一種檢測煙氣總粒相物對細胞炎症效應因子影響方法與流程
2024-02-15 17:29:15 1
本發明屬於菸草製品生物學效應評價技術領域，特別涉及一種檢測煙氣總粒相物對細胞炎症效應因子影響方法。
背景技術：
隨著人們對健康的關注越來越高，對菸草產品提出了更高的要求，不但要有較好的口感，而且要儘可能的減少人體的不良感受。捲菸產品研發人員在煙油產品配方設計初期將不同組份按照不同比例組合調配，形成具有不同風格的初選配方，再結合化學評價和感官評價對配方進行不斷篩選調整形成最終的產品配方。然而初選配方數量眾多，全部進行感官評價耗時耗力，且感官評價側重於對產品的風格口感進行篩選，如何利用生物學測試指標對產品初選配方進篩選，以獲得降低人體不良感受的產品配方，目前尚屬探索階段，無統一的標準方法。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種檢測煙氣總粒相物對細胞炎症效應因子影響方法，為電子菸製品的安全性評估提供參考。
一種檢測煙氣總粒相物對細胞炎症效應因子影響方法，包括以下步驟：
(1)受試物的前處理；
(2)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的製備；
(3)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度的計算；
(4)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞接種；
(5)受試物的分組；
(6)受試物檢測劑量的設定；
(7)受試物培養品的製備；
(8)受試物的孵育；
(9)受試物孵育品的收集；
(10)標準溶液配製；
(11)添加待測樣；
(12)添加抗體；
(13)添加結合液；
(14)顯色；
(15)測量吸光值；
(16)細胞因子分泌量測定。
本發明優選的實施方案中，上述的方法，包括以下具體步驟：
(1)受試物的前處理：參照中華人民共和國國家標準GB/T 19609-2004《捲菸用常規分析用吸菸機測定總粒相物和焦油》製備捲菸煙氣總粒相物樣品，樣品濃度為10mg/mL；
(2)人肺成纖維細胞HPF單細胞懸浮液的製備：人肺成纖維細胞復甦後，接種到細胞培養瓶中，置於37℃、5vt％CO2培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察培養細胞的匯合和形態情況，待細胞長至90％的匯合率時，移除培養瓶中的培養基，用磷酸緩衝液洗兩次，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩衝液的濃度單位為質量：體積；單層孵育約1-2min，用成纖維成纖維細胞培養基懸起，形成單細胞懸浮液；
(3)人肺成纖維細胞HPF單細胞懸浮液的細胞濃度的計算：用血球計數板計數法對步驟(2)得到人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度進行計算，計算出每毫升人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的活細胞數；
(4)人肺成纖維細胞HPF單細胞懸浮液的細胞接種：將步驟(3)計數後的人肺成纖維細胞單細胞懸浮液加入成纖維細胞培養基稀釋至2.0×105個/mL，再按接種量為1mL/孔，接種到12孔細胞培養板中，將12孔細胞培養板置於37℃、5vt％CO2培養箱內培養24h；
(5)受試物的分組：將受試物分為兩組：細胞對照組和檢測樣品組；各組的構成為：細胞對照組為成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞；檢測樣品組為在成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞並添加受試物；
(6)受試物檢測劑量的設定：將受試物，即電子菸原液分為5非個非零劑量：20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL；
(7)受試物培養品的製備：移除步驟(4)中12孔細胞培養板內的成纖維細胞培養基，再按步驟(5)進行分組，各組的構成為：細胞對照組為成纖維細胞培養基+人肺成纖維細胞；檢測樣品組為成纖維細胞培養基+人肺成纖維細胞+受試物，並使檢測樣品組的最終濃度分別為步驟(6)設定的劑量；並且2組培養品用成纖維細胞培養基將每孔中的液體體積補足到1mL/孔；
(8)受試物的孵育：將步驟(7)加樣後的12孔細胞培養板置於37℃、5vt％CO2培養箱中孵育24h；
(9)受試物孵育品的收集：吸取步驟(8)細胞板中的上清液，離心20min，轉速1000rpm，取上清；
(10)標準溶液配製：梯度稀釋法配製炎症效應因子的標準曲線溶液，
(11)添加待測樣：空白對照孔加蒸餾水100μL，其餘孔分別加步驟(10)配製的標準品溶液或步驟(9)獲得的待測樣品100μL，蓋酶標板覆膜，37℃孵育90分鐘；
(12)添加抗體：將步驟(11)中的固液進行分離，取分離的液體，甩幹，每孔加入抗體工作液100μL，蓋酶標板覆膜，37℃孵育60分鐘；
(13)添加結合液：將步驟(12)中的固液進行分離，取分離的液體，甩幹，用磷酸鹽緩衝液PBS洗板三次，每次浸泡大約2分鐘，350μL/每孔，甩幹並在吸水紙上輕拍將孔內液體拍幹，每孔加酶結合工作液100μL，蓋酶標板覆膜，37℃孵育30分鐘；
(14)顯色：將步驟(13)中的固液進行分離，取分離的液體，甩幹，用清洗液洗板五次，每次浸泡大約2分鐘，350μL/每孔，甩幹並在吸水紙上輕拍將孔內液體拍幹，每孔加底物工作液90μL，蓋酶標板覆膜，37℃孵育，觀察每孔顏色變化，適時加入終止液50μL/孔；
(15)測量吸光值：於酶標儀450nm下檢測吸光度；
(16)細胞因子分泌量測定：根據標準溶液吸光度值繪製標準曲線，計算細胞因子分泌量。
本發明優選的實施方案中，步驟(10)中的標準曲線溶液的配製過程為：將抗體用抗體工作液配製成相應濃度，其中IL-6標準曲線範圍為0-500pg/mL，IL-8標準曲線範圍為0-2000pg/mL,IL-10標準曲線範圍為0-500pg/mL，TGF-β1標準曲線範圍為0-2000pg/mL，TNF-α標準曲線範圍為0-500pg/mL，GM-CSF標準曲線範圍為0-500pg/mL，抗體購買於伊萊瑞特公司。
本發明優選的實施方案中，步驟(12)中的抗體工作液屬於商品化商品，能夠在市場上購買於伊萊瑞特公司。
本發明優選的實施方案中，步驟(13)中的酶結合工作液屬於商品化商品，能夠在市場上購買於伊萊瑞特公司。
本發明有益效果：
本發明對樣品的有效處理、檢測劑量的優化設定以及靶細胞的正確選擇，使得本方法能夠準確有效的檢測捲菸煙氣總粒相物對細胞炎症效應因子分泌影響。
附圖說明
圖1為4種捲菸煙氣總粒相物對HPF細胞IL-6細胞因子分泌的影響；
圖2為4種捲菸煙氣總粒相物對HPF細胞IL-10細胞因子分泌的影響。
具體實施方式
下面將結合具體實例對本發明做詳細描述，但並不限制本發明。
本發明針對4種國內市售捲菸的煙氣總粒相物對人肺成纖維細胞IL-6、IL-10兩種炎症效應因子分泌量的影響測試。
(1)受試物的前處理：參照中華人民共和國國家標準GB/T 19609-2004《捲菸用常規分析用吸菸機測定總粒相物和焦油》製備捲菸煙氣總粒相物樣品，樣品濃度為10mg/mL；
(2)人肺成纖維細胞HPF單細胞懸浮液的製備：人肺成纖維細胞復甦後，接種到細胞培養瓶中，置於37℃、5vt％CO2培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察培養細胞的匯合和形態情況，待細胞長至90％的匯合率時，移除培養瓶中的培養基，用磷酸緩衝液洗兩次，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩衝液的濃度單位為質量：體積；單層孵育約2min，用成纖維成纖維細胞培養基懸起，形成單細胞懸浮液；
(3)人肺成纖維細胞HPF單細胞懸浮液的細胞濃度的計算：用血球計數板計數法對步驟(2)得到人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度進行計算，計算出每毫升人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的活細胞數；
(4)人肺成纖維細胞HPF單細胞懸浮液的細胞接種：將步驟(3)計數後的人肺成纖維細胞單細胞懸浮液加入成纖維細胞培養基稀釋至2.0×105個/mL，再按接種量為1mL/孔，接種到12孔細胞培養板中，將12孔細胞培養板置於37℃、5vt％CO2培養箱內培養24h；
(5)受試物的分組：將受試物分為兩組：細胞對照組和檢測樣品組；各組的構成為：細胞對照組為成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞；檢測樣品組為在成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞並添加受試物；
(6)受試物檢測劑量的設定：將受試物，即電子菸原液分為5非個非零劑量：20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL；
(7)受試物培養品的製備：移除步驟(4)中12孔細胞培養板內的成纖維細胞培養基，再按步驟(5)進行分組，各組的構成為：細胞對照組為成纖維細胞培養基+人肺成纖維細胞；檢測樣品組為成纖維細胞培養基+人肺成纖維細胞+受試物，並使檢測樣品組的最終濃度分別為步驟(6)設定的劑量；並且2組培養品用成纖維細胞培養基將每孔中的液體體積補足到1mL/孔；
(8)受試物的孵育：將步驟(7)加樣後的12孔細胞培養板置於37℃、5vt％CO2培養箱中孵育24h；
(9)受試物孵育品的收集：吸取步驟(8)細胞板中的上清液，離心20min，轉速1000rpm，取上清；
(10)標準溶液配製：梯度稀釋法配製炎症效應因子的標準曲線溶液，
(11)添加待測樣：空白對照孔加蒸餾水100μL，其餘孔分別加步驟(10)配製的標準品溶液或步驟(9)獲得的待測樣品100μL，蓋酶標板覆膜，37℃孵育90分鐘；
(12)添加抗體：將步驟(11)中的固液進行分離，取分離的液體，甩幹，每孔加入抗體工作液100μL，蓋酶標板覆膜，37℃孵育60分鐘；
(13)添加結合液：將步驟(11)中的固液進行分離，取分離的液體，甩幹，用磷酸鹽緩衝液PBS洗板三次，每次浸泡大約2分鐘，350μL/每孔，甩幹並在吸水紙上輕拍將孔內液體拍幹，每孔加酶結合工作液100μL，蓋酶標板覆膜，37℃孵育30分鐘；
(14)顯色：將步驟(11)中的固液進行分離，取分離的液體，甩幹，用清洗液洗板五次，每次浸泡大約2分鐘，350μL/每孔，甩幹並在吸水紙上輕拍將孔內液體拍幹，每孔加底物工作液90μL，蓋酶標板覆膜，37℃孵育，觀察每孔顏色變化，適時加入終止液50μL/孔；
(15)測量吸光值：於酶標儀450nm下檢測吸光度；
(16)細胞因子分泌量測定：根據標準溶液吸光度值繪製標準曲線，計算細胞因子分泌量。
結果見圖1和圖2。由試驗結果可以看出，在本發明方法給出的樣品處理方法、檢測劑量條件下，樣品1#、2#、3#、4#在檢測劑量範圍內對HPF細胞IL-6炎症效應因子的分泌量存在影響，且有劑量效應關係，與0劑量組相比存在顯著差異(p0.05)；以上結果不同的捲菸煙氣總粒相物對HPF細胞不同的炎症效應因子的分泌量的影響存在差異。