍生的蛋白質。一種上述的家蠶電壓門控鈉通道基因的克隆方法，其特徵在於該方法的具體步驟為a.從家蠶的腦中提取總RNA;b.用SuperscriptII反轉錄酶和Oligo-(dT)引物合成cDNA;c.借鑑昆蟲Para鈉通道的保守胺基酸序列和家蠶基因組序列設計PCR引物，再採用PCR，得到家蠶鈉通道基因和完整開放閱讀框。圖1為家蠶鈉通道克隆策略。圖2為鈉離子通道的胺基酸序列比對圖。其中BomNav—家蠶；OhNavl—蜘蛛;para—果蠅；rNavl.2—鼠腦II型。具體實施方案實施例一電壓門控鈉通道基因的克隆1.家蠶腦總RNA的製備用Trizol抽提家蠶組織總RNA，具體方法如下(1)將家蠶蛹腦(約50mg)在液氮中碾磨成粉末狀後，轉移到一個無核酸酶的1.5ml離心管中；(2)加入lmlTrizol試劑，室溫下放置3分鐘；(3)加入200Wl的三氯甲垸，劇烈振蕩後，室溫下放置5分鐘；(4)4。C離心(12000rpm)15分鐘，取上清液，並轉移到新的1.5ml離心管中；(5)加入等體積的異丙醇，約500iil，室溫放置l-2小時；(6)4。C離心(12000rpm)15分鐘，棄上清液，得到白色沉澱；(7)加入lml75%的乙醇，清洗沉澱，略微振蕩後，4'C離心(7500rpm)5分鐘；(8)棄乙醇，37。C放置10分鐘，直到乙醇完全揮發；(9)加入50ulRnase-free水，溶解RNA。2.家蠶腦cDNA的合成在無核酸酶的PCR管中加入如下物質oligodT:l.Ou1totalRNA:l.Oug將混合物65。C加熱5分鐘後，立刻冰上放置2分鐘，加入如下物質dNTP(lOmMeach):2u15Xbuffer:4ulRnasin:1P1reverstranscriptase:1u1加水至20ul，混勻後，置PCR儀上按如下程序反應；42。C90分鐘99。C5分鐘4°C10分鐘即得到逆轉錄的cDNA。3.鈉通道基因片段的克隆根據鈉通道四個保守區域的胺基酸組成，利用家蠶基因組草圖，檢索家蠶的同源片段，找到三個同源克隆AADK01011234;AADK01013170;AADK01001488。借鑑昆蟲Para鈉通道的保守胺基酸序列和三個同源克隆，設計克隆家蠶鈉離子通道基因的PCR引物，得到各保守片斷S3,S4,S5(PCR儀為PE-2400(Perkin-Elmer，USA));根據克隆到的保守序列，利用家蠶基因組中相關的三個同源克隆，設計5'端和3'端PCR引物，用PCR的方法的到S1,S2，S6的片段，把S1到S6拼接即得到家蠶鈉通道的完整開放閱讀框的序列。設計的各片斷的PCR引物序列見表1。表l:PCR引物及所克隆出的片段tableseeoriginaldocumentpage6實施例二測序前準備1.電泳將PCR產物，在1.2%瓊脂糖凝膠，1倍的TAE的電泳緩衝液中，5V/cm電壓下電泳30分鐘左右，在紫外燈下檢測條帶。2.割膠回收具體步驟如下(1)在紫外燈下，用刀片將目的條帶切下，並轉移到無菌的1.5ml離心管中，稱重;以每IOOmg膠加入200ul溶膠液後，55。C加熱5分鐘，直至膠塊溶解；(2)膠融化後，將其轉入到一個收集管的凝膠吸附柱中，室溫放置2分鐘後，室溫離心(12000rpm)1分鐘；(3)取下凝膠吸附柱，棄收集管中的廢液，在將吸附柱放回後，加入700ul漂洗液，室溫離心(12000rpm)1分鐘；重複步驟(3)—次；(4)棄收集管中的廢液後，室溫離心(12000rpm)2分鐘;(5)取下吸附柱，將其轉入新的無菌的離心管中，37。C放置5分鐘，直至乙醇完全揮發；(6)加入55。C預熱的洗脫緩衝液35yl，室溫放置2分鐘，室溫離心(12000rpm)2分鐘，離心管中即為所要回收的DNA片段。3.回收片段連接到T載體在無菌的1.5ml離心管中加入如下物質PCR回收產物l.Oul連接液(含連接酶和緩衝液)5.0iUPMD19T-vector:1.On1滅菌蒸餾水3.0ul合計10Ul混勻後，16'C放置12小時。4.轉化(1)從-7(TC冰箱中取100u1感受態細胞懸液，室溫下使其解凍，解凍後立即置冰上；(2)加入連接產物(含量不超過50ng，體積不超過10ul)，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘；(3)42'C水浴中熱擊90秒，熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5分鐘；(4)向管中加入500ulLB液體培養基(不含安卞青黴素)，混勻後37'C振蕩培養1小時，使細菌恢復正常生長狀態，並表達質粒編碼的抗生素抗性基因；(5)將上述菌液搖勻後取100yl塗布於含安卞青黴素的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿，37'C培養16-24小時。5.質粒的抽提(1)細菌培養液置於1.5ml離心管內，冰上放置10分鐘，室溫離心(12000rpm)1分鐘，棄上清；(2)細菌懸浮於250ul溶液I中，劇烈振蕩，至細菌徹底懸浮；(3)向離心管中加入250ul溶液n，溫和的上下翻轉4-6次，使細菌充分裂解；(4)向離心管中加入350ul溶液m，溫和的上下翻轉6-8次，完全混勻，此時出現白色絮狀沉澱。室溫離心(12000rpm)IO分鐘，此時在離心管底部形成沉澱；(5)小心的將上清轉移到吸附柱中，室溫放置2分鐘，室溫離心(12000rpm)l分鐘，室溫放置2分鐘，室溫離心(12000rpm)1分鐘，倒掉收集管中的廢液，並將吸附柱重新放回收集管；(6)向吸附柱加入700ixl漂洗液，室溫離心(12000rpm)1分鐘，重複一次；(7)將吸附柱放回收集管中，室溫離心(12000rpm)2分鐘；(8)將吸附柱轉移到一個新的1.5ml離心管中，37。C放置5分鐘，直至乙醇完全揮發；(9)向吸附柱加入35ul洗脫緩衝液，室溫放置2分鐘後，室溫離心(12000rpm)2分鐘，離心管中收集到的即是所需質粒。6.測序將上述抽提的質粒進行測序。家蠶電壓門控鈉離子通道結構特徵分析1.家蠶電壓門控鈉離子通道結構特徵分析家蠶電壓門控鈉離子通道(BomNav)蛋白質內部有四個高度保守的同源結構域(Dl-D4)，且每一結構域含有六個a螺旋跨膜片段(S1-S6)，具有電壓門控鈉通道的所有關鍵性的結構1)BomNavl的S4片段具有鈉通道電壓感受器的共性，即在每隔2個疏水殘基有一個帶正電的Arg或Lys殘基，且鹼性胺基酸殘基數目和位置基本對應；2)BomNav與其它昆蟲電壓門控鈉通道蛋白在結構域TTT和IV之間的短鏈胞內環處(鈉通道失活化門控域)高度保守，它們在對應於哺乳動物鈉通道rNav1.2的三個關鍵殘基I,棚-F，-M，處也存在三個疏水性殘基(MFM);3)B顧av蛋白分子中形成鈉通道選擇性過濾器的胞內環(DEKA)和胞外環(EEDD)以及與TTX結合的關鍵殘基也都是保守的。通過胺基酸序列比對結果表明，我們克隆到的家蠶基因屬於電壓門控鈉離子通道的基因。2.電壓門控鈉離子通道蛋白序列比對圖2為家蠶鈉離子通道(BomNav)與蜘蛛(OhNavl)，果蠅(para),鼠腦II型(rNavl.2)電壓門控鈉離子通道基因所編碼蛋白序列比對圖。同源結構域(D1-D4)黃色背景標記，跨膜片段用框標註,S4中電壓感受器中正電荷胺基酸殘基用上劃線P標出。序歹U表上海大學〈120〉蠶電壓門控鈉通道基因、編碼蛋白及其克隆方法<210〉120人工序列引物Navl2s5'215'-TCCTCCATTGCCTTGAAACA-3，220人工序列引物Navl2a5'l25'-CATCATCGTAACGCACTTCT-3'318人工序列引物naV10s5'235'-TCAGCGAGGAAGAACGAA-3'424人工序列引物NaV7a5，145'-TCTATAACAGCACCGACGATCGTC-3，<210〉520人工序列引物NaV4sl55'-TGGAATTGGCTTGACTTCGT-3'623DNA引物NaV5as1.165'-CCCATCACCGCAAATATGAAAAT_3723人工序列引物NaV4s2.275'-ATCATTATTTTCATATTTGCGGT-3'823人工序列引物NaV4as285'-TTAGAACCCATTTTCTTCATGGC-3922人工序列<213〉引物NaV4s3.29'5'-GTGATCATCGACAACTTCAACG-3'1020人工序列引物NaV4as3105'-ATGACGGCGATGTACATGTT-3'1122人工序列引物Navl0s3'2115，-TGTCATTTCTTTTCTCATCGTC-3'1218人工序列引物Navl7a3'l<400〉125,_TTTCGGTACATTGACGTTTT—313412DNASl131tcctccattgccttgaaacatgtt￡Lt3Cttacgttcaac3atagtttacttttctg朋tt61tagtaa犯cg肌tgtgcgtgcgt犯aacaggactacacttgttctat,tttctgttttatt121tcttggatataattgtgtccaatatacgtcgacccacgtccaaccttttc犯3ttCCCt3181tttcaagtgacagttcactcgggg卿gtt241Cg￡ltag￡LCEl3tgtccgaggacttggactcgatcagcgagga￡iga<acga3gcttgttccga301cccttcacacgagagtctctggccgca已tcgaagcccgcata^gctgaetgagcatgccaag361化g已gg犯犯acgagcggaaggcgaggtgcgttacgatgatg14739DNAS2141tcagcgaggaag^cgaagcttgttccgacccttcacacgagagtctctggccgcaatcg61aagcccgcat已gctga卿gcatgccaagccgagcggaag121gcg已ggtgcgttacgatgatgaggatgaggacgagggtccccagccggacgctsccttgg181agcaaggtccaccactgccggtgcgcatgcaagggtccttcccgctcgaactcgcctcta241caccactcgaggacatcgaccccttctaccacaatcag已caaccttcgtagttataagca301ttttCggCg￡Lca犯tgctctgtgg3t3tt3361atccc已taaga卿gtggctatatacatattggtacatcctttgttttcgctgttcatta421ttacgacaatcttagtgaattgcatacttatgataatgcctaC￡L￡LCgCC￡Lacagttg犯a481gtactgaagttatctttaccgggatxtacacgtttgaatc3gCggtg3犯gtaatggcca541ggggttttatactax^gccattC￡LCataCCttagagatgcatgg犯Uggcttgacttcg601tagttatagctttagcttatgtgacgatgggcatagatctcggaaacctagccgctctga661gaacgttcagggtacteicgagCgttg3卿ctgtggccatagt織gggc721tcgtcggtgctgttataga152006DNAS3151tggaattggcttgacttcgtagttatagctttagcttatgtgacgstgggcatagatctc61ggaaacctagccgctctgagaacgttcagggtactacgagcgttgaagactgtggccata121gtaccgggcttga已gacg已tcgtcggtgctgttat已gaatccgtgaaa_a3tctccgtgat181gtaataattttaacgatgttttcgctgtccgtattcgcgttgatgggcctscagatttac241stgggagttttgscgcagaagtgtgtC3朋gt3ttCCCggaggacggctcttggggtaac301ctgaccgacg卿actgggagaggttttgtcag犯cgeiaactaactggtatgg卿aggg361ggtgattatcctttatgcggggggcaggacaatgcgaaccgggctacgtt421tgtcttcaaggcttcggtccaaatccaaaccaagctttgacaccttcggt481tgggcatttctatcagctttccgtctaatgacacaggatttctctatcaa541gatcagccggCtCgtggCELCtcg"tagtgataatattcctg601ggatctttttatctggtgaacttg已ttttggctatcgtcgccatgtcatatgatgagcta661CCg犯g犯g3Cttt3Cggg3ggc卿gcag721aaagcggc已gcg卿gcggacasacaagaagcacg卿agcccacgcgagagaacaagcg781gcggccgcggaggctgcagctt已cgccgaggcgcatcccgccaagtcgccgagtgacttc841tcctgtca犯gctacgagctgttcgtgaaccagg已gcggggcaaccaagacgacaatacc901cggg咖gcatgtccctacgtagcgaccccttccaggactcggaacacctgccttatgct961gatgactcga已cgctgtcacaccgatgtctgtgctatxatcatcccagtt1021t已ttatgcta已ttt已ggatcccgacattcttcatacacgtctcatcagtcacgtttgtct腿tacacgtctxgttgggcggagggaaagctcagctagatta1141cgcggcaggtccgcttctaggaaccacagtgtgacgtcacaacctcacgcctatccctta1201cctagacaagactcctcgct3gC￡Ltct3g3ccccttagagaagtacgact1261gagtgc織gacgaagctgg犯a已gttctgaaaccatcaagcgataatxc1321tcgtcacagcagcctaacgtagtgg已t已tgagagacgtMtggtattaaatgaaatcatt1381gacgtc卿gtcgggcgagcga^ca犯acgtgtcagtgtactacttccca1441acagccgaagacgatgaagatggacccacaaactactcgattgtctaatg1501a^gg￡L￡Lt￡lgacttcttctgtgtgtgggactgttgctggttgtggctcgagttccaa犯a1561tacgtagcgctgttggtgttcgatccattcgtcgagttgttCatCELCCCtctgtattgtt16211681174118011861192119811611211812413013614214815416016617217818419019611021108111411201126113211381144115011561gtgaatacactatttatggctctggaccatttaaaaagcggcaattatttcttcacggcgatagcaatgagcccga已stattatttcca已gtggccttatcactgcttgaattggggctttcgtttcgtttgcttcgagtattcaaattgatctctataatgggtaggacaatgggtgccattattttcatatttgcggtgatgggcataacatggataaagatatggacaaagcgacattcggcatagaaigcaaceLCtaaaattagagggatggaatatttttgatttcattattgagggtgttcagggUtgtcggtattacgagcaaagtcatggccgactcttaatttactcttgggcaacctgaccttxgtattgtgcatc162023DNAS416atcattattttcatatttgcggtgatgggttacgtagaccggtttcctgatggggaccttagttttatgatcgtattccgagtgctatgcatgttggttggagatgtatcttgcataccacttgtggtactgaatctcttcttagccctgtcaaccccaacagctgatcaagacacgaac已ggttcattgactggata犯acggaacgtcctcaccaatcagatagctatacacgcgcccgtctcctcagagcgggtcgacaacgaattactct3t已aagetc￡iag3aactc已aagatcaattcacaiaLt3ccaggtgacaat已已atacaaagc犯taacagttaatcacagggac犯tagacctattcaggatgacgacactataagtcaattc已aggatgaaagccac犯aggatcggccgcaagcaaagaggaacttgg已cttgaagaacttgatggtactttaggtaa犯cggat3tagatacaccagccgattgttgtccggagcaagacgacgactcgcctttttggcaaggctggattgaaaac已cttactttgagactgcagttttggcttt已g犯gacgtacatttaccacacatggatcgtatcttcactgttatattcttcggattcc犯aaatattttactaatgcttggtcgcttat￡L￡iscttcgtagcggcgctttgtatgagaacactgcgcgcactgcgcccgctcgttgttgtgaacgccctggtacaggcaattctaatattctggctcatcttcgccattatgaagtgcgttgatatgaatcacaccactctaatgcaactgttcggaaaaaattatgtcgatcctcggtggaacttcacggattttatgcacgg卿atggst卿aagcatgtgggattgttttttcttggcaaccgtcgttatcggaaacttgctctccaattttggttcctcgagcttaaaaatcgcgg已ggctttcaatagaatatcggcagacttcctcaagctactgaaaaacaaaggctt肌aagccgctttgtgtggtcgctgtgaactaggaactgacctcgatg已cgccgtagtcgaagtggctatcggagatggaatggaaaaaggtaaaattttg已tg已ataacataaatttagactgtgaactgaatcatcatggatataaatcttacggtagtcacaaaataagatcagatacgat已g3tgg已g3ag33aag8aagatg已已ttgattg3gg3agacg3agagggc已aa已已agtaggggccgatgaagacgttgttgattgctatcaaaagtttccatttcttgctggaggcactcttcggctcaaaacgttcaaactcattaccatgattttactgagtagtttagc已cgtcc犯t已cttc犯gacattctttattacattgagatgttgatcaagtggcttgctctctgctggcttgatttcatcattgtgatggtcggtgCCggaggCELttC6LggCgttC犯認g卿gccatgagccgcatgcagggcatgaggccatccatcttcaacgtactccttgtatgtggtgtccagctcttcgcaggaaaatacttt已gccacgaaatcattccggataaaaatgca1621tgcaccttagatgggaaaattC￡LCCa￡ltg￡LELCtttgatcacgtgggtaaa讓gcgtatttatgtctcttccaagtggca_acattcaaaggctggatccaaattatgaacgat1741gcaattgactctagggaggtgggacgtcagccgattcgagatacatgtac1801ctttactttgtgttcttcattatattcggttcattcttcactctcaatctgtttatcgga1861gtgatcatcgacaacttcaaaag犯agccgggggcagtctcgaaatgttc1921atgactgaagatc朋朋gaaatactataacgccatg肌gaaaatgggttctasatcgtcg1981acctgcaggcatgcaagcttggcgtaatcaggtcattgtgctt17905DNA<213〉S5171gtgatcatcgacaBcttc8iaggggcagtctCg333tgttC61atgactgaagatactataacgccatgaagsaaatgggttc121ttgaaagcgattccaagacc3aggtggcg已tcgtgttcgagatagtcact181gacaagaagtttgacatgattatcatgttgttcattggatcacgatgaca241ttggaccactaccagcagtcgga犯cgtttagcgccgtcctcgactatct301ttcat3gtgatatttagttcagagtgcctattgaaaatattcgccttacgttatcac.tat361tttgttgaaccatggaatcttttcgatttcgtcgtagttatgttttctattcttagcttg421gtgcttagtgacattatagaaaaatat111gtatctcctacgctactaagagtggtgcga481gtagcaaaagttggtcgagtccttcgactcgtga3鄉cgctaaagggat3Cg犯Cgttg541ttgttcgctttggctatgtcgctgccggctttgttcaatatttgcctactcttgttcctg601gtcatgtttatttttgccatattcggc3tgtcattcttcatgCBCgtta已已gacaa已ggt661ggtctggacgacgtgtataac11caaaacattcgtgcagagtELtgattttactgttccag721atgtcaacgtctgccggttgggatggagUttagatggtagga卿atgt781gatcttcccgacagcgaacgaggatcgcc已gg犯actgtggctctgcaaccataggcata841acttacctactatcataccttgtxatttcttttctcatcgtcatcaacatgtacatcgcc901gtcat18668DNAS6181tgtcatttcttttctcatcggtacatcgccgtcattctcgagaMtactcimageseeoriginaldocumentpage16196217DNA家蠶鈉通道19imageseeoriginaldocumentpage161381aatctctatcaattggtcttaagatcagccggctcgtggcacgtattgtttttcgtagtg1441ataatattcctgggatctttttatctggtgaacttgattttggctatcgtcgccatgtca1501tatgatgagctacagaagaasgccgaagsagaagaacaagcagaagaagaagctttacgg1561gaggcagagcaga犯gcggcagcgagagcggacaaaca^gaagcacgagasgcccacgcg1621agagaacaagcggcggccgcggaggctgcagcttacgccgaggcgcatcccgccaagtcg1681ccgagtgacttctcctgtcaaagctacgagctgttcgtgaaccaggagcggggcaaccaa1741gacgacaatacccgggaacgcatgtccctacgtagcgaccccttccaggactcggaacac1801ctgccttatgctgatgactcgaacgctgtcacaccgatgtctgaagaaaatggtgctatc1861atcatcccagtttattatgctaatttaggatcccgacattcttcatacacgtctcatcag1921tcacgtttgtcttacacgtctcacggggacttgttgggcggagggaaagctcaaactaag1981gaagctagattacgcggcaggtccgcttctaggaaccacagtgtgacgtcac犯cctcac2041gcctatcccttacctagacaagactcctcgctagcatctagaccccttagagaatatgaa2101gtaagtacgactgagtgcacagacg犯gctgg犯aagttctgaaaccatcaagcgataat2161ccgttcatagaatcgtcacagcagcctaacgtagtggatatgagagacgtaatggtatta2221aatgaaatcattgaacaagctggacgtcagagtcgggcgagcgaacaaaacgtgtcagtg2281tactacttcccaacagccgaagacgatgaagatggacccacacttaaggagaaactactc2341gattgtctaatgaaaggaatagacttcttctgtgtgtgggactgttgctggttgtggctc2401gagttccaaaaatacgtagcgctgttggtgttcgatccattcgtcgagttgttcatcacc2461ctctgtattgttgtgaatacactatttatggctctggaccatcataacatggataaagat2521atggacaaagcgttaaaaagcggcaattatttcttcacggcgacattcggcatagaagca2581acactaaaattaatagcaatgagcccgaaatattatttccaagagggatggaatattttt2641gatttcattattgtggccttatcactgcttgaattggggcttgagggtgttcagggtttg2701tcggtattacgatcgtttcgtttgcttcgagtattcaaattggcaasgtcatggccgact2761cttaatttactxatctctataatgggtaggacaatgggtgccttgggcaacctgaccttc2821gtattgtgcatcattattttcatatttgcggtgatgggtatgcaactgttcggaaaaaat2881tatgtcgattacgtagaccggtttcctgatggggaccttcctcggtggaacttcacggat2941tttatgcacagttttatgatcgtattccgagtgctatgcggagaatggatagaaagcatg3001tgggattgtatgttggttggagatgtatcttgcataccatttttcttggcaaccgtcgtt3061atcggaaaccttgtggtactgaatctcttcttagccctgttgctctccaattttggttcc3121tcgagcttatcaaccccaacagctgatcaagacacgaacaaaatcgcggaggctttcaat3181agaatatcgaggttcattgactggataaaacggaacgtcgcagacttxctcaagctactg3241aaa犯c朋actcaccaatcagatagctatacacgcgcccggctt朋aagccgctttgtgt3301ggtcgctgtgtctcctcagagcgggtcgacaacgaattagaactaggaactgacctcgat3361gacgccgtactctataaagaca^g犯actcaaagatcaagtcgatagtggctatcggagat3421ggastggatattcacsa^taccaggtgac33taaatacaasa^33ggt33aattttg3tgaat3481aacataaatgcaataacagttaatcacagggacaatagsttsgactgtgaactgaatcat3541catggeitatcctattcaggatgacgacactatgLagtcaaaetatcttacggtagtcacaaa3601ataagatcattcaaggatgaaagccacaaaggatcggccgatacgatagatggagaagaa3661aagaaagatgcaagcaaagagg幼cttggacttgaagaagaattgattgaggaagacgaa3721gagggcaaacttgatggtactttaggtaaaacggatataaaagtaggggccgatgaagac3781gttgttgatgatacaccagccgattgttgtccggagcaatgctatcaaaagtttccattt3841cttgctggagacgacgactcgcctttttggcaaggctggggcactcttcggctcaaaacg3901ttc幼actcattgaaaacsLcttactttgagactgcagttattaccatgattttactgagt3961agtttagcattggctttagaagacgtacatttaccacaccgtccaatacttcaagacatt4021ctttattacatggatcgtatcttcactgttatattcttcattgagatgttgatcaagtgg408141414201426143214381444145014561462146814741480148614921498150415101516152215281534154015461552155815641570157615821588159416001606161216181cttgctctcggtgatggtctttcaaaacgaggcatgagggcttgtatgtc3aaaatgc3tgtgggtaaag3tga3cgatgtacatgtacctttatcggaggaaatgttcaaaaaagccttatagtcactgacgatgacattatcactattcttagcttgggtggtgcgagcgaacgttgtUgttcctgggacaaaggtgctgttccagaga卿atgtgataggceitaatacatcgccgacagatgacgcagtacattaatccacaaaccttgccgctggttgt犯gtgttttgcgactagcctgcgtctttcgcaaggtaagtcaatggattcca犯acgcttat犯atg3g犯C3Ctttgttgtgaataatattctgagtgcgttgagcaccttag已cgtatttatgc犯ttgsctctttactttgttga/tc已tcgatg￡LCtg￡iagatgaaagcgat8C犯g犯gtttggaccactatcatagtgatttgttgaacctgcttagtgatgttcgcttttcatgtttatgtctggacgatgtcaacgtcatcttcccgacttacctacttcattctcga3CtaLcgax^tctaacaaatacgcgtccgcgtcgacaggaggtcgtctgcgg8LttC已g已agtgccctttttta^犯gcttEtttaaattaaaatattttactcttcgtagcggcgcgcactgcgccctggtagctcatcttctatgaatcacaaactatacatctcttccaat鄉g鄉tggttcttcattC￡L￡LCttcaaCtccaagaccatgacatgattccagcagtcgatttagttcastggaatctttggtcgagtcggctatgtcgttttgccatacgtgtat犯ctgccggttggcagcgaacgaatcataccttgaattactctgtact已cga已gctctcagatcaaaattataccgttcattttgttttgtgtcgtttaccgtacattccagtt犯ttcaatgtttttgtattacgtcaatgtaatgcttggtgcgctttgtgcgcccgctcacaggcaattcgccattatggaccactctaatggg犯a^ttgtggcaacatggacgtcagcatattcggtttactataacgaggtggcgacatcatgttgtgaaacgtttagagtgcctatttcgatttcgcttcgactcgctgccggcttttcggcatgtttca犯acatgatggagtUggatcgccaggtcatttcttcaggcaacagatctggcagcttccttgacgtcgatggacacatggacgtttcgcgtggcc33tgtgtgttg卿gaagcgaatagtgatttaataaatataccg犯agctggcttg已gtgccggagggagccatgagcatccatcttgtgtccagctgccacgaaatcacc犯tgaatcaa已ggctgcgattcg解acattcttcac卿鄉ccggccatgaagaatcattggattgcgccgtccttcgtagttattatctcctactg犯aggcgctgttc已atatcattcttcattcgtgc卿gtagatggt已tg肌actgtggttctcatcgt已agacgtgcaggttcgaccctcttggaacctaccgatatggttctttcgcgaagcttcagccgattcgtatatcgaccggtattgtaaggcactctacattttcatcattCattC￡LggCgccgcatgcagcaacgteLCtccttcgcaggacattccggatctttgatcacgatccaaatt犯ctaacgtatctcaatctggggcagtctcaatgggttctcgtgttcgaga已已catgctccgactatctccgccttacgtgttttctattgctactaagat已aagggatattgcctactcgcacgttaa3tatgattttatataaatgagctctgcaacccatcaacatggg卿gattg卿cggtagtgccattacaaccgcgagcgagattagagactgacagtttgtccgttcgtgagag犯tcgttatgaaattc201952PRT家蠶鈉通道18formulaseeoriginaldocumentpage19權利要求1.一種家蠶電壓門控鈉通道基因，其特徵在於該基因具有下列核苷酸序列之一(1)具有SEQNO1所示的DNA序列；(2)與序列表中SEQNO1限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。2.—種根據權利要求1所述的家蠶電壓門控鈉通道基因的編碼蛋白，其特徵在於該編碼蛋白具有序列表中SEQNO2的胺基酸殘基序列或者是將SEQNO1的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQNO1的胺基酸殘基序列相同活性的由SEQNO1衍生的蛋白質。3.—種根據權利要求1所述的家蠶電壓門控鈉通道基因的克隆方法，其特徵在於該方法的具體步驟為-a.從家蠶的腦中提取總RNA;b.用SuperscriptII反轉錄酶和Oligo-(dT)引物合成cDNA;c.借鑑昆蟲Para鈉通道的保守胺基酸序列和家蠶基因組序列設計PCR引物，再採用PCR，得到家蠶鈉通道基因與完整的開放閱讀框。全文摘要本發明涉及一種家蠶(大造)的電壓門控鈉通道基因、編碼蛋白及其克隆方法。本發明的一種電壓門控鈉通道基因具有SEQNO1所示的DNA序列。該電壓門控鈉通道基因的編碼蛋白具有SEQNO2所示的胺基酸序列。該電壓門控鈉通道基因的克隆方法的具體步驟為首先從家蠶的腦中提取總RNA；然後用SuperscriptII反轉錄酶和Oligo-(dT)引物合成cDNA；借鑑昆蟲Para鈉通道的保守胺基酸序列和家蠶基因組序列設計PCR引物，採用PCR的方法，得到各片段的克隆並測序；把各片段拼接得到家蠶鈉通道基因的序列。本發明利用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和PCR方法，得到家蠶鈉通道基因的序列和完整的開放閱讀框。利用所克隆出來的核苷酸推定的編碼蛋白，與其他已克隆的鈉通道蛋白序列作比對，進行結構分析。文檔編號C12N15/10GK101386853SQ200810201959公開日2009年3月18日申請日期2008年10月30日優先權日2008年10月30日發明者悅孫,宋紅生,欣沈申請人:上海大學