一種中國漢族人結核病基因檢測試劑盒及檢測方法
2024-01-20 12:15:15
專利名稱：一種中國漢族人結核病基因檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物科學領域，更具體地說，涉及一種中國漢族人結核病基因檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
結核病是由結核桿菌侵入人體引起的一種具有較強的傳染性慢消耗性疾病。每個器官和系統都可患病，其中以肺結核最為常見。結核病是全球各類傳染病的首位殺手，全球有1/3的人(約20億)感染了結核病。現有結核病人約2000萬。每年新增病人約900萬，每年死亡人數達到300萬。近年來，由於多發耐藥結核、結核菌與愛滋病病毒的雙重感染和流動人口增多，結核病疫情出現回升，嚴重危害著廣大人們群眾的身體健康，已成為重大的公共衛生問題和社會問題。我國是世界上22個結核病高負擔國家之一，據統計我國結核病的發病率為121/10萬，結核病患者數量居世界第二位，嚴重製約我國經濟和社會的發展。肺結核病的臨床表現是低熱、盜汗、疲勞、食欲不振、體重減輕。肺結核局部症狀有咳嗽、胸悶、氣短、咯血等。病情輕者，諸症未必全部出現，重者則各種症狀大多俱現，或先後相繼發生，或合併出現。發病多慢，常逐漸加重，但亦有偶有急驟發病，很快惡化者。有些病人在潛伏期、甚至進展期無任何症狀，偶爾體檢時才發現。越來越多的證據表明，除病菌和環境等因素以外，遺傳學基因因素在結核病，包括復發和耐藥性結核病的發生與發展過程中扮演著重要的角色。通過以家族研究為基礎的相關分析，表明個體對結核病易感性或抗性的差異與宿主的基因相關。在動物實驗研究的基礎上，已篩選出了多種人的結核病相關候選基因，並在不同人種間得到了研究的驗證。結核病是一種頑固的慢性疾病，一旦感染髮病，若不及時規範地徹底治療，可以慢性帶菌、復發、惡化、耐藥，難以治癒，形成慢性傳染源。因此，結核病如能及時發現，採用適當的治療手段，往往能取得滿意療效。人們希望有一種簡單而客觀的方法可以進行肺結核病基因檢測，做到早發現、早診斷，提早採取預防措施，儘量避免病患的發生。
發明內容
針對上述現有技術中存在的技術問題，本發明提供一種中國漢族人結核病基因檢測試劑盒及檢測方法，可以在可能發病之前快捷地進行成人肺結核病易感基因的檢測，通過對成人肺結核病基因檢測，做到早發現，早診斷，提前採取預防措施，儘量避免病患的發生。為達到上述目的，本發明所採用的技術方案如下一種中國漢族人結核病基因檢測試劑盒，包括探針、DNA抽提試劑，預混PCR反應液，標準陽性對照品，標準陰性對照品、SAP反應液、iPlex反應液。所述探針由通常的核苷酸引物合成儀合成，序列如下擴增MYBBP1A基因的引物序列如下上遊引物ACGITGGATGITCGTGITTCGGTGAGTGTG
下遊引物ACGTTGGATGACTCTGCGTCGCTTCTCCA延伸弓I 物CGTCGCTTCTCCAGGCGACATCGGCT擴增RELA基因的引物序列如下上遊弓I 物ACGITGGATGAGCTGAATCAGGGCCTGITG下遊引物ACGTTGGATGTCAGTTTCCTCTCTGGAGGG延伸弓丨物GGCCTGTTGTACTTTCTTAAGGAAAA。所述DNA抽提試劑包括緩衝液A :0. 5mmol/L的SDS，緩衝液B 50mmol/L的NaOH,緩衝液D lmmol/L的碳酸鈉-丙酮，緩衝液W :無水乙醇，洗脫液10mmol/L的Tris鹽。所述預混PCR反應液含有中國漢族人結核病相關的MYBBP1A和RELA基因突變位 點的擴增引物，引物為包含突變位點的上遊引物和正常的下遊引物，序列分別如下擴增MYBBP1A基因的引物序列如下上遊引物ACGITGGATGITCGTGITTCGGTGAGTGTG下遊引物ACGTTGGATGACTCTGCGTCGCTTCTCCA延伸引物CGTCGCTTCTCCAGGCGACATCGGCT擴增RELA基因的引物序列如下上遊弓I 物ACGITGGATGAGCTGAATCAGGGCCTGITG下遊引物ACGITGGATGTCAGITTCCTCTCTGGAGGG延伸引物GGCCTGITGTACTITCTTAAGGAAAA。所述標準陽性對照品是含有MYBBP1A和RELA的兩個基因中含有突變核苷酸片段構成的Pgem-T重組質粒，包含有四種，序列分別如下Seql gCacacGtgtTTCGTGTTTCGGTGAGTGTGgcggagatggagagccgggatcccgccgagccgatgtcgccTGGAGAAGCGACGCAGAGTggcgCccgGcSeq2 gCacacGtgtTTCGTGTTTCGGTGAGTGTGgcggagatggagagccgggatcccgcccagccgatgtcgccTGGAGAAGCGACGCAGAGTggcgCccgGcSeq3 tCcagaGggaAGCTGAATCAGGGCCTGTTGtactttcttaaggaaaactgagggagggcacgccccacctCCCTCCAGAGAGGAAACTGAatcagAtgcgSeq4 tCcagaGggaAGCTGAATCAGGGCCTGTTGtactttcttaaggaaaattgagggagggcacgccccacctCCCTCCAGAGAGGAAACTGAatcagAtgcg。所述標準陰性對照品包含的序列為含有擬南芥基因片斷100個核苷酸構成的Pgem-T重組質粒,序列如下Seq5 ATTGTTCTTGCTTCTCTGGAACTTGGGATATGATGACAAAAATACGATATCTCTAAGGCTAATTGCTGTGCGGATGAAATATATTTGCACGTCAGTCTG。所述Pgem-T重組質粒是通過轉化大腸桿菌DH5a增殖後用鹼裂解法提取,經DNA純化試劑盒純化，用分光光度計測A260定量並稀釋到109cOpy/ul，-20°C保存。貯存液為109copy/ul,使用濃度為 105copy/ul。一種結核病基因檢測試劑盒對結核病基因的檢測方法，包括步驟如下(I)用DNA抽提試劑提取待測樣本；(2)將上述待測樣本和標準陰性、陽性對照品分別加入裝有預混PCR反應液的反應管中，混勻，低速離心數秒，立即進行PCR擴增反應；(3)上述PCR反應程序結束後，在上述PCR反應管中加入SAP反應液，放入PCR儀中進行反應；(4)上述反應結束後，在PCR反應管中加入iPlex反應液，再次放入PCR儀中進行反應;(5)將反應產物點在基因晶片上後，放入質譜儀進行檢測； (6)對檢測結果進行分析和判斷。上述步驟(2)中的反應條件如下
權利要求
1.ー種中國漢族人結核病基因檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括探針、DNA抽提試劑，預混PCR反應液，標準陽性對照品，標準陰性對照品、SAP反應液、以及iPlex反應液。
2.根據權利要求I所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述探針由通常的核苷酸引物合成儀合成，序列如下 擴增MYBBP1A基因的引物序列如下 上遊引物ACGTTGGATGTTCGTGTTTCGGTGAGTGTG 下遊引物ACGTTGGATGACTCTGCGTCGCTTCTCCA 延伸弓 I 物CGTCGCTTCTCCAGGCGACATCGGCT 擴增RELA基因的引物序列如下上遊弓 I 物ACGTTGGATGAGCTGAATCAGGGCCTGTTG 下遊引物ACGTTGGATGTCAGITTCCTCTCTGGAGGG延伸弓 I 物GGCCTGTTGTACTTTCTTAAGGAAAA。
3.根據權利要求I所述的檢測試劑盒，其特徵在幹，所述DNA抽提試劑包括緩衝液AO.5mmol/L的SDS,緩衝液B 50mmol/L的NaOH,緩衝液D lmmol/L的碳酸鈉-丙酮，緩衝液W :無水こ醇,洗脫液10mmol/L的Tris鹽。
4.根據權利要求I所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述預混PCR反應液含有中國漢族人結核病相關的MYBBP1A和RELA基因突變位點的擴增引物，引物為包含突變位點的上遊引物和正常的下遊引物，序列分別如下 擴增MYBBP1A基因的引物序列如下 上遊引物ACGTTGGATGTTCGTGTTTCGGTGAGTGTG 下遊引物ACGTTGGATGACTCTGCGTCGCTTCTCCA 延伸弓 I 物CGTCGCTTCTCCAGGCGACATCGGCT 擴增RELA基因的引物序列如下上遊弓 I 物ACGTTGGATGAGCTGAATCAGGGCCTGTTG下遊引物ACGTTGGATGTCAGITTCCTCTCTGGAGGG延伸弓 I 物GGCCTGTTGTACTTTCTTAAGGAAAA。
5.根據權利要求I所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述標準陽性對照品是含有MYBBPIA和RELA的兩個基因中含有突變核苷酸片段構成的Pgem-T重組質粒，包含有四種，序列分別如下 Seql gCacacGtgtTTCGTGTTTCGGTGAGTGTGgcggagatggagagccgggatcccgccgagccgatgtcgccTGGAGAAGCGACGCAGAGTggcgCccgGcSeq2 gCacacGtgtTTCGTGTTTCGGTGAGTGTGgcggagatggagagccgggatcccgcccagccgatgtcgccTGGAGAAGCGACGCAGAGTggcgCccgGcSeq3 tCcagaGggaAGCTGAATCAGGGCCTGTTGtactttcttaaggaaaactgagggagggcacgccccacctCCCTCCAGAGAGGAAACTGAatcagAtgcgSeq4 tCcagaGggaAGCTGAATCAGGGCCTGTTGtactttcttaaggaaaattgagggagggcacgccccacctCCCTCCAGAGAGGAAACTGAatcagAtgcg。
6.根據權利要求I所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述標準陰性對照品包含的序列為含有擬南芥基因片斷100個核苷酸構成的Pgem-T重組質粒，序列如下 Seq5 ATTGTTCTTGCTTCTCTGGAACTTGGGATATGATGACAAAAATACGATATCTCTAAGGCTAATTGCTGTGCGGATGAAATATATTTGCACGTCAGTCTG。
7.根據權利要求5或6所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述Pgem-T重組質粒是通過轉化大腸桿菌DH5a増殖後用鹼裂解法提取，經DNA純化試劑盒純化，用分光光度計測A260定量並稀釋到109cOpy/ul，-20°C保存。貯存液為109cOpy/ul，使用濃度為105cOpy/ul。
8.根據權利要求I 6所述的試劑盒對結核病基因的檢測方法，其特徵在於，包括步驟如下 (1)用DNA抽提試劑提取待測樣本； (2)將上述待測樣本和標準陰性、陽性對照品分別加入裝有預混PCR反應液的反應管中，混勻，低速離心數秒，立即進行PCR擴增反應； (3)上述PCR反應程序結束後，在上述PCR反應管中加入SAP反應液，放入PCR儀中進行反應； (4)上述反應結束後，在PCR反應管中加入iPlex反應液，再次放入PCR儀中進行反應 (5)將反應產物點在基因晶片上後，放入質譜儀進行檢測； (6)對檢測結果進行分析和判斷。
9.根據權利要求8所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟(2)中反應條件如下
10.根據權利要求8所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟(3)中反應條件如下37°C，40min ；85°C，5min ；4°C，forever。
11.根據權利要求8所述的檢測方法，其特徵在於，所述步驟(4)中反應條件如下
全文摘要
本發明公開一種中國漢族人結核病基因檢測試劑盒及檢測方法，所述試劑盒包括探針、DNA抽提試劑，預混PCR反應液，標準陽性對照品，標準陰性對照品、SAP反應液、iPlex反應液。本發明使用時，是以被測中國人的DNA樣本為檢測對象，經過樣本DNA抽提後，使用試劑盒在PCR儀上進行基因擴增，再用延伸引物進行PCR擴增產物的再延伸，純化後的延伸反應產物點在基因晶片上，採用MALDI-TOF質譜儀進行檢測，結合反應結果進行診斷。
文檔編號C12Q1/68GK102732623SQ20121020399
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月19日 優先權日2012年6月19日
發明者蔡雷 申請人:上海交通大學