山羊IGFBP3基因cDNA編碼序列克隆的方法

2024-01-19 12:58:15 2

山羊IGFBP3基因cDNA編碼序列克隆的方法
【專利摘要】本發明公開了一種山羊IGFBP3基因cDNA編碼序列克隆的方法，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，包括以下步驟：A1、提取山羊背最長肌組織中的總RNA，然後將總RNA反轉錄成cDNA；A2、引物的設計和PCR擴增：以綿羊該基因的序列為模板在起始密碼子上遊區域和終止密碼子的下遊區域設計引物，設計的引物為：正向引物：5'AGCTCGCTGCCGCCCAGT3'，反向引物：5'GCTGATCATGTCCTTGGCAG3'；A3、PCR產物的純化回收；A4、克隆。本發明提供了一種簡捷的獲取山羊IGFBP3基因cDNA編碼序列的方法，為進一步研究該基因在山羊生長發育過程的作用奠定了基礎。
【專利說明】山羊IGFBP3基因 cDNA編碼序列克隆的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及動物基因工程【技術領域】，更具體地說涉及一種從山羊肌肉組織中克隆 IGFBP3 (Insulin-like growth factor binding protein 3)基因 cDNA 編碼區序列的方 法。

【背景技術】
[0002] 胰島素樣生長因子結合蛋白（IGFBPs)作為胰島素樣生長因子系統的一員，其與 胰島素樣生長因子（IGFs)之間是一個複雜的生長調節軸=IGFBPs與IGFs和酸敏感亞單元 (ALS)結合形成三元複合物來運載IGFs，而且通過IGFBPs不同的親和力與IGFs結合以調 節游離IGFs的生物學活性，IGFBP-3是血液中濃度最高的胰島素樣生長因子結合蛋白，同 時也是血清IGFs的主要載體，IGFBP-3主要和IGF- I結合，有助於維持IGF-I的生物利用 度，保證IGF-I的生物功效。因此IGFBP3基因在動物的生長、發育和代謝過程中起著重要 的作用。
[0003] RT-PCR克隆：是將RNA的反轉錄（RT)和CDNA的聚合酶鏈式反應以及分子克隆相 結合的一種技術。首先利用反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴增我們需要 的目的基因片段，然後將此片段與載體連接轉化到感受態細胞中進行克隆，獲得的質粒PCR 產物進行測序。此技術利用PCR技術能在體外進行有效的基因擴增，而不需要內切酶消化 和連接酶處理，能夠快速獲得其它依靠限制性內切酶消化法難於得到的PCR產物；同時該 方法能克服普通PCR產物測序引物近端的十幾個鹼基無法測序獲得的缺點。與RACE (cDNA 末端快速擴增）技術相比較而言，目的基因片段的長度明確，成本較低，工作量小。該技術 的關鍵是PCR引物的設計，在起始密碼子的上遊設計正向引物，在終止密碼子的下遊設計 反向引物，使得PCR產物能包含完整的基因編碼區全序列。
[0004] 分段PCR克隆法：將目的基因分成幾個片段來分別克隆，然後再通過亞克隆測序 將其拼接起來，此方法成本較高，耗時多且工作量大，一個基因分成幾段就需要做幾次克 隆，然後再進行序列拼接。
[0005] 獲得目的基因編碼區序列一般採用克隆或RACE技術，RACE技術是基於PCR技術 基礎上由已知的一段cDNA片段，通過向兩端延伸擴增從而獲得完整的3'端和5'端。但該 技術與克隆技術相比，目的基因片段的長度不明確，試驗成本高，工作量大，對於提取的RNA 質量要求較高，因此應用相對較少。


【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種山羊IGFBP3基因 cDNA編碼序列克隆的方法。填補在山羊上該基因研究的空白，為進一步研究其在山羊上的 功能奠定基礎。
[0007] 本發明採用以下技術方案： 山羊IGFBP3基因 cDNA編碼序列克隆的方法，包括以下步驟： AU從山羊背最長肌組織中提取總RNA，然後將總RNA反轉錄成cDNA ; A2 :以綿羊該基因的序列為模板在起始密碼子上遊區域和終止密碼子的下遊區域設計 引物； A3 :以cDNA為模板進行PCR擴增； A4 :擴增產物的膠回收和純化； A5 :純化的產物進行克隆與測序，即能得到山羊IGFBP3基因 cDNA編碼序列。
[0008] 所述的方法，步驟Al包括以下步驟：取用液氮研磨好的組織粉末約80mg，加入預 先盛有ImL Trizol的EP管中，振蕩混勻後，室溫靜置5min ;加氯仿0. 2mL(必須按總體積 的1/5)，旋渦儀振蕩混勻15s，室溫靜置5min ;4°C下12000rpm離心15min ;轉移上層水相 45〇μ?於另一個新的I. 5mLEP管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻後室溫靜置IOmin ;4°C下 12000rpm離心IOmin ;棄去上層清液後，加入4°C預冷的75%乙醇(用DEPC處理水配製)lmL， 靜置5min，4°C下7500g離心5min ;棄上清，用槍吸取多餘的液體，空氣乾燥約3min ;加入 3〇μ? DEPC處理水，吹打混勻，充分溶解RNA，然後立即反轉錄成cDNA。
[0009] 所述的方法，步驟A2中引物為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1是山羊IGFBP3基因的PCR產物電泳圖。
[0011] 圖2是山羊IGFBP3基因編碼區的核苷酸序列和對應的胺基酸序列。

【具體實施方式】
[0012] 以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0013] 具體實施步驟： 1、組織樣的採集 選取出生後120d的南江黃羊進行宰殺，取其背最長肌組織樣品後迅速置於液氮中保 存待用。
[0014] 2、總RNA的提取和cDNA的合成 (1) 取用液氮研磨好的組織粉末80mg，加入預先盛有ImL Trizol的EP管中，振蕩混勻 後，室溫靜直5min ; (2) 加氯仿0. 2mL(必須按總體積的1/5)，旋渦儀振蕩混勻15秒，室溫靜置5min ; (3) 4°C下 12000rpm 離心 15min ; (4) 轉移上層水相45〇μ?於另一個新的I. 5mLEP管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻後 室溫靜置IOmin ; (5) 4?下 12000rpm 離心 IOmin ; (6) 棄去上層清液後，加入4°C預冷的75%乙醇(用DEPC處理水配製）lmL，靜置5min， (7) 4°C下 7500g 離心 5min ; (8) 棄上清，用槍吸取多餘的液體，空氣乾燥約3min ;加入3〇μ? DEPC處理水，吹打混 勻，充分溶解RNA。
[0015] (9)用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA的質量，效果好的立即反轉錄成cDNA。
[0016] 3、目的基因片段的擴增 (1) 引物的設計：根據GenBank資料庫中公布的綿羊（6￥i5· aries )的IGFBP3 (NM_001134302)基因序列，採用Primer Premier 5. O軟體設計引物，設計的引物為： 正向引物：5' AGCTCGCTGCCGCCCAGT 3' 反向引物：5' GCTGATCATGTCCTTGGCAG 3' (2) PCR的反應體系和條件：反應體系（25μυ :0.25 μ?的TaKaRa Taq酶，12. 5 μ?的 2XGC Buffer I，4 μ? 的 dNTP Mixture，正反向引物各 0.5 μ?，6.25 μ? 的滅菌 CldH2O，模板 cDNA 1 μ?。反應條件為 95°C 預變性 4 min，35 個循環（94°C，45 s;53.4°C，30 s;72°C，90 s)，最後72°C 7 min ;PCR產物用I. 5%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。
[0017] 4、PCR產物的回收和純化 PCR產物用上海生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒純化回收，具體步驟為： (1)通過1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳將目的DNA片段與其它DNA儘可能分開，然後用乾淨 的手術刀將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊切下，放入I. 5 mL離心管中。
[0018] (2)稱量凝膠的重量，根據膠塊的重量和濃度，按每IOOmg瓊脂糖加40〇μ?的比例 加入 Binding Buffer II。
[0019] (3)將離心管置於55 °C金屬恆溫浴中5~10 min，間或混勻，直至膠塊完全溶化。
[0020] (4)(可選步驟)當目的片段500bp時，此步驟可以省略，直接進行步驟（5)。
[0021] (5)將溶化的膠溶液轉移到套放在2ml收集管內的UNIQ-10柱中，室溫放置2 min。 8000 rpm室溫離心I min。
[0022] (6)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，力口 入 500 KL Wash Solution，10000 rpm 室溫離心 I min。
[0023] (7)重複步驟（6) -次。
[0024] (8)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中， 12000 rpm 室溫離心 2 min。
[0025] (9)將UNIQ-10柱放入一新的I. 5 mL離心管中，在吸附膜中央加30 μ? Elution Buffer,室溫放置1?2 min。12000 rpm室溫離心I min,離心管中的液體即為回收的DNA片 段。
[0026] (10)取收集的DNA 2μ?，1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測回收的DNA質量。
[0027] 4、產物的克隆 (1)目的片段與載體連接 將膠回收產物與PMD19-T載體連接。將載體在冰上融化，短暫離心裝有載體的離心管， 以免液體掛在管壁上。在超淨操作臺上按照如下體系配置連接液：

【權利要求】
1. 山羊IGFBP3基因 cDNA編碼序列克隆的方法，其特徵在於，包括以下步驟： 步驟一：從山羊肌肉組織樣品中提取總RNA，然後將總RNA反轉錄成cDNA ; 步驟二：擴增引物的設計及PCR反應：以綿羊該基因的序列為模板在起始密碼子上遊 區域和終止密碼子的下遊區域設計引物；設計的引物為： 正向引物：5' AGCTCGCTGCCGCCCAGT3' 反向引物：5' GCTGATCATGTCCTTGGCAG3' 用cDNA為模板先進行梯度PCR反應，退火溫度範圍選擇50°C到60°C共8個溫度點，優 化普通PCR的條件。 2. PCR反應體系為 25μ?體系：0.25 μ? 的 TaKaRa Taq酶，12.5 μ? 的 2XGC Bufferll， 4 μ? 的 dNTP Mixture，正反向引物各 0.5 μ?，6·25 μ? 的滅菌 ddH20，模板 cDNA 1 μ?。
3. 反應條件為 95°C預變性 4 min，35 個循環（94°C，45 s;53.4°C，30 s;72°C，90 s)， 最後 72°C 7 min ; 步驟三：擴增產物的回收和純化； 步驟四：純化的產物進行克隆與測序，得到882bp的核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO: 1所示，即為山羊IGFBP3基因的編碼區全序列。
【文檔編號】C12N15/10GK104293766SQ201310294920
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月15日 優先權日:2013年7月15日
【發明者】佔思遠, 張紅平, 李利, 王林傑, 仲濤 申請人:四川農業大學