一種獲得山羊Dlk1基因新轉錄剪切體的方法
2024-01-19 11:24:15 1
一種獲得山羊Dlk1基因新轉錄剪切體的方法
【專利摘要】本發明屬於家畜基因工程【技術領域】，公開了一種獲得山羊Dlk1基因新的轉錄剪切體的方法。首先從南江黃羊肌肉組織中分離出核糖核酸；設計特定的引物組，利用巢式PCR擴展出cDNA片段。經過克隆和測序分析證實了在山羊Dlk1基因轉錄過程中存在3種剪切形式，包含外顯子的部分及全部缺失。這一發現為研究山羊Dlk1基因的表達及功能究奠定了重要基礎。
【專利說明】一種獲得山羊Dlkl基因新轉錄剪切體的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於家畜基因工程【技術領域】，具體涉及一種獲得山羊^7^7基因新轉錄剪切體的方法。
【背景技術】
[0002]Dlkl基浪(Delta-like homolog 2 )位於印記域內，參與哺乳動物的脂肪積累及葡萄糖代謝過程。Dlkl基因也被稱為脂肪前體因子I 0°^/-7)，其蛋白為跨膜糖蛋白，包含六個串聯重複表皮生長因子樣的胞外基序，結構類似Notch信號家族分子，但與Notch家族配體不同的是Dlkl的N端缺乏DSL (Delta:Serrate:Linl2)結構域，因而不能激活Notch信號的受體分子。體外內研究均表明基因參與多個組織的分化，抑制脂肪的生成，可能作為Notch信號分子的拮抗物來參與Notch信號通路的調控。人體內缺乏Dlkl表達會導致肥胖；敲除的轉基因小鼠表現為中度肥胖，同時其體內脂肪含量增加30%，表明Dlkl基因可以抑制脂肪細胞的分化。
[0003]目前，研究發現在人、小鼠、牛和豬基因中存在多種轉錄剪切體(A，B, C，C2,D, D2和E型)，其中A型和B型剪切體編碼具有抑制脂肪細胞分化功能的長鏈可溶蛋白；其它剪接體編碼不具抑制功能的短鏈蛋白。另外，研究還發現過量表達的轉基因小鼠也會出現肌肉肥大。在豬多個組織中均有似左7-AAJh-B取DlkK2表達，其中似左7-C2表達量最高，推測在豬肌肉生長和脂肪沉積等方面發揮著重要的作用。目前在山羊上還未見有關^7^7基因不同轉錄剪切體的報導。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於提供山羊^7^7基因的新轉錄剪切體、其擴增引物及擴增方法。
[0005]本發明所述的山羊Dlkl基因，有三種轉錄剪切體DlldH Dlkl~kS2和似々7-AS3，其核苷酸序列分別如SED ID N0.1，SED ID N0.2和SED ID N0.3所示。
[0006]本發明提供了用於擴增山羊似左2基因的兩組擴增引物:
正向外引物Dlkl-1F的核苷酸序列如SED ID N0.4所示；
反向外引物Dlkl-1R的核苷酸序列如SED ID N0.5所示；
正向內引物Dlkl-2F的核苷酸序列如SED ID N0.6所示；
反向內引物Dlkl-2R的核苷酸序列如SED ID N0.7所示。
[0007]本發明還提供了一種擴增山羊^7^7基因，包括三種轉錄剪切體i?7i7-ASl，DlAl-AS2和D7A7-AS3的方法，步驟如下:
步驟1:提取山羊肌肉組織的總RNA ；
步驟2:從近緣物種人，小鼠，牛和豬^7^7基因序列中分析保守序列，以此作為參考來設計所述引物組；
步驟3:以步驟I所得總RNA為模板，以所述的兩組引物為引物，通過巢式PCR擴增獲得山羊似左7基因的片段。
[0008]對所得序列用NCBI網站進彳丁 blastn在線分析,與/7/^7序列一致性最聞的序列都IDlkl在哺乳動物中的同源序列，可以確定所得序列為山羊^7^7基因。
[0009]利用Clustalx V2.0軟體對山羊Dlkl基因(包括三種轉錄剪切體DlklH,Dlkl-AS2和D7^7-AS3)的核苷酸序列進行比對分析並使用MEGA5.2軟體構建NJ樹。
[0010]本發明以山羊肌肉組織為材料，利用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、巢式聚合酶鏈式反應(nested-PCR)，對山羊左7基因進行了研究，首次從山羊肌肉組織中克隆得到了 Dlkl基因三種轉錄剪切體iDlkl-b&\，Dlkl-b&2和似左7-AS3 )，並對其同源性和進化地位進行了分析，對研究山羊基因不同轉錄剪切體在脂類代謝過程發揮的生物學功能具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]序列表SEQ ID NO:1是本發明克隆的山羊07^7基因的轉錄剪切體I序列片段。
[0012]序列表SEQ ID NO:2是本發明克隆的山羊似左2基因的轉錄剪切體2序列片段。
[0013]序列表SEQ ID NO:3是本發明克隆的山羊似左2基因的轉錄剪切體3序列片段。
[0014]圖1:山羊似左7基因不同轉錄剪切體PCR產物電泳檢測圖。
[0015]圖2:山羊基因不同轉錄到切的不意圖，箭頭表不所述引物位直。
[0016]圖3:近緣哺乳動物Dlkl基因編碼區序列的NJ系統進化樹。
具體實施方案
[0017]以下結合附圖，通過實施例對本發明進一步詳細說明。
[0018]本發明中山羊採自四川省南江黃羊育種場，RNA提取純化等試劑購自Invitrogen公司，PCR試劑購自寶生物(大連)有限公司(Takara)。
[0019]總RNA提取:取10mg山羊肌肉組織在研缽中加液氮研磨，用Trizol法提取總RNA, Trizol試劑購自Invitrogen公司，提取方法根據使用說明書。
[0020]山羊Dlkl基因序列的克隆，包括三個轉錄剪切體DmH DU1-AS2和DlklU:
通過比對已公開的近緣哺乳動物(人、小鼠、牛和豬)的似左2基因序列得到保守區，在保守區序列設計兩組引物擴增山羊^7^7基因。
[0021]山羊基因的克隆:
使用正向外引物Dlkl-1F與反向外引物Dlkl-1R進行第一輪PCR擴增，對擴增產物用正向內引物Dlkl-2F與反向內引物Dlkl-2R進行第二輪PCR擴增，獲得山羊左7基因的目的片段；
Dlkl-1F:5』 TCCGCAACCAGAAGCCCAG 3』
Dlkl-1R:5』 GCGTAGCGTTCACCAGATTTG 3』
Dlkl-2F:5』 CTTGCTCCTGCTGGCTTTC 3』
Dlkl-2R:5』 GTGGTCATGTCGATCTTCTC 3』
第一輪PCR:
擴增反應體系如下:
【權利要求】
1.作為山羊Dlkl基因新的轉錄剪切體，它們的核苷酸序列如序列表SEQID NO:1,SEQID NO:2 和 SEQ ID NO:3 所述。
2.根據權利要求1所述的基因片段，其特徵在於:其中SEQID NO:1片段未發現缺失序列；SEQ ID NO:2片段缺失從第三外顯子第13個核苷酸到第五外顯子第205個核苷酸序列，包括部分第三和第五外顯子序列，完整第四外顯子序列；SEQ ID NO:3片段缺失從第三外顯子第43個核苷酸到第五外顯子第103個核苷酸序列，包括部分第二和第六外顯子序列，完整第三、第四和第五外顯子序列。
3.檢測權利要求1所述遺傳標記的正、反向引物組的DNA序列如下所示:
Dlkl-1F:5』 TCCGCAACCAGAAGCCCAG 3』
Dlkl-1R:5』 GCGTAGCGTTCACCAGATTTG 3』
Dlkl-2F:5』 CTTGCTCCTGCTGGCTTTC 3』
Dlkl-2R:5』 GTGGTCATGTCGATCTTCTC 3』。
4.製備如權利要求1或2所述的基因片段的方法，按照以下步驟:
利用NCBI資料庫信息，比對人、小鼠、牛和豬Dlkl基因得到保守區，在保守區設計引物擴增山羊Dlkl基因，提取山羊肌肉組織RNA，設計引物，PCR擴增、PCR產物純化和測序，獲得如序列表SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所述的核苷酸序列。
【文檔編號】C12N15/11GK104164437SQ201310186871
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年5月20日 優先權日:2013年5月20日
【發明者】仲濤, 張紅平, 李利, 靳鵬飛, 王林傑 申請人:四川農業大學