金納米顆粒作為佐劑在製備病毒樣顆粒疫苗中的應用的製作方法

2023-12-10 07:59:37 1

本發明涉及金納米顆粒的新用途，特別涉及金納米顆粒在製備病毒樣顆粒疫苗佐劑中的應用，本發明屬於獸藥研究技術領域。

背景技術：

病毒樣顆粒(viruslikeparticles，vlps)是由病毒衣殼蛋白自組裝形成的具有與完整病毒粒子相同形狀的納米級顆粒，由於其不含病毒基因組，不具有複製能力，因此不具有感染性。vlps疫苗具有安全性高，製備方法簡單及成本低等優點使其成為國際疫苗研究領域中的熱點，並已在人和動物的多種傳染病、抗腫瘤等方面取得進展。已經商品化的vlps疫苗有B肝疫苗、人乳頭狀瘤疫苗與戊肝疫苗。但由於病毒樣顆粒與滅活病毒相比，細胞免疫水平較低，容易降解，免疫持續期不理想等。因此需要尋求一種良好的佐劑提高vlps疫苗的免疫優勢，促進其推廣應用。

常規佐劑有鋁鹽佐劑，油乳佐劑，脂質體與免疫刺激複合物等，但由於這些佐劑或多或少存在缺陷，其優化還在進行中。近年來，納米顆粒逐漸成為疫苗載體與佐劑的研究熱點。納米材料指的是材料尺寸或其組成單元在三個維度中至少有一個維度處於0.1nm～100nm，其由於小尺寸效應、表面界面效應、以及量子隧道效應而具有獨特的理化性質等，而且它還是巨噬細胞樹突狀細胞(dc)的首選吞噬目標，有助於抗原在細胞內加工，能與主要組織相容性複合體(mhc)特異性結合、運輸並遞呈給效應細胞，增強機體產生天然免疫應答以及沒有自身免疫原性。

本發明初次嘗試將金納米籠(aunc)與金納米星(auns)作為口蹄疫病毒vlps的佐劑進行應用，並進行了一系列驗證和條件摸索，證實aunc與auns可以作為口蹄疫病毒vlps的佐劑，產生針對口蹄疫病毒高免疫反應，本發明的提出為口蹄疫病毒vlps疫苗的應用提供了新的優勢佐劑。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠有效的提高口蹄疫病毒vlps的免疫效果，更好的促進vlps疫苗產生細胞免疫與體液免疫的佐劑。

為了達到上述目的，本發明充分利用金納米材料的優勢，嘗試以金納米籠(aunc)或金納米星(auns)作為口蹄疫病毒vlps的佐劑，通過體外實驗、細胞實驗、以及體內實驗進行驗證，確定金納米顆粒在一定濃度下不存在細胞毒性，可以與vlps進行結合，並促進巨噬細胞的吞噬能力，提高vlps疫苗的免疫效果。

因此，在此基礎上，本發明提出了金納米顆粒作為佐劑在製備病毒樣顆粒疫苗中的應用。

其中，優選的，所述的金納米顆粒為金納米籠或金納米星。

其中，優選的，所述的病毒樣顆粒疫苗為口蹄疫病毒顆粒疫苗。

其中，優選的，所述的病毒樣顆粒疫苗中，病毒樣顆粒與金納米顆粒的質量比為1.5-3:1，更優選為2.5:1。

進一步的，本發明還提出了一種口蹄疫病毒顆粒疫苗，含有o型口蹄疫病毒樣顆粒以及佐劑，其中，所述的o型口蹄疫病毒樣顆粒是由o型口蹄疫病毒的衣殼蛋白vp0、vp1以及vp3組裝而成，所述的佐劑為金納米顆粒。

其中，優選的，編碼所述vp1的基因序列為seqidno.1所示，編碼所述vp0的基因序列為seqidno.2所示，編碼所述vp3的基因序列為seqidno.3所示。

其中，優選的，所述的金納米顆粒為金納米籠或金納米星。

其中，優選的，所述的口蹄疫病毒顆粒疫苗是通過以下方法製備得到的：

(1)口蹄疫衣殼蛋白vp0、vp1以及vp3的表達及純化

編碼vp1的基因序列為seqidno.1所示，編碼vp0的基因序列為seqidno.2所示，編碼vp3的基因序列為seqidno.3所示；

(2)口蹄疫病毒樣顆粒的體外組裝

將步驟(1)純化後的口蹄疫衣殼蛋白vp0、vp1以及vp3進行體外組裝，得到o型口蹄疫病毒樣顆粒；

(3)金納米顆粒與口蹄疫病毒樣顆粒的結合

將o型口蹄疫病毒樣顆粒與金納米籠或金納米星按照質量比為1.5-3:1的比例混合，優選按照2.5:1的比例混合，在4℃條件下結合12-24h，然後將結合產物進行離心，棄去上清液，沉澱即為結合有金納米顆粒的o型口蹄疫病毒樣顆粒。

更進一步的，本發明還提出了所述的口蹄疫病毒顆粒疫苗在製備預防或治療口蹄疫藥物中的用途。

本發明嘗試將金納米顆粒作為口蹄疫病毒vlps的佐劑，應用其潛在的運載能力、保護蛋白免受降解的能力以及利於巨噬細胞吞噬的特性，將vlps成功運載並能在動物體內釋放，最終刺激機體產生有效免疫應答反應。結果顯示，金納米顆粒與vlps結合產物注射進入動物體內後，能有效的釋放運載的vlps，最終誘導特異的抗體免疫反應與t-淋巴細胞免疫反應。這些結果表明，金納米顆粒可以作為vlps的佐劑在動物機體內有效刺激機體產生特異的免疫反應。本發明的提出為vlps疫苗尋找新型佐劑進行了一次新的嘗試與創新。

附圖說明

圖1為誘導表達及純化後的vp0、vp1和vp3的sds-page結果；

註：泳道1：marker，泳道2：buffera洗脫液，泳道3：bufferb洗脫液，泳道4-7：純化的目的蛋白。

圖2為除去小泛素化修飾的標籤蛋白的vp0、vp1和vp3的sds-page結果；

泳道1：marker泳道2：酶切前泳道3：酶切後去his。

圖3為組裝得到的vlps的nano-size測定結果；

測量結果顯示，vlps的水合直徑4.826nm佔3.7％，32.71nm佔96.3％。

圖4為使用液相色譜儀觀察組裝得到的vlps的結果；

圖5為金納米籠與金納米星的粒徑圖；

1：aunc的透射電鏡圖2：通過nano-size測量的aunc粒徑3：auns的透射電鏡圖4：通過nano-size測量的auns粒徑；

圖6結合產物的sds-page結果；

第一泳道：marker，第二泳道：aunc-vlps的結合物，第三泳道：auns-vlp的結合產物。

圖7為通過nano-size測量結合前金納米顆粒與vlps的粒徑及結合後產物的粒徑；其中圖a為金納米籠與vlps的結合產物；圖b為金納米星與vlps的結合產物；

圖8為金納米顆粒在一定濃度下的細胞毒性結果；

1：aunc對bhk細胞毒性2：aunc對raw264.7細胞毒性3：auns對bhk細胞毒性4：auns對raw264.7細胞毒性。

圖9為巨噬細胞吞噬實驗結果；

圖10為豚鼠血清抗體效價的elisa檢測結果；

圖11為t淋巴細胞增殖實驗結果。

具體實施方式：

下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。

實施例1o型口蹄疫病毒樣顆粒疫苗的製備

1、口蹄疫衣殼蛋白vp0、vp1以及vp3的表達及純化

(1)小泛素樣修飾蛋白融合表達載體psma以及psmk的構建：

a.以釀酒酵母基因組dna為模板，以smt3f與smt3r為引物擴增smt3基因，引物序列如下：

smt3f：5』gccatgggtcatcaccatcatcatcacgggtcggactcagaagtcaatcaa3』，

smt3r：5』ggatccgagaccttaaggtctcaacctccaatctgttcgcggtg3』，

b.經ncoi和bamhi雙酶切後將smt3基因插入到用同樣內切酶處理的pet-28a載體中，所得載體為psmk，將psmk的卡那黴素抗性基因替換為氨苄青黴素抗性基因，得載體psma；

(2)口蹄疫結構蛋白基因重組表達載體的構建

根據已公布的o型口蹄疫病毒的序列(genbank登陸號：jn998085.1)，參考hoover等的方法(hooverdm1,lubkowskij.dnaworks:anautomatedmethodfordesigningoligonucleotidesforpcr-basedgenesynthesis.nucl.acidsres.(2002)30(10):e43.)進行密碼子優化併合成結構蛋白基因vp0，vp3和vp1。

以合成的基因為模板，用以下引物對分別擴增vp0，vp1以及vp3基因片段：

vp1f：5』ggtctctaggtaccaccagcacgggcgaa3』

vp1r：5』cgcggatcctcacagactttgtttgaccgg3』

vp0f：5』ggtctctaggtggtgcgggccagtcatctcc3』

vp0r：5』cgcggatcctcattctttactcggaaattc3』

vp3f：5』ggtctctaggtggtatcttcccggtggcgtg3』

vp3r：5』cgcggatcctcattgctgacgggcatcaacc3』

採用聚合酶鏈式反應(pcr)方法，分別用引物vp1f/vp1r、vp3f/vp3r和vp0f/vp0r擴增獲得編碼vp1、vp0以及vp3基因片段，其中，編碼vp1的基因序列為seqidno.1所示，編碼vp0的基因序列為seqidno.2所示，編碼vp3的基因序列為seqidno.3所示；擴增獲得的vp1、vp0以及vp3基因片段分別經bsmbi/bamhi雙酶切後插入經bsai酶切處理的psmk或psma，所構建重組表達載體分別命名為psmk/vp0，psmk/vp1以及psma/vp3，以psmk/vp1為模板，以t7bamhi/vp1xhoi為引物擴增獲得含t7啟動子等原核表達元件和vp1基因的dna片段，經bamhi/xhoi雙酶切後插入用同樣酶切處理的psmk/vp0中，所得雙表達重組載體命名為psmk/vp0-vp1；所述t7bamhi/vp1xhoi引物序列為：

t7bamhi：5』gcaattggatcccgtccggcgtagaggatcga3』

vp1xhoi：5』gcgcacctcgagtcacagagtctgtttctcagg3』

(3)衣殼蛋白的表達及純化

將表達載體psmk/vp0-vp1和psma/vp3共轉化到表達菌bl21(de3)。用卡那黴素和氨苄青黴素篩選陽性克隆。挑選陽性克隆菌於雙抗性lb培養基中37℃220rpm過夜培養。將上述菌液以1:100接種lb培養基，於37℃、220rpm培養至菌液的od600達0.6左右，以終濃度為1mmiptg、25℃過夜誘導表達，隨後以5000rpm、30min離心收集菌體沉澱，-20℃儲存備用。

用10-20ml冰浴的緩衝液a(5mmtris-hcl，500mmnacl，20mmimidazol，0.1％tritonx-100，ph＝8.5)重懸細菌沉澱，超聲破碎菌體細胞(超聲時間3s，間隔時間3s，共24min，功率200w)。12,000rpm離心20min，取上清，棄沉澱，重複一次後，將上清與ni-ntahis·bindresins混勻，4℃結合1h。用緩衝液a洗五次，每次加入五倍柱體積的緩衝液，然後加入2ml緩衝液b(20mmtris-hcl，500mmnacl，45mmimidazol，0.1％tritonx-100，ph＝8.5)洗脫，目的是洗去非特異性結合的雜蛋白，最後用緩衝液c(20mmtris-hcl，500mmnacl，500mmimidazol，0.1％tritonx-100，ph＝8.5)洗脫目的蛋白，將洗脫的目的蛋白進行sds-page檢測，結果顯示獲得了預期大小的蛋白質(如圖1)。將目的蛋白加入10％甘油，-70℃保存備用。

2、口蹄疫病毒vlps的體外組裝

將純化得到的目的蛋白放置在酶切緩衝液(50mmtris-hcl，150mmnacl，ph＝8.0，0.2％tritonx-100，1mmdtt)中，37℃在ep管中酶切2h。將酶切混合物通過ni-ntahis·bindresins除去小泛素化修飾的標籤蛋白，收集含有vp0、vp1和vp3的流穿液(如圖2)。將流穿液放置在組裝緩衝液(20mmtris-hcl，500mmnacl，1mmcacl，ph＝8.0)中，組裝時整個緩衝體系置於攪拌儀上，使緩衝液輕微攪動，4℃過夜組裝vlps。

過夜組裝的vlps經過nano-size進行測定：將1ml的vlps組裝液經過0.22μm的濾網進行過濾，將過濾後的液體加到測量杯中進行測量。如圖3所示，在此條件下組裝的病毒樣顆粒水合直徑測量結果主要在30-40nm之間。進一步經過蔗糖密度梯度離心測定vlps：將不同濃度的蔗糖(45％的蔗糖3g，35％的蔗糖2.88g，25％的蔗糖2.76g，5％的蔗糖2.64g)加入到密度梯度離心管中，並放置在4℃靜置過夜分層，將組裝好的vlps上樣，38000rpm，4℃離心3.5h，然後通過液相色譜儀進行觀察，結果顯示口蹄疫病毒樣顆粒進行了組裝(如圖4)。

3、金納米籠與金納米星的形貌

將中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所所合成的金納米籠與金納米星通過透射電鏡觀察，並通過nano-size進行測量。如圖5所示，金納米籠的粒徑主要在60-70nm之間，金納米星的粒徑主要在70-80nm之間。

4、金納米顆粒與vlps的結合

將o型口蹄疫病毒vlps與aunc或auns按照質量比為2.5:1的比例，4℃條件下結合12h，得到金納米顆粒與vlps的結合產物，分別命名為aunc-vlps以及auns-vlps。然後將結合產物13000rpm，4℃離心10min，棄去上清液，用pbs水將沉澱重懸，進行sds-page。結果表明金納米顆粒能與vlps結合(如圖6)。通過nano-size測量結合前金納米顆粒與vlps的粒徑及結合後產物的粒徑進一步確定金納米顆粒可以與vlps進行結合(如圖7)。

實施例2金納米顆粒的細胞毒性實驗

在37℃，5％co2培養箱中培養2天的倉鼠腎細胞(bhk)，小鼠腹腔巨噬細胞(raw264.7)，用胰酶進行消化，棄去胰酶後加入含有10％犢牛血清的dmem培養液，輕輕將細胞吹打起來，進行細胞計數，將細胞稀釋成106個/ml，加入96孔板中，每孔加入100μl細胞液，在37℃，5％co2培養箱中培養24h，留出對照孔，棄去原有的培養液，加入不同濃度(5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml)的aunc與auns，每個濃度設置3個重複，然後放置在37℃，5％co2培養箱中分別培養24h，48h和72h，培養結束後向每孔中加入20μlmts，在溫箱中放置4h，用酶標儀測定490nm處的吸光度值。細胞活性在75％以上認為沒有細胞毒性。實驗證明在aunc、auns濃度達到400μg/ml，培養72小時的情況下細胞的存活率都在75％以上，因此認為金納米顆粒在此濃度下沒有細胞毒性(如圖8)。

實施例3金納米顆粒對巨噬細胞吞噬作用的影響

將在37℃，5％co2培養箱中培養2天的raw264.7細胞，用胰酶進行消化，將消化好的細胞棄去胰酶，加入含有10％犢牛血清的dmem培養液，輕輕吹打起細胞，進行細胞計數，將細胞稀釋到106個/ml，加入96孔板中，每孔加入100μl，在37℃，5％co2培養箱中培養24h，分別加入不同濃度(5μg/ml，10μg/mll，20μg/ml)的pbs，flagelin，vlps，aunc，auns，aunc-vlps以及auns-vlps。在37℃，5％co2培養箱中培養24h，每孔加入0.072％中性紅溶液200μl，培養30min後除去中性紅溶液，用pbs洗滌3次，加入細胞溶解液(0.01m冰醋酸與無水乙醇等體積的混合液)200μl，待細胞溶解後，用酶標儀測定570nm處的吸光度值，以od值反應巨噬細胞的吞噬能力。實驗結果顯示aunc、auns及aunc-vlps、auns-vlps都具有促進巨噬細胞吞噬的作用(如圖9)。

實施例4疫苗抗體效價的elisa檢測

將49隻4周齡的豚鼠分為7組，第一組用pbs免疫作為對照，第二組用vlps免疫，第三組用滅活的口蹄疫疫苗進行免疫，第四組用aunc-vlps(50μg)結合產物進行免疫，第五組用aunc-vlps(25μg)結合產物進行免疫，第六組用auns-vlps(50μg)結合產物進行免疫，第七組用auns-vlps(25μg)結合產物進行免疫。分別在免疫前和免疫後第一周開始每周對各組豚鼠進行採血，測定免疫後抗體產生情況。

用包被緩衝液稀釋o型口蹄疫病毒兔抗血清至工作濃度(1:1000)，並在96孔elisa板上每孔加50μl，振蕩，封板，4℃過夜。棄去液體，pbst清洗3次，在吸水紙上拍幹，每孔加入稀釋(1:8)的抗原(o型口蹄疫滅活毒)50μl，37℃反應1h。棄去液體，pbst清洗3次，在吸水紙上拍幹，每孔加入50μl陰陽性血清與稀釋(1:32)好的免疫後豚鼠血清，37℃溫育1h。棄去液體，pbst清洗3次，在吸水紙上拍幹，用pbst稀釋兔抗豚鼠酶結合物至工作濃度(1:1000)，每孔加50μl，封板，37℃溫育1h。棄去液體，pbst清洗3次，在吸水紙上拍幹，每孔加50μl底物溶液(務必加雙氧水，每10ml加100μl雙氧水)，37℃溫育15min。然後每孔再加50μl終止液終止反應，於490nm檢測光密度(od值)。結果顯示，和用pbs對照組的豚鼠相比，vlps組、滅活疫苗組和金納米顆粒-vlps結合產物免疫組的豚鼠血清抗體水平持續升高，並且金納米顆粒-vlps複合物免疫組的抗體水平比vlps單獨免疫組的水平要高。這說明金納米顆粒對vlps有保護作用，並且金納米顆粒能夠進一步增強vlps的免疫效果，使動物機體產生更高水平的特異抗體(圖10)。

實施例5疫苗的t-淋巴細胞增殖實驗

將49隻4周齡的豚鼠分為7組，第一組用pbs免疫作為對照，第二組用vlps免疫，第三組用滅活的口蹄疫疫苗進行免疫，第四組用aunc-vlps(50μg)結合產物進行免疫，第五組用aunc-vlps(25μg)結合產物進行免疫，第六組用auns-vlps(50μg)結合產物進行免疫，第七組用auns-vlps(25μg)結合產物進行免疫。

在第一次免疫後第4周各組隨機收取1隻豚鼠將其脫頸處死，放入酒精中浸泡5min消毒，無菌取脾，加入1ml無血清rpmi1640培養液，在200目銅網上研磨，用無血清rpmi1640培養液衝洗銅網，將研磨獲得的脾細胞懸液置入2ml離心管中，4℃，1000rpm離心10min，每管中加入1.5ml紅細胞裂解液，4℃，1000rpm離心10min，棄去上清液，用不含ca2+和mg2+的hanks液洗清洗兩次並用rpmi1640培養液混勻，細胞計數後，用含10％fbs的rpmi1640培養液稀釋成106個/ml細胞濃度。將稀釋好的淋巴細胞懸液加入96孔細胞板中(100μl/孔)，每個樣品設3個復孔，每孔加入終濃度為8μg/ml的cona特異性刺激物，同時以不加刺激物的淋巴細胞為對照，培養板在含5％co2的37℃恆溫培養箱培養72h後，每孔加入20μlmts試劑，於37℃培養4h，用酶標儀檢測波長為490nm的光密度值，計算刺激指數(stimulationindex,si)。si＝(cona刺激孔的平均od490nm－未刺激組的平均od490nm)/(未刺激組的平均od490nm－空白1640培養液組的平均od490nm)。結果顯示，金納米顆粒-vlps結合產物免疫組的豚鼠的淋巴細胞經cona刺激劑刺激後，t-淋巴細胞的增殖效果高於單獨vlps免疫組。這說明金納米顆粒可作為vlps疫苗載體，運載vlps進入細胞後，能夠刺激機體產生比單獨vlps更強的細胞免疫應答(圖11)。

序列表

中國農業科學院蘭州獸醫研究所

中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所

金納米顆粒作為佐劑在製備病毒樣顆粒疫苗中的應用

klpi170133

3

patentin3.5

1

639

dna

vp1

1

accaccagcacgggcgaatcggcagatccggttacggcaacggtcgaaaactacggcggc60

gaaacgcaggttcaacgtcgtcatcataccgatgttagctttattctggaccgtttcgtg120

aaagttacgccgaaggattctatcaacgtcctggacctgatgcagaccccgccgcatacc180

ctggtgggcgcactgctgcgcaccgccacgtattactttgcagatctggaagtcgctgtg240

aaacacgaaggcgacctgacctgggtcccgaatggtgcaccggaagcagcactggataac300

accacgaatccgacggcatatcataaagctccgctgacccgtctggcactgccgtacacg360

gccccgcaccgtgttctggcaaccgtctataacggcaattgcaaatacgctggcggtagt420

ctgccgaacgtgcgtggtgatctgcaggttctggcccaaaaggcagcttggccgctgccg480

accagcttcaattatggtgcgattaaagccacccgtgtgacggaactgctgtatcgtatg540

aagcgtgcagaaacctactgtccgcgtccgctgctggcagtccacccgtccgcagcacgc600

cataagcaaaaaatcgtcgccccggtcaaacaaagtctg639

2

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gaactgttccagctgaccctgtttccgcatcaattcattaacccgcgtaccaatatgacg720

gctcacatcaaagttccgtttgtcggcgtgaaccgctatgatcagtacaaagtccacaag780

ccgtggaccctggtcgtgatggttgtcgcaccgctgaccgttaatacggaaagcgctccg840

caaatcaaggtgtatgccaatatcgccccgacgaatgtccacgttgctggtgaatttccg900

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