大豆胞囊線蟲rna解旋酶cgh-1及其編碼基因與應用的製作方法
2024-01-20 19:12:15
專利名稱：大豆胞囊線蟲rna解旋酶cgh-1及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種大豆胞囊線蟲RNA解旋酶CGH-I及其編碼基因與應用。
背景技術：
大豆起源於中國，是人類蛋白和食用油的重要來源，全世界食用油的31%來自大豆。我國是大豆消費大國，年消費總量超過4000萬噸，而國內大豆年總產量卻只有不足 1700萬噸。因此，必須依靠大量進口來填補空缺。我國大豆生產的主要問題是單產低，2008 年平均單產只有114公斤/畝，僅為世界平均單產的70%，與美國等先進國家相比差距更大。造成我國大豆產量低的原因除了品種和種植等問題外，病蟲害是重要原因。大豆胞囊線蟲病是世界範圍內對大豆生產危害最為嚴重的病蟲害之一。在我國， 大豆胞囊線蟲病是僅次於大豆花葉病毒病的第二大病害，它主要分布於東北和黃淮兩個大豆主產區。其中尤以多年連作區和乾旱及沙鹼老豆區最為嚴重。大豆受胞囊線蟲病侵害後， 輕者減產20 % 30 %，嚴重者減產達70 % 80 %，更為甚者會發生大面積種植地的絕收。 大豆胞囊線蟲病由胞囊線蟲(Heterodera glycines, Soybean cyst nematode, SCN)弓丨起， 在大豆整個生長過程中均可發生。胞囊線蟲寄生於大豆根上，導致主根和側根發育不良，鬚根增多，整個根系呈鬚髮狀。鬚根上著生白色至黃白色的大小約0.5毫米的凸起，為線蟲的胞囊。受害植株病根的根瘤很少或不結瘤；地上部分生長遲緩，幼苗期子葉及真葉變黃大； 重病苗生長停止，乃至死亡。受害植株一般表現為矮小，葉片發黃，花芽簇生，節間縮短，開花期延遲，結莢少或不能結莢。有鑑於此，胞囊線蟲病的防治是大豆生產所長期面臨的艱巨任務。使用高毒性的殺蟲劑如DDT、呋喃丹、涕滅威等雖然可以殺死線蟲，但會造成嚴重的環境汙染，因而已被禁用或限制使用。利用傳統的育種程序培育大豆抗性品種遇到的問題是回交程序煩瑣，抗性鑑定複雜。通過回交育種方法選育一個品種，至少需要十年時間，大大地限制了抗大豆胞囊線蟲新品種的選育。RNA幹擾技術(RNAi)的出現使通過轉基因技術獲得具有廣譜抗胞囊線蟲的高產大豆品種及其它作物品種成為可能。RNAi現象最先發現於植物中並在非寄生性線蟲-秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)中得以揭示，隨後在植物、果蠅和脊椎動物中動物中被進一步證實。秀麗線蟲在攝入含dsRNA的大腸桿菌後，在其腸道中消化，其中的dsRNA可被吸收並在細胞間傳遞，到達大部分組織和細胞中，造成靶基因所編碼mRNA的特異性降解，從而影響目的基因的功能。
發明內容
本發明的目的是提供一種大豆胞囊線蟲RNA解旋酶CGH-I及其編碼基因與應用。本發明提供的蛋白質，獲自大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines, Soybean cyst nematode),是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；
(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與大豆胞囊線蟲發育相關的由序列1衍生的蛋白質。為了使(a)中的蛋白質便於純化，可在由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標籤。表1標籤的序列
權利要求
1.一種蛋白質，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與大豆胞囊線蟲發育相關的由序列1衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特徵在於所述基因是如下1)至4)中任一所述的DNA 分子1)序列表的序列2自5，末端第499至1839核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼大豆胞囊線蟲發育相關蛋白的 DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼大豆胞囊線蟲發育相關蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.含有雙鏈DNA片段A和雙鏈DNA片段B的重組質粒；所述雙鏈DNA片段B與所述雙鏈DNA片段A為反向互補序列；所述雙鏈DNA片段A如序列2的序列2自5』末端523至 1090位核苷酸所示。
6.如權利要求5所述的重組質粒，其特徵在於所述重組質粒是在載體pZHOl的不同多克隆位點分別插入所述雙鏈DNA片段A和所述DNA片段B得到的重組質粒。
7.如權利要求6所述的重組質粒，其特徵在於所述重組質粒為在骨架載體pZHOl的 Xba I和Sal I酶切位點之間插入所述雙鏈DNA片段A、Kpn I和Sac I酶切位點之間插入所述雙鏈DNA片段B得到的重組質粒。
8.一種培育轉基因植物的方法，是將權利要求5至7中任一所述重組質粒導入目的植物中，得到大豆胞囊線蟲抗性高於所述目的植物的轉基因植物。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物； 所述雙子葉植物優選為大豆。
10.權利要求1所述蛋白，或權利要求2或3所述基因，或權利要求4所述重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌，或權利要求5至7中任一所述重組質粒在培育抗大豆胞囊線蟲植物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種大豆胞囊線蟲RNA解旋酶CGH-1及其編碼基因與應用。本發明提供的蛋白質，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與大豆胞囊線蟲發育相關的由序列1衍生的蛋白質。本發明提供了大豆胞囊線蟲RNA解旋酶CGH-1及其編碼基因，並基於該編碼基因設計了RNAi表達載體，將該RNAi表達載體導入植物，可在植物中所述基因的dsRNA，當病蟲在攝入轉基因植物後，生殖或發育產生嚴重障礙，從而抑制病蟲的侵染和傳播。通過本發明的方法可以獲得具有很強抗蟲活性的轉基因植物，為進一步培育廣譜抗蟲性的大豆新品種奠定基礎。
文檔編號C12N15/52GK102382804SQ20111031755
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月18日 優先權日2011年10月18日
發明者張勁松, 李海潮, 李金英, 李錦錦, 楊崇林, 王昉, 荊玉棟, 蹇友理, 陳受宜 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所