一株ι-卡拉膠降解菌及其發酵方法和應用的製作方法

2024-01-26 08:04:15

一株ι-卡拉膠降解菌及其發酵方法和應用的製作方法
【專利摘要】一株ι-卡拉膠降解菌及其發酵方法和應用，涉及一種嗜纖維素菌屬的細菌。ι-卡拉膠降解菌（Cellulophaga?sp.）KL-A的保藏編號為CGMCC?No：8694。ι-卡拉膠水解酶的生產方法：將活化的ι-卡拉膠降解菌（Cellulophaga?sp.）KL-A塗布於ι-卡拉膠固體培養基上，挑取單菌落接入種子培養基中培養，得種子液；按1%～5%的接種量將種子液接種到發酵液中，搖床培養，得發酵上清液；4℃條件下，將所得發酵上清液經硫酸銨分級鹽析和DEAE-纖維素層析，透析除鹽，真空冷凍乾燥，得到ι-卡拉膠水解酶。ι-卡拉膠寡糖可在製備抗菌藥物，抗病毒藥物、免疫調節劑、抗氧化劑等中應用。
【專利說明】一株1-卡拉膠降解菌及其發酵方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種嗜纖維素菌屬的細菌，特別是涉及一株t -卡拉膠降解菌及其發酵方法和應用。
【背景技術】
[0002]卡拉膠(Carrageenan)，又名鹿角膠、角叉膠等，是從紅藻中提取的一種高分子親水性多糖，以重複的α-(1 — 4)-D_半乳吡喃糖-β-(1 — 3)-D_半乳吡喃糖(或3，6內醚-D-半乳吡喃糖)二糖單元為基本骨架連接而成。根據是否含有3，6內醚-D-半乳吡喃糖、硫酸基的含量以及硫酸基在分子中的位置不同，將卡拉膠主要分為K-、λ-、t -3族。
[0003]卡拉膠因具有優良的熱可逆凝膠化、抗蛋白凝膠、親水無毒等性能而廣泛應用於食品工業中。目前卡拉膠已廣泛應用於果凍、軟糖、冰淇淋、肉製品、啤酒等食品工業中，主要作用表現在凝膠、增稠和蛋白反應性3個方面。隨著人們對卡拉膠結構和功能認識的深入，其應用領域不斷拓寬，尤其在醫藥領域的應用變得日益廣泛。
[0004]已有研究成果表明，卡拉膠具有多種生物活性，如抗凝血、抗病毒、免疫調節、抗氧化等，但由於卡拉膠相對分子質量過大，使其溶解性和吸收性受到影響，限制了其在醫藥領域的應用。卡拉膠寡糖與之相比，相對分子質量較小，溶解性、穩定性和安全性都有所增加，且生物活性也具有一定程度的提高。
[0005]目前降解卡拉膠的方法有物理法、化學法、酶解法。其中酶降解法是製備寡糖的一個重要途徑，由於其具有特異性，可選擇性地酶解切斷糖鏈上的特定位點，從而製得特定的寡糖；並且反應條件溫和，降解過程易於控制，在多糖降解中的運用日益增多。目前，國內外學者對卡拉膠寡糖進行的研究，已有成果表明卡拉膠寡糖在功能性食品、醫藥等領域具有一定的應用價值和開發前景。因此，利用從海洋微生物中提取到的卡拉膠降解酶製備卡拉膠低分子量活性片段，成為卡拉膠工業高值化研究的重要方向。尋找具有能降解卡拉膠的菌種是十分必要的。
[0006]中國專利CN1544623公開一種K 一卡拉膠降解酶及其製備方法和應用，一種酶能使K 一卡拉膠降解，用於製備卡拉膠低聚糖，能夠降解K 一卡拉膠的β — 1，4 一糖苷鍵，故亦稱為K 一卡拉膠降解酶，該酶的分子量為30，OOODa。製備該酶時，將海洋噬纖維菌用2216E培養基28 - 35°C搖瓶培養後，將培養液離心獲得發酵酶液，將酶液超濾濃縮後，以40 % — 80 %的(NH4) 2S04鹽析收集沉澱蛋白，冷凍乾燥。
[0007]中國專利CN102994408A公開一種卡拉膠降解菌及其發酵方法和應用，涉及一種新土地桿菌屬的細菌，其命名為卡拉膠降解菌13-Q,即Pedobacter hainanensis sp.13-Q,該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCN0.5564。

【發明內容】

[0008]本發明的第一目的在於提供一株能分泌卡拉膠降解酶的菌株。[0009]本發明的第二目的在於提供一種t -卡拉膠水解酶的生產方法。
[0010]本發明的第三目的在於提供^ -卡拉膠寡糖在製備抗菌藥物，抗病毒藥物、免疫調節劑、抗氧化劑等中應用。
[0011]所述能分泌卡拉膠降解酶的菌株為1-卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.)KL_A,分離自福建省東山島，菌株保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC No:86940菌落形態特徵為:在
1-卡拉膠固體培養基上生長良好，菌落黃色，圓形，表面略突起，光滑，反光，不透明，短杆狀，邊緣整齊，革蘭氏染色陰性，不生孢，可運動。
[0012]菌株的生理學特徵為:生長需要NaCl，無NaCl時幾乎不能生長，高濃度的NaCl抑制其生長，0.2%的^ -卡拉膠能促進卡拉膠降解酶的產生。最適生長溫度為28~32°C。
[0013]根據16S rRNA序列分析比對結果,所述的菌株鑑定為Cellulophaga sp.KL-A。
[0014]遺傳學特徵:所述！-卡拉膠降解菌的16S rRNA鹼基序列，序列共1075bp。
[0015]與Genebank國際基因序列資料庫記錄的最相似的菌株Cellulophaga Iytica的相似性為99%。
[0016]所述一種t -卡拉膠水解酶的生產方法，包括以下步驟:
[0017]I)將活化的1-卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.)KL_A塗布於ι_卡拉膠固體培養基上，挑取單菌落接入 種子培養基中培養，得種子液；
[0018]2)按1%~5%的接種量將種子液接種到發酵液中，搖床培養，得發酵上清液；
[0019]3)4°C條件下，將步驟2)所得發酵上清液經硫酸銨分級鹽析和DEAE-纖維素層析，透析除鹽，真空冷凍乾燥，得到1-卡拉膠水解酶。
[0020]在步驟I)中，所述t -卡拉膠固體培養基的組成為:質量濃度為0.5%~1%的碳源，0.3%~0.5%的氮源，2%的氯化鈉，0.5%的硫酸鎂，0.1%的氯化鈣，0.03%的硫酸亞鐵，0.1%的磷酸氫二鉀，0.2%的t -卡拉膠的水溶液；所述碳源可選自葡萄糖，甘油，半乳糖，蔗糖，乙酸鈉，澱粉等中的一種，優選葡萄糖；所述氮源可選自蛋白腖，酵母粉，牛肉膏，硫酸銨，硝酸鈉，尿素等中的一種，優選酵母粉；所述培養的條件可為30°C，200rpm培養30h。
[0021]在步驟2)中，所述搖床培養的條件可為30°C，200rpm搖床培養30h。
[0022]所述t -卡拉膠水解酶降解t -卡拉膠，降解產物為2個t -卡拉膠寡糖，聚合度分別為2~4糖和6~10糖。
[0023]所述t -卡拉膠寡糖可在製備抗菌藥物，抗病毒藥物、免疫調節劑、抗氧化劑等中應用。海水養殖中，對蝦的存活率能提高20%~30%。
[0024]本發明具有以下技術效果:
[0025]1、1-卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.)KL_A在ι _卡拉膠的誘導下合成ι -卡拉膠水解酶，單因子篩選得到最佳碳氮源分別是葡萄糖和酵母粉。通過響應面優化培養基和培養條件，獲得的ι -卡拉膠水解酶活力達到226.73U/mL。與國內外已報導的相比，所述的^ -卡拉膠降解菌水解酶生產能力大為提高，具有一定開發前景。
[0026]2、本發明提供的^ -卡拉膠降解菌能穩定的產生較高含量的水解酶，利用此水解酶能夠製備與其他細菌不同聚合度的卡拉膠寡糖。
[0027]3、本發明提供的t -卡拉膠水解酶的分子量為70kD，專一性水解t -卡拉膠，不能水解K -卡拉膠、λ -卡拉膠、瓊膠，纖維素，幾丁質和澱粉，水解的產物最終為2~8糖，得到的1-卡拉膠寡糖具有很高的商業應用價值。
[0028]4、本發明提供的t -卡拉膠水解酶具有一定的熱穩定性，42°C熱處理Ih能保持90%的酶活性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為ι -卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.) KL-A降解ι_卡拉膠產物的薄層層析圖。
[0030]圖2為ι -卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.) KL-A在ι_卡拉膠平板上的降解效果(降解圈)。
【具體實施方式】
[0031]實施例1
[0032]ι -卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.) KL-A的分離純化。
[0033]採集福建省東山島附近海域的新鮮活體海藻葉片後，加入無菌海水清洗，放入初篩培養基中，搖瓶培養2~3天。將培養液在含有初篩培養基的瓊脂平板上劃線，培養3天。將在瓊脂平板上形成透明圈的菌落轉移到新的瓊脂平板上培養，重複劃線，直至獲得純培養物。初篩培養基成分(質量體積比):ι -卡拉膠0.2%，NaCll.5%，NaNO30.2%，MgSO4.7Η200.05%, CaC120.01%，磷酸鐵 0.005%, pH 值 7.5。
[0034]將初篩分離到的純培養物接種到復篩培養基中，搖床培養。然後將培養液在復篩固體培養基上劃線，將產生最大降解圈的菌落挑取出來進行下一步實驗。所有篩選出來的菌株，分離純化後保存。
[0035]復篩培養基成分(質量體積比):ι -卡拉膠0.2%，酵母粉0.1%，NaCl 1.5%，NaNO30.2%, MgSO4.7Η200.05%, CaCl20.01%,磷酸鐵 0.005%, pH 值 7.5。
[0036]實施例2 [0037]單因子篩選碳氮源
[0038]1、分別選取幾種不同的碳源，濃度為10g/L，以5g/L的蛋白腖作為固定氮源，另加2g/L的！-卡拉膠和15g/L的NaCl，配製培養基，接種量為3%，培養溫度為30°C，搖床轉速為200rpm，培養48h，DNS法測酶活,碳源對ι -卡拉膠水解酶發酵的影響如表1所示,葡萄糖為最佳碳源。
[0039]表1
[0040]
mmI葡萄糖__[￥1 I半乳糖?β I乙酸納~[?
酶活力(u/mg) 287.6 201.3 234.7 168.2171.1 168.2
[0041]2、以15g/L葡萄糖為固定碳源,分別選取幾種不同的氮源,濃度為5g/L,另加2g/L的ι -卡拉膠和15g/L的NaCl，配製培養基，接種量為3%，培養溫度為30°C，搖床轉速為200rpm,培養48h，DNS法測酶活,氮源對ι -卡拉膠水解酶發酵的影響如表2所示,酵母粉為最佳氮源。
[0042]表2[0043]
【權利要求】
1.一株1-卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.)KL_A,菌株保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No:86940
2.—種t -卡拉膠水解酶的生產方法，其特徵在於包括以下步驟: 1)將活化的1-卡拉膠降解菌(Cellulophaga sp.)KL_A塗布於ι_卡拉膠固體培養基上，挑取單菌落接入種子培養基中培養，得種子液； 2)按1%~5%的接種量將種子液接種到發酵液中，搖床培養，得發酵上清液； 3)4°C條件下，將步驟2)所得發酵上清液經硫酸銨分級鹽析和DEAE-纖維素層析，透析除鹽，真空冷凍乾燥，得到1-卡拉膠水解酶。
3.如權利要求2所述一種^-卡拉膠水解酶的生產方法，其特徵在於在步驟I)中，所述1-卡拉膠固體培養基的組成為:質量濃度為0.5%~1%的碳源，0.3%~0.5%的氮源，2%的氯化鈉，0.5%的硫酸鎂，0.1%的氯化鈣，0.03%的硫酸亞鐵，0.1%的磷酸氫二鉀，0.2%的1-卡拉膠的水溶液。
4.如權利要求3所述一種^-卡拉膠水解酶的生產方法，其特徵在於所述碳源選自葡萄糖，甘油，半乳糖，蔗糖，乙酸鈉，澱粉中的一種，優選葡萄糖。
5.如權利要求3所述一種^-卡拉膠水解酶的生產方法，其特徵在於所述氮源選自蛋白腖，酵母粉，牛肉膏，硫酸銨，硝酸鈉，尿素中的一種，優選酵母粉。
6.如權利要求2 所述一種^-卡拉膠水解酶的生產方法，其特徵在於在步驟I)中，所述培養的條件為30°C，200rpm培養30h。
7.如權利要求2所述一種^-卡拉膠水解酶的生產方法，其特徵在於在步驟2)中，所述搖床培養的條件為30°C，200rpm搖床培養30h。
8.如權利要求2~7中任一所述一種t-卡拉膠水解酶的生產方法所生產的^ -卡拉膠水解酶在製備降解產物中的應用，所述降解產物為1-卡拉膠寡糖。
9.如權利要求8所述應用，其特徵在於所述^-卡拉膠寡糖包括聚合度為2~4糖的1-卡拉膠寡糖和聚合度為6~10糖的t -卡拉膠寡糖。
10.如權利要求8或9所述應用，其特徵在於所述^-卡拉膠寡糖在製備抗菌藥物，抗病毒藥物、免疫調節劑、抗氧化劑中應用。
【文檔編號】A61P37/02GK103789241SQ201410043525
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月29日 優先權日:2014年1月29日
【發明者】邵宗澤, 單大鵬, 李旭, 古錚, 應見喜 申請人:國家海洋局第三海洋研究所