具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株及其應用的製作方法
2024-01-28 20:53:15 2
具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株（ Taxus wallichiana var.mairei ） ，命名為：南方紅豆杉植物細胞系NO51-3，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCCNo.10002。本發明更進一步公開了紫杉醇（Paclitaxel，CASNO:33069-62-4，常用商品名Taxol作通用名）高產細胞系的篩選和建立，本發明從紅豆杉外植體中誘導篩選出一株高產紫杉醇的細胞系，實驗結果證明：該細胞系高產次生代謝產物紫杉醇等紫杉烷類化合物，可作為原料藥用於治療卵巢癌和乳腺癌等。
CGMCC No10002
20141119
【專利說明】具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於植物細胞培養【技術領域】，具體涉及一種具有高產紫杉醇特性的紅豆杉 細Far. 用。
【背景技術】
[0002] 紫杉醇是從紅豆杉屬植物中分離得到的一種抗癌藥物，已被證明對治療卵巢癌、 乳腺癌及肺癌等有效。目前紫杉醇的提取都是以紅豆杉屬植物的樹皮為原料，不僅破壞環 境，危及紅豆杉資源，且因紅豆杉屬植物生長緩慢，紫杉醇含量較低，所以藥源奇缺，價格昂 貴。另外，全化學合成雖然已經成功，但是因為成本價格較高無法實現實際工業生產。因 此，必須尋找可替代化學合成的途徑，利用紅豆杉植物組織、細胞培養法生產紫杉醇是解決 途徑之一。
[0003] 進行工業化生產，目前提取物紫杉醇的含量低是制約因素，必須進行高產細胞株 的篩選和培養，才能解決。因此要從愈傷組織篩選開始，選出高產細胞株，進行懸浮培養，培 養成高產優良性狀的能連續繼代的細胞系。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種高產紫杉醇的紅豆杉細胞株。為了解決此問題，本發明 所採用的技術方案是 ： 一種具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株ra_r. ffiairei)，命名 為：南方紅豆杉植物細胞系N051-3,由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保 藏，保藏號 CGMCC No. 10002。
[0005] 本發明進一步公開了具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株 rar. ffiairei)，保藏號CGMCC No. 10002的用途，主要用於製備抗癌藥製劑的原料。實驗結 果顯示：獲得紫杉醇產量最低達50 mg/L，最高可以達323mg/L。
[0006] 本發明更進一步公開了具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株（ rar. 保藏號CGMCC No. 10002的篩選方法，其特徵在於按如下的步 驟進行： (1)外植體誘導獲得愈傷組織。
[0007] (2)愈傷組織穩定繼代生長 (3)固體愈傷細胞小細胞團法選種。
[0008] 本發明還公開了採用紫杉醇特性的紅豆杉細胞株，生產紫杉醇的方法，其特徵在 於： (1)固體愈傷細胞自然生產。
[0009] (2)液體懸浮培養自然生產。
[0010] (3)液體懸浮培養用組合調控的方法獲得高產。
[0011] 具體是將懸浮細胞接種按照稱重法接種鮮細胞至TA調控培養基，培養基用100mL 三角瓶裝量20mL，接種量為鮮重6g/瓶，暗培養，100轉/分，採用25°C培養；分兩步法培養， 總生產周期28天。在細胞培養的第4天添加甲基茉莉酸100 y M，第28天收穫細胞和培養 液。結果：紫杉醇產量達50-323 mg/L。
[0012] 本發明還公開了具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株rar. ffiairei)通過特異性擴增18S rDNA的部分ITS片段與南方紅豆杉序列進行比對，序列一致， 其特徵在於從基因角度證明該紫杉醇高產細胞系屬於南方紅豆杉。
[0013] 本發明更加詳細的技術內容如下： (1)本發明提供的具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株（raros rar. aairei入命名為：南方紅豆杉植物細胞系N051-3,所述的細胞系是由北京市朝陽區北辰 西路1號院3號，中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏，命名南方紅豆杉植物細胞系 N051-3,保藏日期2014年11月19日，保藏號CGMCC No. 10002,分類學名稱，曾用名7^狀 mairei, Taxus chinensis var. mairei Cheng et L. K，最氣分類學筆 Taxus wallichiana var. mairei 〇
[0014] (2)紫杉醇特性的紅豆杉細胞株（Tkras rar. 的培養特徵 及生理生化指標： 1)本細胞株搖瓶液體細胞系生長穩定，生長量1. 8-3倍/14天，適應生長溫度25°C，暗 培養，生長最適起始pH值5. 8,蔗糖濃度20g/L。
[0015] 2)本細胞株固體細胞偏幹，淺棕色，培養基底部分泌紅色物質，培養周期21天； 3)本細胞株懸浮細胞，細胞淺棕，顆粒飽滿，大小均勻，像小米粒，上清培養液淺棕色， 含白色混濁物的膠體溶液。
[0016] (3)紫杉醇特性的紅豆杉細胞株（Taxus wallichiana var. mairei)的 18S rDNA ITS基因序列為SEQ ID NO. 1:
【權利要求】
1. 一種具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株（Tkras rar. 命 名為：南方紅豆杉植物細胞系N051-3,由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 保藏，保藏號CGMCC No. 10002。
2. 權利要求1所述具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株（Tkras rar. aairei入保藏號CGMCC No. 10002在製備抗癌藥紫杉醇原料藥方面的應用。
3. 權利要求2所述的應用，其中所述的抗癌藥紫杉醇原料藥指的是製劑原料方面的應 用。
4. 權利要求1所述具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株rar. 入保藏號CGMCC No. 10002的篩選方法，其特徵在於按如下的步驟進行： (1) 外植體誘導愈傷細胞； (2) 愈傷組織穩定繼代生長； (3) 固體愈傷細胞小細胞團法選種。
5. -種採用具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株生產紫杉醇的方法，其特徵在於： (1) 固體愈傷細胞自然生產； (2) 液體懸浮培養自然生產； (3) 液體懸浮培養組合調控的方法獲得高產。
6. 權利要求1所述具有高產紫杉醇特性的紅豆杉細胞株rar. ?airei)18S rDNA的部分ITS片段，此18S的部分ITS片段與南方紅豆杉序列進行比對，序 列一致，其特徵在於從基因角度證明該紫杉醇高產細胞系屬於南方紅豆杉。
【文檔編號】C12P17/02GK104450601SQ201410726199
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月4日 優先權日:2014年12月4日
【發明者】張衛, 王麗, 丁靖志, 孫波, 呂建明 申請人:天津艾賽博生物技術有限公司