一株產酸克雷伯氏菌及其在生產蒜糖醇中的應用的製作方法

2024-02-02 03:31:15

一株產酸克雷伯氏菌及其在生產蒜糖醇中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株產酸克雷伯氏菌新菌種（Klebsiella?oxytoca）G4A4?CGMCC?No.7662及其在蒜糖醇生產中的應用，即將篩選的產酸克雷伯氏菌G4A4菌株製備成靜息細胞，並用於蒜糖醇生產，從而彌補現有技術的不足。本發明的產酸克雷伯氏菌G4A4菌株具有核糖醇脫氫酶，該酶具有較寬的底物譜，在厭氧條件下可以將D-阿洛酮糖還原為蒜糖醇。本發明的產酸克雷伯氏菌G4A4菌株可應用於以D-阿洛酮糖為底物的蒜糖醇生產，可以利用簡單培養基進行快速生長，能進行大規模的擴大培養，開發產酸克雷伯氏菌G4A4菌株的蒜糖醇生產功能具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一株產酸克雷伯氏菌及其在生產蒜糖醇中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物領域中的一株產酸克雷伯氏菌及其在生產蒜糖醇中的應用。
【背景技術】 [0002]稀少糖(Rare Sugar)是自然界中存在但含量極少的一類單糖及其衍生物(2002年國際稀少糖學會ISRS定義)，其味道類似於蔗糖，但具有熱量低、穩定性高、甜味協調、無吸溼性、無致齲齒性、耐受性高等優點，對改善特殊人群的飲食起到重要作用。另外，大量研究結果還表明稀少糖在抗癌、清除自由基、神經保護等諸多方面發揮著重要的生理活性作用，還可和蛋白及多肽等活性物質發生美拉德反應從而優化其功能活性(ZengY，Zhang X，Guan Y，Sun Y.Characteristics and antioxidant activity of Maillardreaction products from psicose-lysine and fruetose-lysine model systems.J Food Sc1.2011，76(3):C398_403 ;Sun Yj Hayakawa Sj Ogawa M，Fukada KjIzumoriK.1nfluence of a rare sugar，d—Psicose，on the physicochemical and functionalproperties of an aerated food system containing egg albumen.J Agric FoodChem.2008，56(12):4789-4796.)。功能性稀少糖具有獨特的生物學活性，市場開發潛力較大。
[0003]蒜糖醇(allitol)是一種六碳稀少糖醇，具有一定的降血糖功能，而且降糖過程緩慢平穩，即使大量服用也不會發生低血糖危險，服用安全，可用於製備治療糖尿病藥物；另外，蒜糖醇具有對稱性，可以作為D-型和L-型六碳稀少糖相互轉化的連接中心。因此，蒜糖醇不僅可用於甜味劑、保健品、降糖藥物，還可以用來生產其它稀少己糖。
[0004]目前，蒜糖醇的生產方式主要是提取法和化學轉化法，生產效率低，成本高。日本的研究學者何森健(Izumori Ken)教授建立的Izumoring策略為稀少糖的生物轉化提供了 一條新的途徑(Izumori K.1zumoring:a strategy for bioproduction ofall hexoses.J Biotechnol.2006，124(4):717-722)。研究發現，某些微生物可以實現D-阿洛酮糖和蒜糖醇之間的相互轉化，如集聚腸桿菌Enterobacter agglomerans221e(Muniruzzaman S，Tokunaga H, Izumori K.Conversion of D-psicose to allitol byEnterobacter agglomerans strain221e.J Ferment BioengVolume.1995,79 (4):323-327)，該文獻報導了以D-阿洛酮糖為底物轉化生產蒜糖醇，但該菌底物特異性較差，如以D-果糖和D-阿洛酮糖混合物進行轉化可能生成其它副產物；又如產氣腸桿菌Enterobacter aerogenes IK7 (Gullapalli P，Takata G，Poonperm W，Rao D，MorimotoK，Akimitsu K，Tajima S，Izumori K.Bioproduction of D-psicose from allitolwith Enterobacter aerogenes IK7:a new frontier in rare ketose production.Biosci Biotechnol Biochem.2007，71 (12):3048_3054)，該文獻只報導了以蒜糖醇為底物轉化生產D-阿洛酮糖，國內尚未有相關報導。國外的主要專利文獻有:[l]IkumoriTakeshi,Tsuzaki keij1.Ribitol dehydrogenase and its production and use.Japan, JP19940218155，1994-08-20。該專利文獻公開了利用產氣腸桿菌 Enterobacteraerogenes IK7生產1_脫氧_L_阿洛酮糖和1_脫氧_L_果糖等脫氧稀少糖的方法，但是沒有涉及生產蒜糖醇的方法。[2] Izumori Ken, Morimoto Kenji, Takata Goro, TokudaMasaaki, Tsujisaka Yoshio, Takeshita Kei,Tsusaki Keiji, Okuma Kazuhir0.Microorganism with ability to produce deoxy polyol dehydrogenase and usethereof.Japan, JP20060313672, 2006-11-20。該專利文獻公開了利用集聚腸桿菌Enterobacter agglomerans221e的氧化和還原作用分別生產多種稀少糖和糖醇的方法,但該菌底物特異性較差，如以D-果糖和D-阿洛酮糖混合物進行轉化可能生成其它副產物。

【發明內容】

[0005]本發明的第一個目的是提供一株可用於生產蒜糖醇的產酸克雷伯氏菌。
[0006]本發明所提供的產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca),命名為G4A4,該菌株已於2013年05月30日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC N0.7662。
[0007]產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca) G4A4CGMCC N0.7662 的 16s rRNA 基因序列如序列表中序列I所示。
[0008]產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4CGMCC N0.7662的形態特徵:直杆狀，其菌體長約為0.6-2.5 μ m,菌體寬度為0.4-0.8ym ;革蘭氏染色結果為革蘭氏陰性菌，不產芽孢，生莢膜，不運動。
[0009]產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) G4A4CGMCC N0.7662的培養條件:在普通LB培養基上即可生長，為兼性厭氧生長，具有呼吸和發酵兩種代謝類型。當在細菌完全培養基上37°C培養24小時後，菌落呈光滑型，表面光澤，乳白色不透明，邊緣整齊，直徑l-2mm。最適生長溫度為37°C，最適pH值為7.0。
[0010]產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca) G4A4CGMCC N0.7662 的生化特性如表1所示，由表1可見，產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) G4A4CGMCC N0.7662不能以D-山梨糖作為唯一碳源進行生長，與已報導(Boye K, Hansen DS.Sequencingof 16S rDNA of Klebsiella:taxonomic relations within the genus and to otherEnterobacteriaceae.1nt J Med Microbiol.2003，292 (7-8): 495-503)產酸克雷伯氏菌有顯著差異，是一株新型的產酸克雷伯氏菌。
[0011]產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) G4A4CGMCC N0.7662的生化特性如下:
[0012]K.0xytoca (產酸
生化性狀指標 t4A4 克雷伯氏菌)
【權利要求】
1.產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)G4A4,其特徵在於:其16s rRNA基因序列如序列表中序列I所示。
2.根據權利要求1所述的產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca) G4A4,其特徵在於:其保藏編號為CGMCC N0.7662。
3.根據權利要求1所述的產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca) G4A4,其形態特徵:直杆狀，其菌體長約為0.6-2.5 μ m,菌體寬度為0.4-0.8ym ;革蘭氏染色結果為革蘭氏陰性菌，不產芽孢，生莢膜，不運動； 其培養條件:普通LB培養基上即可生長，為兼性厭氧生長，具有呼吸和發酵兩種代謝類型；當在細菌完全培養基上37°C培養24小時後，菌落呈光滑型，表面光澤，乳白色不透明，邊緣整齊，直徑l_2mm ;最適生長溫度為37°C，最適pH值為7.0 ; 其生化特性如下表所示:
4.一種發酵培養產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4的方法,是將權利要求1或2或3所述產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4接種於LB改良培養基(每IL培養基含:蛋白腖0.2-0.5g，酵母粉0.2-0.5g，氯化鈉 0.2-0.5g)中，在 37°C、pH7.0、150_250rpm(優選為200rpm)條件下進行發酵培養，至0D_值為3.0-4.0,菌株進入生長的穩定期時選取菌株。
5.一種馴化產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4的方法,是將權利要求1或2或3所述產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) G4A4接種於含有I % (g / IOOml)木糖醇的無機鹽培養基(配方為:按質量/體積百分濃度g / 100ml，含0.25% (NH4)2SO470.25% KH2PO470.5% K2HPO470.01 % MgSO4.7Η20，0.05% 酵母粉，餘量為水，ρΗ7.0)中，在 37°C、150-250rpm (優選為200rpm)條件下培養直到菌體細胞生長達到穩定期(OD6tltl=L 0-1.5)，然後在相同條件下亞培養3-4次，使得產酸克雷伯氏菌的核糖醇脫氫酶組成型表達性狀穩定，完成菌株的馴化。
6.一種產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) G4A4靜息細胞的製備方法，是將權利要求5中馴化好的產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)G4A4接種於LB改良培養基中並在37°C、150-250rpm (優選為200rpm)條件下培養20_30h (優選為24h)後，離心收集菌體細胞，用PH7.5-8.5 (優選為8.0)的Tris-HCl緩衝液或磷酸鹽緩衝液洗滌菌體2_3次，加入pH7.5-8.5 (優選為8.0)的Tris-HCl緩衝液或磷酸鹽緩衝液重懸細胞，再放置4_6小時，得到的細胞懸浮液即為產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) G4A4靜息細胞。
7.一種用產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) G4A4生產蒜糖醇的方法,是將權利要求6所述產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) G4A4靜息細胞接種至Tris-HCl緩衝液或磷酸鹽緩衝液中，使細胞濃度達到0D_=20-40 (優選為40)，然後使用底物D-阿洛酮糖純品或D-果糖異構化後純化得到的D-阿洛酮糖純品或D-果糖與D-阿洛酮糖的混合物，底物濃度為0.5-5% (g / 100ml，以D-阿洛酮糖含量計，優選為0.5%)，並補加終濃度為0.1-0.5% (g / 100ml，優選為0.2%)的NADH (還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸)，在30-45°C(優選為37°C)、pH7.0-9.0(優選為7.0)、厭氧條件下，產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca) G4A4靜息細胞將底物轉化為蒜糖醇。
8.權利要求7所述方法製備得到的蒜糖醇反應液。
9.權利要求7中所述蒜糖醇反應液在製備醫藥品(如糖尿病治療藥物)、保健品中的應用。
10.權利要求7中所述蒜糖醇反應液作為其它稀少糖生產原料的應用。
【文檔編號】C12N1/20GK103468606SQ201310354386
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月14日 優先權日:2013年8月14日
【發明者】孫媛霞, 朱玥明, 韓文佳, 楊建剛, 馬延和 申請人:中國科學院天津工業生物技術研究所