受體類分子靶向顯像劑及其製備方法和應用與流程

2023-12-10 06:12:02 2

本發明屬於醫學影像技術領域，具體涉及一類受體靶向顯像劑及其製備方法。

背景技術：

乳腺癌嚴重威脅著女性的健康與生命，據2015年癌症統計數據表明，乳腺癌發病率居於女性惡性腫瘤首位。早期診斷是治療乳腺癌的關鍵。1978年，Lippman等人通過實驗得出大約70％-80％的乳腺癌患者會過度表達雌激素受體的結論。而今，雌激素受體的分布和水平是乳腺癌預後因素關鍵的項目之一，臨床上根據雌激素受體的狀況來決定病人使用抗雌激素類藥物的用量。

目前，臨床上主要應用病理學的方法來檢測和定量乳腺癌受體類型。這種病理切片的方法需要有創操作來獲取組織，給病人帶來了極大的痛苦，並且很難獲取轉移灶和復發灶的組織，更不能動態檢測腫瘤標誌物的表達情況。

在過去的20多年裡，隨著分子影像技術的不斷發展，PET顯像技術在檢測癌症中的應用日益增多。PET顯像技術具有實時動態，多元精準，在體無創，快速便捷等優勢，因此PET顯像技術是實現乳腺癌早期診斷的理想途徑。

分子影像探針作為PET顯像技術的核心，決定著PET顯像技術的發展。1984年，Kiesewetter等人合成並標記了16α-18F-17β-雌二醇(18F-FES)，18F-FES是以對雌激素受體具有親和力的雌二醇分子為骨架，在其C-17位標記18F得到的。1984年，Kiesewetter等人發表了18F-FES的製備方法，並證明了18F-FES對雌激素受體蛋白具有很好的相對結合能力(RBA)，之後又對未成熟的大鼠做了生物分布實驗，發現大鼠雌激素受體豐富的子宮的攝取明顯高於其他組織和器官。1988年，Mintun等人第一次嘗試對18F-FES進行臨床研究，13位患者通過18F-FES-PET顯像的方式確診為乳腺癌，最重要的是，從顯像圖中可以清晰觀察到轉移灶的情況。到目前為止，18F-FES已經成為最成功的雌激素受體顯像劑，並已進入臨床II期實驗。但是，18F-FES也有一些局限性，即由於18F-FES脂溶性高，主要經肝代謝，經腎臟排出體外，代謝速率很快，所以很難有效富集於靶組織和器官。

為了改善18F-FES在體內的代謝情況，使其更好的作用於靶向部位，人們合成並標記了許多種17β-雌二醇衍生物，作為雌激素受體顯像劑。1990年，Katzenellenbogen等人合成了一系列C-11位C-17被炔基取代的雌二醇類似物，分別是17α-炔基-雌二醇，17β- 炔基-雌二醇，11β-甲氧基-雌二醇和11β-乙基-雌二醇。通過對各探針進行大鼠生物分布實驗，並與18F-FES的實驗結果進行對比得出取代基的引入可以增強17β-雌二醇體內攝取的選擇性。2013年，Michel等人提出4-氟-11β-甲氧基-16α-[18F]氟化雌二醇(4FMFES)在對雌激素受體陽性鼠源乳腺癌(MC7-L1和MC4-L2)腫瘤PET顯像的腫瘤攝取要高於18F-FES。對18F-FES進行構型改造的例子有很多，但是這些改造都沒有真正的降低 18F-FES的脂溶性，有的甚至使其脂溶性增加，這些性質限制了該類探針的發展。

技術實現要素：

本發明的首要目的在於提供一類具有優良顯像性能的雌激素受體靶向顯像劑。

本發明的另有目的在於提供上述受體靶向顯像劑的合成和標記方法。

本發明的再一目的是提供上述受體靶向顯像劑在腫瘤顯像中的應用。

本發明的具體技術方案如下：

一類受體靶向顯像劑，其特徵在於：該探針具有一個聚乙二醇短鏈，通過「點擊」反應與靶向雌激素受體的17α-炔雌醇相連接，該顯像劑具體結構通式如下：

一類上述受體靶向顯像劑的製備方法，包括如下步驟：

1)將化合物1和對甲基苯磺醯氯以摩爾比(1-5)：(2.5-15)的比例混合，在三乙胺作用下，得到化合物2；

2)將化合物2與疊氮化鈉以摩爾比(1-5)：(5-1)的比例混合，得到化合物3；

3)將化合物3標記18F，得到化合物4；

4)將化合物4與17α-炔雌醇發生「點擊」反應，得到目標標記產物化合物5。

其合成與標記路線為：

在本發明中，18F為放射性顯影作用，18F也可以替換為其它常規用於顯象劑的放射性元素，此應視為本發明的等同替換。

本發明將PEG鏈一端標記上18F，並通過「點擊」反應與對雌激素受體有高親和力的炔雌醇相連接，得到一個新型的雌激素受體靶向顯象劑化合物5。從理論上講，這種結構修飾即對雌激素本身改變不大，又降低其脂溶性，從而降低了肝代謝速率，提高了腫瘤對放射性藥物的攝取。初步研究結果表明，雌激素受體靶向顯象劑化合物5具有優良的生物性能，包括：對未成熟大鼠生物分布實驗時，子宮和卵巢對化合物5的攝取要明顯高於其他組織和器官對化合物5的攝取；對雌激素受體陽性的人源乳腺癌(MCF-7)腫瘤PET顯像時，腫瘤攝取明顯高於肌肉，並且這種攝取可以被抑制；雌激素受體陰性的人源乳腺癌(MDA-MB-231)腫瘤PET顯像時，發現MDA-MB-231腫瘤攝取明顯低於MCF-7腫瘤，這些實驗都充分說明化合物5對雌激素受體具有很高的特異性。另外，化合物5的製備方法簡單、成本低，有望在臨床上得以推廣應用。

本發明的有益效果是：

(1)本發明的雌激素受體靶向顯像劑，具有雌二醇骨架，同時具有良好的化學穩定性和生物分布性質，比活度高，靶向性強，製備方法簡便易行，可用於進行雌激素受體陽性腫瘤PET顯像。

(2)本發明受體靶向顯像劑具有優良的生物性能。在雌激素受體陽性腫瘤中具有較高的攝取，且攝取具有特異性，滿足用作雌激素受體顯像劑的條件，靶與非靶比值高，明顯優於已有的18F-FES。另外，較低的非靶臟器攝取能夠減少不必要的放射性損傷。

附圖說明

圖1化合物5(下)及其標準品(上)的高效液相色譜(HPLC)分析圖；

圖2化合物5的細胞飽和結合曲線(A)；在5-90min內，MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞對化合物5的攝取實驗以及在30-90min內，被抑制劑抑制後的MCF-7細胞對化合物5的攝取(B)；MCF-7細胞被抑制前後對化合物5的攝取對比(C)；MCF-7細胞與MDA-MB-231細胞對化合物5攝取的對比(D)。

圖3化合物5在正常未成熟的大鼠體內1小時時的組織分布情況，不同組織器官攝取值以每克組織百分注射劑量率(％ID/g)的形式表示；

圖4 18F-FES在正常未成熟的大鼠體內1小時時的組織分布情況，不同組織器官攝取值以每克組織百分注射劑量率(％ID/g)的形式表示；

圖5化合物5在荷MCF-7瘤裸鼠體內的PET顯像(A)以及腫瘤和肌肉對化合物5攝取的對比(B)；腫瘤和肌肉攝取的比值(C)。

圖6化合物5在被雌激素受體抑制劑處理後的MCF-7瘤裸鼠體內的PET顯像(A)以及經抑制劑處理和未經處理實驗中腫瘤攝取值的對比(B)；

圖7化合物5在荷MDA-MB-231瘤裸鼠體內的PET顯像(A)以及該實驗結果與MCF-7腫瘤對化合物5攝取值的對比(B)。

圖8 18F-FES在荷MCF-7瘤裸鼠體內的PET顯像(A)以及該實驗結果與MCF-7腫瘤對化合物5攝取值的對比(B)。

具體實施方式

以下通過化合物5的具體實施方式結合附圖為本發明的技術方案進行進一步的說明和描述。

1.化合物5的製備

1)化合物2的合成：

0℃時，將1.5g化合物1和1.7mL三乙胺溶解在10mL二氯甲烷中，加入4.77g對甲基苯磺醯氯，室溫反應5小時。反應結束後，用二氯甲烷萃取反應液三次，收集有機相併旋蒸除去溶劑。將產物過矽膠柱，流動相比例為石油醚：乙酸乙酯＝2：1。得到純白色晶體即為化合物2。

2)化合物3的合成：

將0.65g疊氮化鈉完全溶解於10mL N,N-二甲基甲醯胺中，加入4.59g化合物2，室溫攪拌5小時。反應完成後，用50mL乙酸乙酯溶解，用40mL去離子水洗滌，收集有機相併旋蒸除去溶劑。產物用矽膠柱純化，流動相比例為石油醚：乙酸乙酯＝2：1。得到淺黃色油狀物質即為化合物3。

3)化合物4的標記：

將18F-富集到QMA柱上，再將4mg碳酸鉀和13mg 4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮雙環[8.8.8]二十六烷溶於1mL溶劑中(乙腈：水＝9；1)，用該溶液將淋洗QMA柱。在100℃時，用氮吹儀將溶劑吹乾，並另加三次無水乙腈吹乾，保證體系無水。將化合物3溶於0.5mL無水乙腈加到吹乾的18F-中，20℃反應20min。反應產物用C18柱進行分離，用1mL四氫呋喃淋洗。得到淺黃色液體。

4)化合物5的標記：

將2mg 17α-炔雌醇，2mg二異丙基乙基胺和1mg碘化亞銅分別加入到化合物4的四氫呋喃溶液中，60℃反應20min。通過放射性-HPLC純化，放射化學純度大於99％。高效液相色譜儀條件為：C18柱(250×4.6mm，5μm)，流動相A相為水，B相35％乙腈，流速4mL/min。

以上述化合物5顯像劑為例，實驗結果表明，其基本性能如下：

1.化合物5的細胞實驗

A.MCF-7細胞的飽和結合實驗

1)將形成單層貼壁細胞的孔板(24孔板)取出，小心吸出所有培養基，然後向每個孔板中加入0.5mL培養基，再吸出以洗去表面死去或脫落的細胞。這時將孔板舉起，透過光線從底部觀察，可看見孔板底部有一層均勻的細胞膜，以均勻且沒有明顯脫落的區域為好。

2)取適量HPLC純化後的化合物5溶液，用培養基稀釋，得到1-100nM的化合物5，將不同濃度的化合物加入到細胞中進行培養，加蓋室溫放置1h。

3)用1mL PBS(pH＝7.4)洗三次，在用1mL氫氧化鈉孵育5-10min。然後用移液器吸頭輕刮板孔底部，使細胞完全脫離，吸取孔板內所有溶液和細胞於小試管中。用γ計數器檢測每管的放射性。

由圖2A並經軟體計算可知，化合物5的解離常數Kd為26.54nM，最大結合量Bmax為1.12×104/細胞。

B.細胞攝取及抑制實驗

步驟1)同上訴MCF-7細胞的飽和結合實驗步驟1)

2)取適量HPLC純化後的化合物5溶液，用培養基稀釋，放射性量稀釋為3μCi/mL。

3)首先向抑制組孔板中加入10μL雌二醇溶液(1mg/mL)，然後向所有孔板中分別加入100μL稀釋好的化合物5，加蓋室溫放置5-90min。

步驟4)同上訴MCF-7細胞的飽和結合實驗步驟3)。

如圖2B，2C和2D所示，雌激素受體陽性的MCF-7的攝取要遠遠高於雌激素受體陰性的MDA-MB-231細胞，並且MCF-7細胞的攝取可以被抑制劑抑制。說明化合物5在體外層面對雌激素受體具有高特異性。

2.化合物5及18F-FES的正常大鼠生物分布實驗

正常大鼠生物分布實驗選用3-4周齡的雌性SD大鼠。大鼠尾靜脈注射1.85MBq化合物5或者18F-FES，於注射後1小時進行生物分布實驗。各個器官對化合物5的攝取情況如圖3A所示，其中富含雌激素受體的器官子宮和卵巢的攝取要明顯高於其他組織和器官，並且肝的攝取很低。說明化合物5在體內層面對雌激素受體具有很強的靶向性。對於抑制組，首先用氟維司群處理實驗大鼠，然後尾靜脈注射化合物5，從圖3B可以看出，抑制組子宮的吸收明顯低於正常組，說明化合物5對雌激素受體的特異性高。

各個器官對18F-FES的攝取情況如圖4所示，其中子宮和卵巢的攝取略高，肝臟有很高攝取，即非特異性攝取高。相比之下，18F-FES對富含雌激素受體的器官的親和性要低於化合物5。

3.化合物5在乳腺癌模型小鼠體內PET顯像

選用8周大的Balb/c雌性裸鼠，於右肩種植雌激素受體陽性的MCF-7腫瘤和雌激素受體陰性的MDA-MB-231腫瘤。待腫瘤長至直徑為0.5-1cm時進行PET顯像，每隻裸鼠通過尾靜脈注射約5.92MBq化合物5，於注射後0.5h，1h和2h分別用異氟烷進行吸入式麻醉，俯臥固定後進行靜態掃描成像。MCF-7模型裸鼠的PET顯像結果如圖5所示。由顯像結果可知，雌激素受體陽性的乳腺癌腫瘤對化合物有很高的攝取，這種攝取隨時間的 變化不明顯，並且還有很高的靶與非靶比，說明化合物對雌激素受體陽性的腫瘤具有靶向性。

如圖6所示為用氟維司群預處理的MCF-7模型裸鼠的PET顯像結果，從圖像可知，在氟維司群將腫瘤的雌激素受體充分破壞後，MCF-7模型裸鼠的腫瘤幾乎不攝取化合物5，由此證明了化合物5對雌激素受體具有特異性。

MDA-MB-231模型裸鼠的PET顯像結果如圖7所示，從圖中可以看出，MDA-MB-231模型裸鼠的腫瘤幾乎不攝取化合物5，化合物5隻在雌激素受體陽性的腫瘤中有高攝取，而在雌激素受體陰性腫瘤中的攝取量與非靶組織攝取量相近，證明了化合物5對雌激素受體的特異靶向性。

每隻裸鼠通過尾靜脈注射約5.92MBq18F-FES，於注射後0.5h，1h和2h分別用異氟烷進行吸入式麻醉，俯臥固定後進行靜態掃描成像。MCF-7模型裸鼠的PET顯像結果如圖8所示。MCF-7腫瘤對18F-FES的攝取遠遠低於對化合物5的攝取，說明化合物5對雌激素陽性的腫瘤的靶向性要優於18F-FES。

以上所述，僅為本發明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發明實施的範圍，即依本發明專利範圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明涵蓋的範圍內。