一種對蝦msap技術分析體系的建立方法

2024-01-23 14:49:15 5

專利名稱：一種對蝦msap技術分析體系的建立方法
技術領域：
本發明屬於分子標記的建立方法，具體地說，涉及到中國對蝦基因組DNA甲基化分析方法，一種對蝦MSAP技術分析體系的建立方法。
背景技術：
DNA甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一，是基因組DNA在轉錄水平上進行調控的一種修飾方式，它參與了基因表達、生長發育和逆境脅迫應答等過程，在基因表達的調控中具有重要作用。對基因組甲基化進行研究最常用的技術是甲基敏感擴增多態性技術(Methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP),該方法是利用識別5 『-CCGG序列的同裂酶取a II和I對基因組DNA甲基化敏感性不同，相同序列可以擴增出不同的譜帶，來檢測甲基化水平以及有效區分出基因組DNA的甲基化狀態。中國對蝦養殖業是我國海水養殖的支柱產業,但自1993年對蝦病毒性疾病暴發以來，對蝦的病害問題直接影響對蝦養殖業的可持續發展，其中主要原因之一是養殖環境的惡化降低了中國對蝦的適應性，養殖產量下降。近年來對中國對蝦分子生物學方面的研究大多集中在群體遺傳結構、遺傳多樣性及免疫相關功能基因的克隆等方面，與其適應性密切相關的DNA甲基化表觀遺傳變異尚未見報導。

發明內容
針對相關技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種適用於中國對蝦基因組DNA甲基化分析的MSAP技術體系，為研究中國對蝦基因組DNA甲基化表觀遺傳適應機制提供依據，以解決無法通過DNA甲基化來研究中國對蝦的適應性的問題。為實現上述目的，本發明提供一種對蝦MSAP技術分析體系的建立方法，包括如下步驟(I)首先提取對蝦基因組DNA，並稀釋備用；(2)建立雙酶切反應體系和連接反應體系；(3)建立預擴增反應體系和預擴反應程序；(4)建立選擴反應體系和反應程序；(5)聚丙烯醯胺凝膠電泳及銀染。其中，步驟(I)中提取的是中國對蝦基因組DNA，稀釋成200ng/^L，並在_20°C保存待用。其中，步驟(2)中，雙酶切反應體系的總體積為20μ ，包括DNA模板200ng，Hpa IIiMsp I 7. 5U, EcoR I 7. 5 U, IOXbuffer 2μ ，加 ddH20 至 20μ ，37°C 8h ;連接反應體系為25 PL，包括酶切產物5 PL，50pmol的HM接頭和5pmol EcoR I接頭，2. 5U T4 DNA連接酶，16。。12h。其中，所述步驟(3)中，預擴反應體系為20μ ，包括預擴引物各20pmol，Taq DNA酶IU，dNTPs 4 pmol, IOX Taq buffer (含 Mg2+33pmol) 2. 2 μ ，稀釋 10 倍的連接產物 Iμ ,加 ddH20 至 20μ ;預擴反應程序94°C 30s,94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 2min，10 個循環，60°C 30mim，4°C保存備用。其中，所述步驟(4)中，選擴反應體系為20 μ ，包括選擴引物各30pmol，Taq DNA酶 1U，dNTPs 4 pmol, IOX Taq buffer (含 Mg2+30pmol) 2. OML，稀釋 10 倍的預擴產物5 ML，加ddH20至20ML ;選擴反應程序為94°C 30s，94°C 30s，65°C (每循環降低0. 7°C )30s, 72°C 102min, 10 個循環，72°C 10min,94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 2min,60°C 30min,
20個循環，4°C保存待用。其中，所述步驟(5)中，選擴產物與甲醯胺變性上樣液以2:1的比例混合，94°C變性5min，冰浴lOmin，採用65W恆功率進行6%聚丙烯醯胺凝膠電泳2h，銀染。甲醯胺變性液的配方在《分子克隆試驗指南》中有其詳細配置方法。其中銀染的方法(1)固定2L 1%的冰醋酸Ih ; (2)漂洗1. 5L ddH20漂洗兩次，每次2min;(3)染色I. 5L銀染液，0. 5_lh，銀染液組成I. 5gAgN03+2. 25L37 %甲醒 +315mL10mg/mLNa2S2O3 +1. 5LddH20 ； (4)顯影1. 5L 顯影液，3_5min,顯影液組成7. 5gNa0H+2. 25L 37% 甲醛 +1. 5L ddH20 ；(5)固定1L ddH20 5min。
本發明的MSAP技術分析體系的建立方法，首先提取中國對蝦基因組DNA，並稀釋備用；然後對酶量、酶切時間、預擴增模板濃度、選擇性擴增模板濃度進行優化篩選，確定預擴和選擴的反應體系進行PCR擴增；擴增產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳後銀染獲得所需條帶。本發明以中國對蝦為材料，通過對酶切時間、預擴和選擴的稀釋倍數等參數的優化，建立並優化MSAP分析體系，為研究中國對蝦基因組DNA甲基化表觀遺傳適應機制提供依據。與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是
I、MSAP技術具有多態性高、引物設計簡單、成本低廉、甲基化位點明確、無需預先知道所分析DNA序列的優點，即可對全基因組範圍內的甲基化程度進行解析。2、本發明主要用於中國對蝦種質資源鑑定、基因表達調控以及遺傳標記。


圖I是對蝦MSAP技術擴增結果；
其中H1-H3是採用功雙酶切的結果，M1-M3是採用#sp 1/EcoR I雙酶切的結果；A、B為不同的甲基化位點。
具體實施例方式下面通過實施例詳細敘述本發明的技術方法首先提取中國對蝦基因組DNA，並稀釋備用；然後對酶量、酶切時間、預擴增模板濃度、選擇性擴增模板濃度進行優化篩選，確定預擴和選擴的反應體系進行PCR擴增；擴增產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳後銀染獲得所需的條帶。(I)中國對蝦基因組DNA的提取。肌肉DNA的提取採用傳統的飽和酚氯仿法，選擇純度0D260/0D280在I. 8 I. 9之間的DNA樣品定量，並稀釋成濃度為200ng/ML，_20°C保存待用。(2)基因組DNA酶切。為確定最佳的雙酶切量和酶切時間，功Il/EcoRl和1/EcoR I的雙酶切量分別設定為5、7. 5和10 U，雙酶切時間分別設定為6、8和10h。最後確定酶切反應體系為 20μ ，功II 或#577 I HEcoR I 7. 5 U, IOXbuffer 2μ ，加 ddH20至20μ ，37°C 8h ;連接反應體系為25 μ ,包括酶切產物5 μ , 50pmol的HM接頭和5pmolEcoR I 接頭，2. 5U T4 DNA 酶，16°C連接 12h。(3)預擴反應體系和程序。將連接產物分別稀釋10、20和30倍各取WL，緩衝Buffer分別設定為I. 6、I. 8、2. 0,2. 2和2. 4 μ 進行反應體系的優化，最後確定預擴反應體系為 20μ ，包括預擴引物各 20pmol，Taq DNA 酶 IU，dNTPs 4 pmol, IOX Taq buffer(含Mg2+33pmol) 2.2 μ ，稀釋10倍的連接產物I μ ，加ddH20至20μ ;預擴反應程序940C 30s,94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 2min，10 個循環，6(TC 30mim。(4)選擴反應體系和程序。將預擴產物分別稀釋10、20和30倍取5μ ，反應程序循環數設定在10，20到14，24之間進行優化。確定選擴反應體系為20 μ ，包括選擴引物各30pmol, Taq DNA 酶 IU，dNTPs 4 pmol, IOX Taq buffer (含 Mg2+30pmol) 2. 0M-L,稀釋10倍的預擴產物5 μ ，加ddH20至20μ ;選擴反應程序為94°C 30s，94°C 30s, 65°C (每循環降低 0.7°C) 30s, 72°C 102min, 10 個循環，72°C 10min，94°C 30s, 56°C 30s, 72°C2min，60°C 30min，20 個循環。(5)聚丙烯醯胺凝膠電泳及銀染。選擴反應結束後將在6%聚丙烯醯胺凝膠中電泳2h，功率為65W。將膠板進行銀染:(I)固定2L 1%的冰醋酸Ih ; (2)漂洗1. 5L ddH20漂洗兩次，每次 2min ；(3)染色1. 5L 銀染液(I. 5gAgN03+2. 25L37% 甲醛+315mL10mg/mLNa2S203+1. 5LddH20) O. 5-lh ; (4)顯影1. 5L 顯影液(7. 5gNa0H+2. 25L 37% 甲醛+1.5L ddH20)3_5min ; (5)固定IL ddH20 5 min。通過附圖I中的對蝦MSAP技術擴增結果，可以看出利用本發明進行中國對蝦DNA甲基化分析可以獲得的擴增條帶數多、多態性豐富，染色結果清晰、解析度高、可重複性強，在不需要預知被測DNA序列信息的情況下，便可在全基因組範圍檢測DNA甲基化情況，在中 國對蝦遺傳育種和基因組研究中具有廣泛的應用前景。以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬於本發明技術方案的保護範圍。
權利要求
1.一種對蝦MSAP技術分析體系的建立方法，其特徵在於包括如下步驟(1)首先提取對蝦基因組DNA，並稀釋備用；(2)建立雙酶切反應體系和連接反應體系；(3)建立預擴增反應體系和預擴反應程序；(4)建立選擴反應體系和反應程序；(5)聚丙烯醯胺凝膠電泳，銀染後獲得所需條帶。
2.根據權利要求I所述的對蝦MSAP技術分析體系的建立方法，其特徵在於所述步驟(1)中提取的是中國對蝦基因組DNA，稀釋成200ng/ML，並在_20°C保存待用。
3.根據權利要求I所述的對蝦MSAP技術分析體系的建立方法，其特徵在於所述步驟(2)中，雙酶切反應體系的總體積為20ML，包括DNA模板200ng，取all或#印17. 5U，EcoRl7.5 U, IOXbuffer 2ML，加ddH20至20ML，37°C 8h ;連接反應體系為25 ML，包括酶切產物5ML，50pmol 的 HM 接頭和 5pmol EcoRl 接頭，2. 5U T4 DNA 連接酶，16°C，12h。
4.根據權利要求I所述的對蝦MSAP技術分析體系的建立方法，其特徵在於所述步驟(3)中，預擴增反應體系為20ML，包括預擴引物各20pmol，TaqDNA酶1U，dNTPs 4 pmol，IOX Taq buffer 2. 2 ML，稀釋10倍的連接產物1ML，加ddH20至20ML ;預擴反應程序為940C 30s,94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 2min，10 個循環，6(TC 30min。
5.根據權利要求I所述的對蝦MSAP技術分析體系的建立方法，其特徵在於所述步驟(4)中，選擴反應體系為20ML，包括選擴引物各30pmol，Taq DNA酶1U，dNTPs 4 pmol,IOX Taq buffer (含 Mg2+30pmol) 2. 0ML，稀釋 10 倍的預擴產物 5 ML，加 ddH20 至 20ML ；選擴反應程序為94°C 30s，94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 102min, 10 個循環，72°C IOmin,94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 2min,60°C 30min，20 個循環。
6.根據權利要求I所述的對蝦MSAP技術分析體系的建立方法，其特徵在於所述步驟(5)中，選擴產物與甲醯胺變性上樣液以2:1的比例混合，94°C5min，冰浴lOmin，採用65W恆功率進行6%聚丙烯醯胺凝膠電泳2h，銀染。
7.根據權利要求6所述的對蝦MSAP技術分析體系的建立方法，其特徵在於所述銀染的方法(I)固定2L 1%的冰醋酸Ih ; (2)漂洗1. 5L ddH20漂洗兩次，每次2min ；(3)染色1. 5L 銀染液，0. 5-lh，銀染液組成1. 5gAgN03+2. 25L37% 甲醛 +315mLIOmgAiLNa2S2O3+1. 5LddH20 ;⑷顯影1. 5L 顯影液，3-5min，顯影液組成:7. 5gNa0H+2. 25L 37% 甲醛+1. 5LddH20 ； (5)固定1L ddH20 5min。
全文摘要
本發明提供了一種對蝦MSAP技術分析體系的建立方法，(1)首先提取對蝦基因組DNA，並稀釋備用；(2)建立雙酶切反應體系和連接反應體系；(3)建立預擴增反應體系和預擴反應程序；(4)建立選擴反應體系和反應程序；(5)聚丙烯醯胺凝膠電泳，銀染後獲得所需條帶，上述方法為研究中國對蝦基因組DNA甲基化表觀遺傳適應機制提供依據，可以解決無法通過DNA甲基化來研究中國對蝦的適應性的問題。本發明適用於中國對蝦種質資源鑑定、基因表達調控及遺傳標記，具有多態性高、成本低廉、甲基化位點明確的優點，在無需預先知道DNA序列條件下，便可對全基因組範圍內的甲基化程度進行解析。
文檔編號C12Q1/68GK102747160SQ20121024894
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月18日 優先權日2012年7月18日
發明者何玉英, 李健, 杜盈, 王清印 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所