用於擴增核酸的組合物、方法和試劑盒的製作方法

2023-09-18 20:30:50 1

專利名稱：：用於擴增核酸的組合物、方法和試劑盒的製作方法用於擴增核酸的組合物、方法和試劑盒領域本發明一般涉及用於擴增核酸同時減少非特異性螢光和不需要的擴增產物的組合物、方法和試劑盒。介紹儘管聚合酶鏈式反應(PCR)及相關的技術對於各種應用是高度有用的，但是由於不理想的副反應而引起的非耙核酸的擴增可能存在顯著的問題。這樣的副反應可以作為非靶核酸的錯誤引發和/或引物寡聚化(有時也叫作引物二聚體形成)，以及這些引發的假體(artifacts)的後續擴增的結果而發生。在使用具有顯著的背景核酸而耙核酸以低拷貝數存在的核酸混合物進行PCR的應用中，這是特別實際的(參見，例如，Chou等,Nud.AcidsRes.(核酸研究)20:1717-1723(1992))。非特異性擴增產物的產生己經至少部分歸因於延長非特異性退火的引物的環境溫度下的DNA聚合酶活性(參見，例如，z(Li等，Proc.Natl.Acad.Sd.(美國國家科學院學報)87:4580(1990))。因此，在環境溫度下抑制DNA聚合酶的活性有利於控制次級擴增子的產生。已經描述了一些技術，據說其減少不需要的次級擴增產物的形成。按照某些"手工熱啟動"技術，直到混合物的溫度足夠高足以防止非特異性引物退火時才加入對DNA聚合酶活性重要的成分(例如，二價離子和/或DNA聚合酶本身)到反應混合物中(參見，例如，Chou等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)20:1717-1723(1992);禾BD，Aquila等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)19:3749(1991))。較少勞動力-密集型技術應用擴增反應的至少一種成分的物理分離或可逆失活。例如，鎂或DNA聚合酶可以隔離在蠟珠中，當反應溫度升高時蠟珠熔化，只在升高的溫度釋放所隔離的成分。按照其它的技術，對DNA聚合酶進行可逆地失活或修飾，例如，通過DNA聚合酶的可逆的化學修飾或與抗體的結合(參見，例如，Birch等，美國專利號5,677,152)。在升高的反應溫度，所述化學修飾被逆轉，或者所述抗體分子變性，釋放出功能性DNA聚合酶。然而，一些這樣的技術似乎是有漏洞的，原因在於在更低的反應溫度，一些DNA聚合酶活性是可檢測到的，或者它們需要將反應混合物延長暴露於高溫才能完全使得DNA聚合酶失活。某些目前所用的核酸擴增技術包括檢測和/或定量擴增產物的步驟，其包括核酸染料，例如但不限於，SYBRGreenI(分子探針(MolecularProbes)，Eugene,OR),包括某些實時和/或終點檢測技術(參見，例如，Ririe等，Analyt.Biochem.(分析生物化學)245:154-60(1997))。典型地，所述核酸染料與擴增產物的雙鏈片段和/或引物-模板雙鏈體締合，並且在特別的核酸染料所特有的波長發射可撿測的螢光信號。某些擴增方法包括評估擴增產物的純度的檢測步驟，其包括核酸染料，例如但不限於，PCR後解離曲線分析，其也叫作解鏈曲線分析。由於擴增子的解鏈曲線特別取決於它的長度和序列，所以擴增子通常可以通過它們的解鏈曲線而區分(參見，例如，Zhang等,H印atology(肝臟病學)36:723-28(2002))。解離或解鏈曲線可以在特定的擴增反應過程中當反應溫度經過所述擴增子的解鏈溫度時通過檢測核酸染料的螢光而獲得。雙鏈擴增子的解離觀察為在所述核酸染料特徵性發射波長的螢光的突然減少。按照某些解離曲線分析技術，當解鏈曲線表現出單一的、一致的解鏈溫度時，有時在螢光強度的負導數相對溫度(-dF/dt相對T)的圖上繪圖性表示為一個峰，那麼將擴增產物分類為"純的"。例如，在來自單叢擴增的這樣的解離曲線中出現多個峰典型地表明存在不需要的副反應產物。當應用這樣的基於核酸染料的擴增產物檢測技術時，通常理想地1)至少減少並且優選地消除不需要的副反應產物的形成，和2)至少減少並且優選地消除由其它核酸，即非擴增產物的雙鏈片段的變性導致的螢光峰。除此之外，由於引物、連接探針、裂解探針、啟動子-引物等的非特異性退火，以及隨後在亞最佳溫度的酶活，某些其它擴增技術也可以產生不需要的擴增產物。例如，儘管反應成分通常是室溫下結合，或者儘管反應組合物被加熱到需要的反應溫度。這些技術中至少有一些可以受益於背景螢光的減少。發明概述本發明涉及用於擴增靶核酸同時減少非特異性螢光和不需要的擴增產物的組合物、方法和試劑盒，所述不需要的擴增產物在本領域中有時叫作次級擴增子或假性副產物。本發明公開了包括核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑。所述公開的抑制劑設計成抑制酶的至少一種酶活性。在某些實施方案中，所述酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。在一些實施方案中，酶抑制劑包括能夠形成至少一個雙鏈片段的適體(參見，例如，Yakimovich等，Biochem.(Mosc.)(生物化學(莫斯科))68(2):228-35(2003);Nickens等，RNA9:1029-33(2003);Nishikawa等，Oligonucleotides(寡核苷酸)14:114-29(2004);和Umehara等，J.Biochem.(生物化學雜誌)137:339-74(2005))。在一些實施方案中，酶抑制劑包括多樣的不同的猝滅劑。在某些實施方案中，所述酶抑制劑可以呈現出一種構象，所述構象在第一溫度包括至少一個雙鏈片段，但是當加熱到第二溫度時，是單鏈的或基本上單鏈的。按照某些實施方案，包括至少一個雙鏈片段的酶抑制劑可以與下列各項中的至少一種形成複合體DNA聚合酶，包括但不限於反轉錄酶；RNA聚合酶；裂解酶，包括但不限於，結構-特異的核酸酶；解旋酶；和連接酶。在某些實施方案中，酶抑制劑是相對應的酶的無效底物，原因在於所述抑制劑包括封閉基團、核苷酸類似物、不可裂解的核苷酸間連接或它們的組合。本發明公幵了包括核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑。一些DNA聚合酶抑制劑包括兩種或多種猝滅劑，其可以是相同的猝滅劑或不同的猝滅劑。在某些實施方案中，DNA聚合酶抑制劑還包括小溝結合物，其在一些實施方案中包括猝滅劑。在一些實施方案中，DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列的3，-端不能被DNA聚合酶延伸，這典型地是由於封閉基團或非延伸核苷酸的存在。在一些實施方案中，DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括能夠形成至少一個雙鏈片段的適體(參見，例如，Yakimovich等，Biochem.(Mosc.)(生物化學(莫斯科))68(2):228-35(2003))。本發明提供包含酶和酶抑制劑的複合物。某些複合物包含DNA聚合酶和DNA聚合酶抑制劑；連接酶和連接酶抑制劑；RNA聚合酶和RNA聚合酶抑制劑；裂解酶和裂解酶抑制劑；或解旋酶和解旋酶抑制劑。某些複合物還包含脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，核苷酸類似物，輔助蛋白，例如但不限於單鏈結合蛋白(SSB)或增殖細胞核抗原(PCNA)，或它們的組合。典型地，所述酶-酶抑制劑複合物可以在第一溫度形成，並且當與在所述複合物中的抑制劑締合時，所述酶的至少一種催化活性被抑制。當將所述複合物加熱到第二溫度時，所述複合物解離，釋放所述酶。在某些實施方案中，酶-酶抑制劑複合物包括DNA聚合酶和DNA聚合酶抑制劑。在某些實施方案中，DNA聚合酶-DNA聚合酶抑制劑複合物還包括核苷酸三磷酸(NTP)和/或核苷酸類似物。某些複合物實施方案包括與DNA聚合酶締合的以莖-環構象存在的DNA聚合酶抑制劑，並且任選地，NTP和/或核苷酸類似物。某些複合物實施方案包括與DNA聚合酶抑制劑締合的DNA聚合酶，並且任選地，NTP和/或核苷酸類似物，所述DNA聚合酶抑制劑包括退火形成包含至少一個雙鏈片段的雙鏈體的至少兩個寡核苷酸。典型地，當它與本發明的DNA聚合酶抑制劑，並且任選地，NTP和/或核苷酸類似物複合時，所述DNA聚合酶的DNA合成活性被抑制。本發明公開減少非特異性螢光的方法，其包括本發明的酶抑制劑。按照某些方法，在適合形成酶-酶抑制劑複合物的條件下，將酶與酶抑制劑接觸。當所述酶存在於所述複合物中時，所述酶的至少一種酶促活性被抑制。當將所述酶-酶抑制劑複合物加熱到適當的第二溫度時，所述複合物解離，將所述酶釋放。一些減少非特異性螢光的方法包括本發明的DNA聚合酶抑制劑。按照某些這樣的方法，反應組合物在第一溫度形成，其包括DNA聚合酶，包括核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑，NTP和/或核苷酸類似物，靶核酸，引物和核酸染料。在某些實施方案中，所述引物包括引物對。在第一溫度，所述DNA聚合酶抑制劑包括至少一個雙鏈片段，並且可以與所述DNA聚合酶形成複合物。DNA聚合酶抑制劑的猝滅劑可以吸收與所述DNA聚合酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料的至少一些螢光信號。將所述反應組合物加熱到第二反應溫度，所述第二反應溫度典型地接近、處於或者高於所述DNA聚合酶抑制劑的解鏈溫度，這引起至少一些所述DNA聚合酶抑制劑-DNA聚合酶複合物的解離。將所述反應組合物進行至少一個擴增循環，並且產生擴增子的多樣性。由於與所述擴增子締合的核酸染料的螢光，在"實時"或在擴增反應完成後，可以檢測到雙鏈擴增子，但是與所述DNA聚合酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料的螢光至少被猝滅劑減少。本發明還公開了擴增靶核酸的方法，其使用本發明的酶抑制劑。按照某些這樣的方法，反應組合物在第一溫度形成，其包括DNA聚合酶，包括核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑，NTP，靴核酸，引物，和核酸染料。在某些實施方案中，所述引物包括引物對。在第一溫度，所述DNA聚合酶抑制劑包含至少一個雙鏈片段，並且可以與DNA聚合酶形成形成複合物。所述DNA聚合酶抑制劑的猝滅劑可以吸收由與所述DNA聚合酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料發射的至少一些螢光。將所述反應組合物加熱到第二反應溫度，所述第二反應溫度典型地接近、處於或者高於所述DNA聚合酶抑制劑的解鏈溫度，這引起至少一些所述DNA聚合酶抑制劑-DNA聚合酶複合物的解離。將所述反應組合物進行至少一個擴增循環，並且產生擴增子的多樣性。在某些實施方案中，由於在所述反應組合物中存在DNA聚合酶抑制劑，所產生的擴增子的量增加。按照某些方法，反應組合物包括靶核酸，酶，酶抑制劑，核酸染料和下列各項中的至少一種NTP，核苷酸類似物，引物，連接探針對，裂解探針對，啟動子-引物，輔因子，例如但不限於包含NAD+的物質，和輔助蛋白，其包括但不限於PCNA和/或SSB。按照某些方法，將連接酶與連接酶抑制劑接觸，並且在適當的條件下，形成連接酶-連接酶抑制劑複合物。按照某些方法，將裂解酶與裂解酶抑制劑接觸，並且在適當的條件下，形成裂解酶-裂解酶抑制劑複合物。按照某些方法，將解旋酶與解旋酶抑制劑接觸，並且在適當的條件下，形成解旋酶-解旋酶抑制劑複合物。按照一些方法，將RNA聚合酶與RNA聚合酶抑制劑接觸，並且在適當的條件下，形成RNA聚合酶-RNA聚合酶抑制劑複合物。本發明還公開用於進行某些本發明方法的試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒包括包含核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑。在某些實施方案中，試劑盒包括兩種或多種不同的酶抑制劑。在一些實施方案中，酶抑制劑可以與RNA聚合酶、解旋酶、裂解酶或連接酶形成複合物。某些試劑盒實施方案還包括裂解探針組、連接探針組、引物、啟動子-引物或它們的組合。某些試劑盒實施方案包括包含核苷酸序列和猝滅劑的至少一種DNA聚合酶抑制劑。在一些實施方案中，試劑盒包括兩種或多種DNA聚合酶抑制劑。在某些實施方案中，DNA聚合酶抑制劑包括小溝結合物。某些試劑盒實施方案還包括下列各項中的至少一種引物，引物對，核酸染料,DNA聚合酶，和報導探針。在一些實施方案中，試劑盒包括DNA-依賴型DNA聚合酶和反轉錄酶。在本文中描述了本發明的這些和其它特徵。附圖熟練的技術人員應該理解下文所述的附圖只是舉例說明的目的。這些附圖並不意欲以任何方式限制本發明的範圍。圖1:示意性描述包含單一寡核苷酸的某些代表性酶抑制劑的示例實施方案。圖2:示意性描述包含多樣性寡核苷酸的某些代表性酶抑制劑的示例實施方案。圖3:描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制劑獲得的解離曲線，其作為螢光的負導數(-dF/dt)相對於溫度°C繪圖。圖4:描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制劑獲得的解離曲線，其作為螢光的負導數相對於溫度'C繪圖。圖5:描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制劑獲得的解離曲線，其作為螢光的負導數相對於溫度"C繪圖。圖6:描述使用某些代表性DNA聚合酶抑制劑獲得的解離曲線，其作為螢光的負導數相對於溫度'C繪圖。圖7:描述瓊脂糖凝膠的照片。將包含在不同濃度的代表性酶抑制劑中產生的擴增子的系列熱循環反應組合物的等分試樣在非變性瓊脂糖凝膠的分開泳道中進行電泳，並且用溴化乙錠顯現，如在實施例2中所述。泳道A和J:大小梯度，包括1200鹼基對，800鹼基對，400鹼基對，200鹼基對，和100鹼基對大小標準物；泳道B-G:分別為包含5，10,25，50,75或100nMDNA聚合酶抑制劑E的熱循環反應組合物的等分試樣；泳道H:包含50nMDNA聚合酶抑制劑E的無模板對照反應組合物；泳道I:空白。aiLJS述瓊脂糖凝膠的照片。將包含在不同濃度的代表性DNA聚合酶抑制劑中產生的擴增子的系列熱循環反應組合物的等分試樣在非變性瓊脂糖凝膠的分開泳道中進行電泳，並且用溴化乙錠顯現，如在實施例3中所述。泳道A和J:大小梯度，包括1200鹼基對，800鹼基對，400鹼基對,200鹼基對，和IOO鹼基對大小標準物；泳道B-H:分別為包含0,5,10，25，50，75或100nMDNA聚合酶抑制劑E的熱循環反應組合物的等分試樣；泳道I:包含50nMDNA聚合酶抑制劑E的無模板對照反應組合物。圖9:描述非變性瓊脂糖凝膠的照片，表現出由於存在代表性的DNA聚合酶抑制劑而導致的次級擴增子的減少，如在實施例4中所述。1_1^_描述按照本發明的代表性方法產生的代表性解離曲線，如在實施例5中所述。示例性實施方案的描述應該理解，前文的概括描述和下述詳細描述都只是示例性的和解釋性的，並不是意欲限制本發明的範圍。當用於本說明書中時，詞語"a(—個)"或"an(—種)"意指至少一個，除非特別另外闡明。在本說明書中，單數的應用包括複數，除非特別另外闡明。例如但不是作為限制，"一種靶核酸"意指可存在不止一種靶核酸；例如，一個或多個拷貝的特別的靶核酸種類，以及兩種或多種不同種類的靶核酸。此夕卜，使用"comprise(包括)","comprises(包括)，，，"comprising(包括)"，"contain(含有)，，，"contains(含有)，，，"containing(含有)","include(包含)","includes(包含)"，和"including(包含)"並不意欲限制。術語"和域"意指前和後的術語可以一起或分幵採用。出於舉例說明的目的，而不是作為限制，"X和/或Y"可以意指"X"或"Y"或者"X和Y"。本文所用的部分標題只是出於組織的目的，並不是解釋為以任何方式限制所述的主題。在本說明書中引用的所有文獻，包括但不限於專利、專利申請、論文、書和論述都通過引用完全清楚地結合用於任何目的。在任何所結合的文獻與本說明書中定義的任何術語相牴觸的事件中，由本說明書控制。儘管本發明與許多實施方案結合進行描述，但是並不傾向於本發明應該被所述的實施方案所限制。相反，本發明包括各種備選方案、修改和等價物，這是本領域的技術人員應該理解的。JohnW.Brandis的美國專利申請系列號10/762,222,題目為"CompetitiveKineticNucleicAcidDNApolymeraseinhibitors(競爭性雲力力學核酸DNA聚合酶抑制劑)"，其與2004年1月11日提交，通過引用完全清楚地結合於此用於任何目的。一些定義當參考從核酸染料發射的螢光信號應用時，術語"吸收至少一些"是指由於酶抑制劑的一種或多種猝滅劑的存在而導致的可檢測的螢光的減少。吸收由與酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料發射的螢光中的至少一些，意指相對於在除了所述酶抑制劑不包括猝滅劑之外包括相同的成分的反應組合物中的可檢測的螢光，在所述核酸染料特有的發射波長處的可檢測的螢光中存在可測量的減少。在一些實施方案中，在可檢測的螢光中的可測量的減少意指在螢光中的30°/。，40%,50%,60%,70%，80%,90%,95%,97%,98%,99%或大於99%的相對減少。在某些實施方案中，其中所述至少一種猝滅劑包括螢光猝滅劑，在所述核酸染料特有的波長處的可檢測的螢光中可存在可測量的減少，並且在所述酶抑制劑的至少一種螢光猝滅劑的特徵發射波長處的可檢測的螢光中可存在可測量的減少。當用於本文時，術語"擴增子"和"擴增產物"通常是指擴增反應的產物。擴增子可以是雙鏈的或單鏈的，並且可以包括通過將雙鏈的擴增產物變性而獲得的分開的組成鏈。在一些實施方案中，擴增子包括連接產物(例如但不限於連接的探針)，連接產物的至少部分的補體，或二者。在某些實施方案中，一個擴增循環的擴增子可以作為後續擴增循環的模板。術語"退火(annealing)"和"雜交(hybridizing)",包括但不限於源單詞雜交(hybridize)和退火(anneal)的變化，是可以互換地使用的，並且意指一種核酸與另一種核酸的核苷酸鹼基-配對的相互作用，其導致形成雙鏈體、三鏈體或其它更高級的結構。在本發明的一些實施方案中，退火或雜交是指在相同的酶抑制劑的至少兩個區域中的至少一些核苷酸之間的相互作用，以形成髮夾或莖-環結構，有時稱為自我退火。一級相互作用典型地是核苷酸鹼基特異性的，例如，A:T,A:U,和G:C，通過沃森-克裡克和Hoogsteen-型氫鍵作用。在某些實施方案中，鹼基-堆積和疏水相互作用還可以有助於雙鏈體穩定性。引物和探針退火成為互補序列的條件是本領域公知的，例如，如在NucleicAcidHybridization,APracticalApproach(核酸雜交，實用方法)，Hames和Higgins，編，IRL出版，Washington,D.C.(1985)和Wetmur和Davidson,Mol.Biol.(分子生物學)31:349，1968中所述。通常，這樣的退火是否發生特別受下列各項的影響某些酶抑制劑的相對應的第一和第三區域和/或第四和第六區域的互補部分的長度，引物與它們在靶旁側序列和/或擴增子中的相對應的結合位點的互補部分的長度，裂解探針或連接探針和靶核酸或擴增子的相對應的結合部分的互補部分的長度，或者報導探針與其結合位點的相對應的互補部分的長度；pH;溫度；單價和二價陽離子的存在；在雜交區域的G和C核苷酸的比例；介質的粘度；以及變性劑的存在。這樣的變量影響雜交所需要的時間。在某些酶抑制劑實施方案中，在所述抑制劑、探針和/或引物中存在特定的核苷酸類似物或小溝結合物還可以影響雜交條件。因此，優選的退火條件將取決於具體的應用。然而，這樣的反應條件可以由本領域的普通技術人員常規確定，無需過度實驗。優選地，選擇退火條件，以在第二反應溫度允許所述引物和/或探針選擇性地與反應組合物中相對應的靶旁側序列或擴增子中的互補序列雜交，而不以任何顯著的程度與反應組合物中的不同的靶核酸或非靶序列雜交。術語"選擇性雜交"及其變化意指，在適當的嚴格條件下，給定的序列(例如但不限於引物)與包含核苷酸的互補片段(string)(例如但不限於，靶旁側序列或擴增子的引物-結合位點)的第二種序列退火，但是不與不需要的序列如非靶核酸、探針或其它引物退火。典型地，當反應溫度升高到特別的雙鏈序列的解鏈溫度時，選擇性雜交的相對量通常增加，並且錯位引發(mispriming)通常減少。在本說明書中，一種序列與另一種序列雜交或選擇性雜交的敘述包括兩種所述序列完全彼此雜交或選擇性雜交的情形，以及只有所述序列中的一種或兩種的部分與完整的另一種序列或其它序列的部分雜交或選擇性雜交的情形。當用於本文時，術語"嚴格性"用來定義在將形成包括兩個互補核苷酸序列的雜合體的雜交和後續處理步驟中存在的溫度和溶劑組成。嚴格性還定義同源性的量，需要的條件，和在兩種核苷酸序列之間形成的雜合體的穩定性。當嚴格性條件升高時，對選擇性雜交是有利的，並且對非特異性交叉雜交是不利的。相對於更低的嚴格性條件，其中更可能發生錯誤的引發，包括但不限於，連接探針和/或裂解探針的錯誤退火，增加的嚴格性條件典型地對應更高的溫育溫度，更低的鹽濃度，和/或更高的pH。本領域的那些技術人員理解，能夠使得引物或引物對、連接探針對和/或裂解探針對與相對應的靶旁側序列和/或擴增子選擇性雜交的適當的嚴格性條件可以使用己知的技術無需不必要的實驗而常規確定(參見，例如，PCR:TheBasicsfrombackgroundtobench(PCR:從後臺到工作檯的基礎)，McPherson和Moller,BiosScientificPublishers(生物科學出版社)(2000;以下為"McPherson"))。在本說明書中，一種核酸序列與另一種核苷酸序列相同或基本上相同的敘述包括兩種核苷酸序列與另一種序列完全相同或者基本上相同的情形，以及所述核苷酸序列中的一種只有部分與完整的另一種序列的部分相同或基本上相同的情形。同樣地，一種核酸序列與另一種核苷酸序列互補或基本上互補的敘述包括兩種核苷酸序列彼此完全互補或基本上互補的情形，以及所述序列中的一種只有部分與完整的另一種序列的部分互補或基本上互補的情形。當用於本文時，術語"適體"是指DNA或RNA寡核苷酸，其1)使用體外選擇方法，例如但不限於"通過指數富集配體的系統進化技術(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)(SELEX)"方法或其變化，典型地首先得到鑑定，並且2)以高特異性、構象-依賴性方式識別並且結合配偶體，例如但不限於酶。當用於本文時，術語"或它們的組合"是指在先術語所列條目的所有排列和組合。例如，"A,B,C或它們的組合"意欲包括下述的至少一種A,B，C,AB，AC，BC，或ABC，並且如果在特別的情形中順序是重要的，還包括BA,CA，CB,ACB,CBA,BCA，BAC，或CAB。繼續使用這一實例，清楚地包括包含一個或多個條目或項目的重複，諸如BB,AAA,AAB,BBC,AAABCCCC,CBBAAA，CABABB等的組合。熟練的技術人員應該理解，典型地，在任何組合中對條目或項目的數目沒有限制，除非另外從上下文中顯而易見。當用於本文時，術語"互補(complementary)"和"互補性(complementarity)"參考通過鹼基-配對法則而相關的至少兩種核酸而應用。例如但不限於，序列"A-C-T"與序列"T-G-A"互補。互補可以是部分的，在這種情形中只有一些核苷酸按照鹼基-配對法則而匹配。或者，在核酸之間可以存在完全的或全部的互補性。核酸鏈之間的互補性的程度對所述核酸鏈之間的雜交的效率和強度有顯著的影響。對於穩定的雙鏈體的形成，互補性不必是全部的，即，穩定的雙鏈體可以包含錯配的鹼基對或不匹配的鹼基。根據經驗考慮許多變量，包括但不限於，核酸的長度、鹼基組成和核酸的序列、離子強度和錯配鹼基對的發生率，本領域的技術人員可以確定雙鏈體的穩定性。核酸雙鏈體的穩定性典型地通過其解鏈溫度、、當用於本文時，術語"複合物"和"酶抑制劑-酶複合物"是指在本發明的酶抑制劑和相對應的酶之間的締合。在一些實施方案中，酶抑制劑-酶複合物包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，連接酶，裂解酶，或解旋酶。術語抑制(inhibit)，抑制(inhibits)或其變化，當參考酶應用時，是相對的術語，並且是指與所述酶在相同的擴增條件但是不存在酶抑制劑時的活性相比，酶活性的可測量的減少。在某些實施方案中，當與酶抑制劑複合時，通過在存在和不存在酶抑制劑的平行的擴增反應中產生的需要的擴增子的量而確定，所述酶的酶活性減少約40%，約50%,約60%，約70%，約80%,約85%，約90%,約95%,約96%，約97%,約98%,約99%,或大於99%。在某些實施方案中，當所述複合物還包含輔助蛋白、NTP、核苷酸類似物、包含NAD+的物質、或它們的組合時，獲得最佳抑制。當用於本文時，術語"相對應"是指在所述術語涉及的要素之間的至少一種具體的關係。出於舉例說明的目的而不是作為限制，特定引物對的至少一種正向引物對應同一引物對的至少一種反向引物；將至少一種引物設計成與相對應的靶核酸的旁側區域和/或至少一種相對應的擴增子的引物-結合部分退火；連接探針組的第一探針與靶核酸和/或連接位點上遊、以及典型地鄰近連接位點的擴增子退火，並且相對應的第二連接探針與耙核酸和/或連接位點的下遊、以及典型地鄰近連接位點的擴增子退火；在特定的酶抑制劑實施方案中，第一寡核苷酸與相對應的第二寡核苷酸退火，形成包含至少一個雙鏈片段的雙鏈體；等等。當用於本文時，術語"使變性(denaturing)"和"變性(denaturation)"是指這樣的任何過程，其中適當地將雙鏈多核苷酸轉化成兩個單鏈多核苷酸或者單鏈的或基本上單鏈的多核苷酸，所述雙鏈多核苷酸包括但不限於，包括至少一種靶核酸的gDNA片段，雙鏈擴增子，或包括至少一個雙鏈片段的多核苷酸，例如但不限於在第一溫度的酶抑制劑。使雙鏈多核苷酸或酶抑制劑的雙鏈片段變性包括但不限於，各種熱和化學技術，其使得雙鏈核酸或酶抑制劑的雙鏈片段成為單鏈的或基本上單鏈的，例如但不限於，釋放雙鏈多核苷酸或者包含兩個寡核苷酸的雙鏈體的兩個個體單鏈成分。本領域的技術人員應該理解，所用的變性技術通常沒有限制，除非它顯著妨礙後續的擴增反應的退火或酶促步驟，或者在某些方法中，幹擾螢光信號的檢測。當用於本文時，術語"雙鏈的"是指沿著至少它們的長度的部分雜交的一個或兩個核酸鏈。因此，在某些情形中，"雙鏈的"可以指這樣的單一寡核苷酸的部分，即，其可以摺疊，以致所述寡核苷酸的第一區域的至少一個片段與同一寡核苷酸的第三區域的至少一個片段雜交，所述寡核苷酸的第四區域的至少一個片段與所述寡核苷酸的第六區域的至少一個片段雜交，或者二者，由此形成一個或多個雙鏈片段和一個或多個單鏈的部分。因此，單一的核酸鏈可以形成具有雙鏈和單鏈片段的髮夾或莖-環構象(參見，例如，圖l)。類似地，兩個互補的寡核苷酸可以彼此雜交，以形成雙鏈體(參見，例如，圖2)。因此，"雙鏈的"並不意味著核酸必須是完全雙鏈的。相反，雙鏈的核酸可以具有一個或多個單鏈片段和一個或多個雙鏈片段。術語"第一溫度"是指可以形成酶-酶抑制劑複合物的溫度，通常是溫度範圍。術語"第二溫度"是指酶-酶抑制劑複合物解離或不形成的溫度，通常是溫度範圍。本領域的技術人員應該理解，第二溫度典型地處於或者接近所述酶抑制劑的Tm，而第一溫度典型地低於所述酶抑制劑的Tm，以允許所述酶抑制劑呈現包括至少一個雙鏈片段的構象。一種示例性的第一溫度可以是環境溫度或"室溫"。當用於本文時，術語"Tm"參考解鏈溫度應用。解鏈溫度是大量的雙鏈核酸分子半解離成單鏈的溫度。"微觀流體裝置"是一種反應容器，其包括至少一個微通道，所述微通道通常包括l毫米或更小的內部尺寸。微觀流體裝置典型地應用非常小的反應體積，通常在一個或幾個微升(^iL)、毫微升(nanoliter)或兆分之一升(picoliter)的數量級。本領域的技術人員應該理解，微觀流體裝置的大小、形成和組成通常不限於本發明。相反，可以應用任何適當的微觀流體裝置進行所公開的方法的一個或多個步驟。除其它地方之外，示例性的微觀流體裝置及其應用的描述可以特別見於在Fiorini和Chki,BioTechniques(生物技術)38:429-46(2005);Kelly和Woolley,Analyt.Chem.(分析化學)77(5):96A-102A(2005);Cheuk-WaiKan等，Electrophoresis(電泳)25:3564-88(2004);和Yeun等，GenomeRes,(基因組研究)11:405-12(2001)。當用於本文時，術語"小溝結合物"是指匹配雙鏈DNA中的小溝的小分子，有時以序列特異的方式匹配。通常，小溝結合物是長的、平的分子，其可以採用月牙樣的形狀，並且因此貼切地匹配到雙螺旋的小溝中，通常替代水。小溝結合分子典型地包括通過具有扭轉自由度的鍵連接的一些芳香環，例如但不限於，呋喃、苯或吡咯環。"錯誤引發"或"錯誤引發的"，當用於本文時，是指引物或探針與非靶核酸的雜交。如本領域內已知的，引物(不包括隨機引物)通常設計成與側連靶核酸的選擇序列雜交或與擴增子的引物-結合位點雜交，並且設計成引導DNA合成或在所述位點的引物延伸起始。當引物或探針與非靶核酸雜交，這通常在低或減少的嚴格性條件下發生，並且然後作為引物從所述非靶位點延伸的起始點時，可以發生錯誤-引發，產生某些不需要的次級擴增產物的合成。連接探針對和裂解探針對還可以與非靶核酸錯誤退火，這通常在低或減少的嚴格性條件下發生，這還可以導致不需要的擴增產物的形成。術語"不可延伸的核苷酸"，當用於本文時，是指基本上沒有其它核苷酸可以通過聚合酶添加到其上的核苷酸。在一些實施方案中，所述不可延伸的核苷酸是不具有與另一個核苷酸形成磷酸二酯連接的最適官能團的核苷酸類似物。在某些實施方案中，所述不可延伸的核苷酸是本質上不允許引物延伸的鏈-終止核苷酸，例如二脫氧核苷酸(ddNs)，諸如ddA,ddC,ddG,ddl,ddT,和ddU。在一些實施方案中，聚合酶可以將其它核苷酸連接到不可延伸的核苷酸上，但是以緩慢的速率進行。術語"非特異性的"或"背景"，當參考螢光應用時，是指從與雙鏈核酸締合的核酸染料分子而不是需要的擴增子發射的可檢測的信號。需要的擴增子包括靶核酸的擴增產物，在一些實施方案中包括內標或對照序列，所述內標或對照序列可以包含在本發明的特定反應組合物中，特別用於標準化和/或定量目的。因此，由核酸染料分子與假的、次級擴增子的締合產生的螢光信號是非特異性螢光的一個來源，所述假的、次級擴增子通常是錯誤引發、錯誤連接和/或引物二聚體形成的結果。本領域的技術人員應該理解，當本發明的酶抑制劑在第一溫度包括核酸染料分子可以締合的至少一種雙鏈片段時，所述抑制劑的猝滅劑部分可以吸收來自締合的核酸染料，背景的次級來源的可檢測的螢光信號中的至少一些，由此減少所述反應組合物的非特異性螢光。術語"核苷酸鹼基"，有時叫作含氮鹼基或氮雜環鹼基，是指可以作為核苷酸成分的取代的或未取代的一個或多個芳香環。在某些實施方案中，所述一個或多個芳香環包含氮原子。在某些實施方案中，所述核苷酸鹼基能夠與互補的核苷酸鹼基形成沃森-克裡克或Hoogsteen-型氫鍵。示例性的核苷酸鹼基及其類似物包括天然存在的核苷酸鹼基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧徒、5甲基胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶，以及天然存在的核苷酸鹼基的類似物，其包括7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮雜腺嘌呤、N6-A2-異戊烯基腺嘌呤(6iA)、N6-A2-異戊烯基-2-甲硫基腺嘌呤(2ms6iA)、N2-二甲基鳥嘌呤(dmG)、7-甲基鳥嘌呤(7mG)、肌苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黃嘌呤、假尿苷、假胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、2-硫嘧啶、6-硫鳥嘌呤、4-硫胸腺嘧啶、4-硫尿嘧啶、06-甲基鳥嘌呤、N、甲基腺嘌呤、04-甲基胸腺嘧啶、5,6-二氫胸腺嘧啶、5，6-二氫尿嘧啶、吡唑並[3,4-D]嘧啶(參見，例如，美國專利號6，143,877和6,127,121和PCT公布申請WO01/38584)、亞乙烯腺嘌呤、B引哚如硝基吲哚和4-甲基吲哚，和吡咯如硝基吡咯。例如，核苷酸鹼基的非限制性實例可以在Fasman,PracticalHandbookofBiochemistryandMolecularBiology(生物it學禾口分子生物學實踐手冊)，第385-394頁，CRC出版社，BocaRaton,1&.(1989)及其中引用的參考文獻中找到。術語"核苷酸"，當用於本文時，是指核苷的磷酸酯，例如，三磷酸酯，其中最常見的酯化位點是附著在戊糖C-5位置的羥基。術語"核苷酸"還通常用來指一組包括核苷和核苷酸的化合物，除非另外從上下文顯而易見。術語"核苷"，當用於本文時，是指包括連接到糖如核糖、阿拉伯糖、木糖、和吡喃糖以及它們的糖類似物的C-1'碳上的核苷酸鹼基的化合物。所述糖可以是取代的或未取代的。取代的核糖糖包括，但不限於，其中的一個或多個碳原子，例如，2'-碳原子，被一個或多個相同的或不同的，一R，一OR,^"NR2疊氮化物，氰化物或滷素基團取代的那些核糖，其中每個R獨立地是H，d-C6烷基,C2-C7醯基，或Cs-Q4芳基。示例性的核糖包括，但不限於，2'-(Cl-C6)垸氧基核糖，2'-(C5-C14)芳氧基核糖，2，，3，-二脫氫核糖，2，-脫氧-3，-卣核糖，2，-脫氧-3，-氟核糖，2，-脫氧-3，-氯核糖，2，-脫氧-3，-氨基核糖，2'-脫氧-3，-(Cl-C6)烷基核糖，2，-脫氧-3，-((:1《6)垸氧基核糖和2'-脫氧-3，-(C5^C14)芳氧基核糖，核糖，2，-脫氧核糖，2',3，-雙脫氧核糖，2，-滷核糖,2，-氟核糖，2，-氯核糖，和2，-烷基核糖，例如，2，-0-甲基4，普異頭核苷酸，l，-a-異頭核苷酸，2'-4'-和3'-4'-連接的以及其它"鎖定的(locked)"或"LNA",二環糖修飾(參見，例如，PCT公布申請號WO98/22489,WO98/39352,和WO99/14226;和Braasch和Corey,Chem.Biol.(化學生物)8:1-7,2001;和美國專利號6,268，490)。"LNA，，或"鎖定核酸"是這樣的核苷酸類似物，即，其構象被鎖定，以致所述核糖環受到例如但不限於2'-氧和3，-或4，-碳或具有2，-5'主鏈的3'-4'LNA之間的亞甲基連接的限制(參見，例如，Imanishi和Obika,美國專利號6,268,490;和Wengel和Nielsen,美國專利號6,670,461)。由所述連接施加的構象限制通常提高互補序列的結合親和性，並且提高這樣的雙鏈體的熱穩定性。在多核苷酸內的示例性LNA糖類似物包括下述結構:formulaseeoriginaldocumentpage272'-4'D-形式LNA2，-4'L-形式LNA1'R,3'S,4'Rl'R,3'R,4'Sformulaseeoriginaldocumentpage273'-4'D-形式LNA3'-4'L-形式LNA1'R，3'S，4'R1'S,3'R,4'S其中B是任何核苷酸鹼基。核糖的2'-或3'-位置可以被修飾，以包括氫、羥基、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、甲氧基乙基、垸氧基、苯氧基、疊氮基、氰基、醯氨基、亞氨基、氨基、垸基氨基、氟、氯和溴。核苷酸包括天然D光學異構體，以及L光學異構體形式(參見，例如，Garbesi等,Nucl.AcidsRes.(核酸研究)21:4159-65(1993);Fujimori等，J.Amer.Chem.Soc.(美國化學學會雜誌)112:7436-38(1990);Urata等，Nucl.AcidsSymposium(核酸研討會)系列號29:69-70(1993))。當核苷酸鹼基是嘌呤，例如A或G時，核糖糖附著到所述核苷酸鹼基的N、位置上。當核苷酸鹼基是嘧啶，例如C、T或U時，戊糖糖附著到所述核苷酸鹼基的N、位置上，除了假尿苷外，其中戊糖糖附著到尿嘧啶核苷酸鹼基的C5位置上(參見，例如，Kornberg和Baker,DNAReplication(DNA複製)，第2版.(1992)，Freeman,SanFrancisco,CA)。核苷酸的一個或多個戊糖碳可以用具有下式的磷酸酯取代formulaseeoriginaldocumentpage28其中a是從0到4的整數。在某些實施方案中，a是2，並且所述磷酸酯附著到戊糖的3'-或5，-碳上。在某些實施方案中，所述核苷酸是其中所述核苷酸鹼基是嘌呤、7-脫氮嘌呤、嘧啶或它們的類似物的那些。術語"核苷酸5'-三磷酸"是指在5，位置具有三磷酸酯基團的核苷酸，並且有時表示為"rNTP",或"dNTP"和"ddNTP"，以特別指出所述核糖糖的結構特徵，或者一般表示為"NTP"。三磷酸酯基團可以包括用硫取代多個氧，例如，a-硫-核苷酸5，-三磷酸。除其它地方之外，核苷酸化學的綜述可以特別在Miller,BioconjugateChem.(生物綴合物化學)1:187-91(1990);Shabarova,Z.禾口Bogdanov,A.AdvancedOrganicChemistryofNucleicAcids(核酸高級有機化學)，VCH，紐約(1994);和NucleicAcidsinChemistryandBiology(化學和生物中的核酸)，第2版，Blackburn和Gait，編，牛津大學出版(1996;以下為"Blackbum和Gait")中找到。術語"核苷酸類似物"是指合成的類似物，其具有修飾的核苷酸鹼基部分、修飾的戊糖部分、和/或修飾的磷酸部分，並且在多核苷酸的情形中，修飾的核苷酸之間的連接，如通常在本文和其它地方所描述的(例如，Scheit，NucleotideAnalogs(核苷酸類似物),JohnWiley，紐約，1980;Englisch,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.30:613-29，1991;Agarwal,ProtocolsforPolynucleotidesandAnalogs(多核苷酸和類似物的方法)，Humana出版社，1994;和S.Verma和F.Eckstein,Ann.Rev.Biochem.(生物化學綜述年刊)67:99-134,1998)。通常，修飾的磷酸酯部分包括磷酸的類似物，其中磷原子處於+5氧化狀態，並且一個或多個氧原子用非氧部分取代，例如但不限於，硫。磷酸酯類似物的一些非限制性實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酉旨、硒f^石粦酸酉旨、二硒4戈磷酸酉旨、phosphoroanilothioate、phosphomnilidate、氨基磷酸酯、二羥硼基磷酸酯，包括締合的抗衡離子，例如，H^NH4+,Na+,如果這樣的抗衡離子存在的話。修飾的核苷酸鹼基部分的非限制性實例包括5-甲基胞嘧啶(5mC);C-5-丙炔基類似物，包括但不限於，C-5丙炔基-C和C-5丙炔基-U;2,6-二氨基嘌呤，也叫作2-氨基腺嘌呤或2-氨基-dA;次黃嘌呤，假尿苷，2-硫代嘧啶，異胞嘧啶(異C)，5-甲基異C,和異鳥嘌呤(異G;參見，例如，美國專利號5，432，272)。修飾的戊糖部分的非限制性實例包括LNA類似物，其包括但不限於Bz-A-LNA，5-Me-Bz-C-LNA,dmf-G-LNA，和T國LNA(參見，例如，TheGlenReport(Glen報導)，16(2):5(2003);Koshkin等，Tetrahedron(四面體)54:3607-30(1998》，禾口2，-或3，-修飾，其中所述2'-或3，-位置是氫、羥基、烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基和戊氧基)、疊氮基、氨基、烷氨基、氟、氯或溴。修飾的核苷酸間連接包括磷酸酯類似物、具有非手性和不帶電荷的亞基間連接的類似物(例如，Sterchak,E.P.等，OrganicChem.(有機化學)52:4202(1987))，和具有非手性亞基間連接的不帶電荷的嗎啉代基聚合物(參見，例如，美國專利號5,034,506)。核苷酸間連接類似物的一些非限制性實例包括morpholidate，乙縮醛和聚醯胺-連接的雜環。在一類叫作肽核酸的核苷酸類似物中，包括但不限於假互補性肽核酸(籠統地"PNA")，常規的糖和核苷酸間連接已被2-氨基乙基甘氨酸醯胺主鏈聚合物取代(參見，例如，Nielsen等，Science(科學),254:1497-1500(1991);Egholm等，J.Am.Chem.Soc.(美國化學學會雜誌)，114:1895-1897(1992);Demidov等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美國國家科學院學報)99:5953-58(2002);PeptideNucleicAcids:ProtocolsandApplications(月太核酸方去禾口應用)，Nielsen,編，Horizon生物科學(2004))。用於酶結合或化學合成的寬範圍的核苷酸類似物可以用作三磷酸酯、氨基磷酸酯或CPG衍生物，除了其它來源外，其特別來自Glen研究，Sterling,MD;LinkTechnologies(連接技術),Lanarkshire,Scotland,英國；和TriLinkBioTechnologies(三連接生物技術),SanDiego,CA。除了其它地方外，關於寡核苷酸合成和某些核苷酸類似物的描述可以特別在S.Verma和F.Eckstein,Ann.Rev.Biochern.(生物化學綜述年刊)67:99-134(1999);Goodchild,Bioconj.Chem.(生物綴合物化學)1:165-87(1990);CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry(現代核酸化學方法)，Beaucage等，編，JohnWiley和Sons，紐約，紐約，包括從2005年8月以來的更新(以下"Beaucage等")；以及Blackbum和Gait中找到。當用於本文時，術語"引物-結合位點"是指多核苷酸序列、典型地靶核酸和/或擴增子的這樣的區域，即，其可以直接或者利用其補體作為引物可以在其上退火的模板，以用於本領域已知的任何適當的引物延伸反應，例如但不限於PCR。本領域的技術人員應該理解，當在單一多核苷酸上存在兩個引物-結合位點時，所述兩個引物-結合位點的方向通常是不同的。例如，引物對中的一個引物與第一引物-結合位點互補，並且可以與之雜交，而所述引物對的相對應的引物被設計成與第二引物-結合位點的補體雜交。換言之，在一些實施方案中，第一引物-結合位點可以是有義方向，並且第二引物-結合位點可以是反義方向。擴增子的引物-結合位點可以，但不必需包括與靶旁側序列或其補體的相同的序列或所述序列的至少一些。本領域的技術人員明白，當靶核酸和/或擴增產物通過特定的擴增方式擴增時，引物-結合位點的補體在互補擴增子或所述擴增子的互補鏈中合成。因此，應該理解，當用於本文時，引物-結合位點的補體清楚地包含在術語引物-結合位點的指定的意思之內。當用於本文時，術語"探針-結合位點"是指多核苷酸序列、典型地靶核酸和/或擴增子的這樣的區域，即，其可以直接或者利用其補體作為探針可以在其上退火的模板。本領域的技術人員應該理解，用於連接探針對的探針-結合位點包括上遊探針-結合位點和下遊探針結合位點，並且這兩個位點典型地彼此鄰近。在某些實施方案中，上遊連接探針-結合位點和下遊探針結合位點沒有彼此鄰近，並且擴增步驟可以包括填補缺口的反應。本領域的技術人員還應該理解，裂解探針對的探針-結合位點包括上遊探針-結合位點，其鄰近，並且可以但不必需與下遊裂解探針-結合位點的至少部分重疊。本領域的技術人員明白，當靶核酸和/或擴增產物通過特定的擴增方式擴增時，探針-結合位點的補體在互補擴增子或所述擴增子的互補鏈中合成。因此，應該理解，當用於本文時，探針-結合位點的補體清楚地包含在術語探針-結合位點的指定意思之內。當用於本文時，術語"多核苷酸"、"寡核苷酸"和"核酸"可以互換地應用，並且是指核苷酸單體的單鏈的和雙鏈的聚合物，其包括但不限於，通過核苷酸間磷酸二酯鍵，或核苷酸間類似物，以及締合的抗衡離子如tf、NH4+、三烷基銨、Mg2+、Na+等連接的2，-脫氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。多核苷酸可以完全由脫氧核糖核苷酸、完整核糖核苷酸、或它們的嵌合的混合物組成，並且可以包括核苷酸類似物。核苷酸單體單位可以包括本文所述的任何核苷酸，其包括，但不限於，核苷酸和/或核苷酸類似物。多核苷酸在大小上典型地從幾個單體單位，例如5-40個，當它們有時在本領域中叫作寡核苷酸時，到數千個單體核苷酸單位的範圍。除非另外指明，當表示多核苷酸序列時，應該理解，所述核苷酸是在從左到右的5'到3'順序，並且"A"表示脫氧腺苷，"C"表示脫氧胞嘧啶,"G"表示脫氧鳥苷，"T"表示胸苷，並且"ir表示脫氧尿苷，除非另外指明。當用於本文時，術語"猝滅劑"是指吸收至少一些螢光發射的強度的部分。猝滅劑可以分類成螢光猝滅劑和黑暗猝滅劑(darkquenchers)(有時還叫作非螢光猝滅劑)。螢光猝滅劑是一種部分，典型地是螢光團，其可以吸收從在第一波長的螢光源，例如，但不限於，與核酸的雙鏈片段締合的核酸染料，發射的螢光信號，並且在吸收足夠的螢光能量後，所述螢光猝滅劑可以發射在第二波長的螢光，其是所述猝滅劑特有的，一種叫作"螢光共振能量轉移"或FRET的方法。例如但不作為限制，與TAMRA螢光猝滅劑締合的FAM螢光團可以在492nm，FAM的激發峰，發光，並且在580nm，TAMRA的發射峰，發射螢光。適當地與螢光源配對的黑暗猝滅劑吸收來自所述光源的螢光能量，但是本身不發螢光。相反，黑暗猝滅劑消耗所吸收的能量，典型地作為熱量。在某些實施方案中，黑暗猝滅劑包括發光團，其作用為從螢光源如與本發明的酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料的能量轉移受體，但是其本身不發射可檢測的螢光信號。黑暗或非螢光猝滅劑的非限制性實例包括DABCYL(4-(4'-二甲基氨基苯基偶氮)磺酸);黑洞猝滅劑系列猝滅劑，例如但不限於，BHQ-l,BHQ-2,禾口BHQ-3;IowaBlack;QSY系列猝滅齊iJ,例如但不限於，QSY-7;完全猝滅劑；遮蔽非螢光猝滅劑；納米晶體，例如但不限於，量子點；金屬如金納米顆粒；等等。當用於本文時，術語"反應容器"通常是指任何容器、室、裝置或組件，按照本發明在其中可以發生反應。在一些實施方案中，反應容器可以是微管，例如但不限於，0.2mL或0.5mL的反應管，如MicroAmp⑧光學管(應用生物系統(AppliedBiosystems))或微離心管，或其它在分子生物學實驗室常規應用的此類容器。在一些實施方案中，反應容器包括多孔平板的孔，載玻片上的點，或微觀流體裝置的通道或室，包括但不限於應用生物系統TaqMan低密度陣列(AppliedBiosystemsTaqManLowDensityArray)。例如但不作為限制，多個反應容器可以置於同一支持物上。在一些實施方案中，在晶片上的實驗室(lab-on-a-chip)樣的裝置，例如可從Caliper和Fluidgm獲得，可以在公開的方法中作為反應容器。應該認識到，許多反應容器是可以商購的，或者可以設計用於本發明的情形中。術語"報導基團"在本文以廣義應用，並且是指任何可鑑定標記、標誌或部分。術語"小RNA分子"在本文以廣義應用，並且是指任何核酸序列，其包含不編碼的核糖核苷酸，並且典型地具有下列長度150個核苷酸或更少，IOO個核苷酸或更少，75個核苷酸或更少，30個核苷酸或更少，在19和27個核苷酸之間，並且在21和23個核苷酸之間。小RNA分子可以是單鏈的，雙鏈的，或者可以包括至少一個單鏈區域和至少一個雙鏈區域，雙鏈區域包括但不限於莖-環或髮夾結構。小RNA分子的非限制性實例包括不翻譯的功能RNA,非編碼的RNA(ncRNA)，小的非信使RNA(snmRNA)，小幹擾RNA(siRNA)，tRNA，小的非編碼RNA(tncRNA)，小的調節RNA(smRNA)，snoRNA，stRNA，snRNA，微小RNA(miRNA)，其包括但不限於miRNA前體如初始miRNA(pri-miRNA)和前體miRNA(pre-miRNA)，以及小幹擾RNA(siRNA)(參見，例如，Eddy,NatureReviewsGenetics(自然遺傳學綜述)2:919-29(2001);Storz,Science(科學)296:1260-63(2002);Buckingham,HorizonSymposia:UnderstandingtheRNAissance:l-3(2003))。在某些實施方案中，靶核酸包括小RNA分子。當用於本說明書時，包括核糖核苷酸和/或核糖核苷酸類似物的本發明的這些酶抑制劑清楚地從術語小RNA分子的目的範圍排除。術語"熱穩定"，當參考酶應用時，表示在升高的溫度，例如但不限於，在約55。C或更高，所述酶是功能性的或有活性的(即，可以進行催化作用)。可以適用於本發明的熱穩定的酶可從許多供應商處商購，其包括但不限於，應用生物系統(AppliedBiosystems)(FosterCity,CA),普洛麥格(Promega)(Madison,WI),Stratagene(LaJolla,CA)，和紐英倫生物實驗室(NewEnglandBioLabs)(Beverly,MA)。本領域的技術人員應該理解，熱穩定的酶可以從各種嗜熱性/或超嗜熱性生物體分離，所述嗜熱性和/或超嗜熱性生物體例如但不限於，某些真細菌和古細菌物種，其包括但不限於，感染這樣的生物體的某些病毒，並且這樣的熱穩定酶可以適用於本發明公開的複合物、方法和試劑盒。術語"通用鹼基"或"通用核苷酸"通常在本文可互換使用，並且是指可以取代多核苷酸中的多於一種的天然存在的核苷酸的核苷酸類似物，其包括但不限於，酶抑制劑。通用鹼基典型地包含可以包含或可以不包含氮原子的芳香環部分，並且通常應用芳香環堆積來穩定雙鏈體。在某些實施方案中，通用鹼基可以共價附著到戊糖糖的C-1'碳上，以形成通用核苷酸。在某些實施方案中，通用鹼基沒有特異性與另一種核苷酸鹼基氫鍵鍵合。在某些實施方案中，核苷酸鹼基可以通過疏水堆積而與同一核酸鏈上的鄰近核苷酸鹼基相互作用。通用核苷酸和通用鹼基的非限制性實例包括脫氧-7-氮雜剛哚三磷酸酯(d7AITP),脫氧異喹諾酮三磷酸酯(dICSTP)，脫氧丙炔基異喹諾酮三磷酸酯(dPICSTP)，脫氧甲基-7-氮雜吲哚三磷酸酯(dM7AITP),脫氧ImPy三磷酸酯(dlmPyTP),脫氧PP三磷酸酯(dPPTP)，脫氧丙炔基-7-氮雜吲哚三磷酸酯(dP7AITP),3-甲基異喹諾酮(MICS),5-甲基異二價碳基(5MICS)，咪唑-4-羧醯胺(carboxamide)，3-硝基吡咯，5-硝基吲哚，次黃嘌呤，肌苷，脫氧肌苷，5-氟脫氧尿苷，4-硝基苯並咪唑，以及某些PNA-鹼基，其包括但不限於某些假互補的PNA(pcPNA)鹼基。除了其它地方之外，通用鹼基的描述可以在Loakes,Nucl.AcidsRes.(核酸研究)29:2437-47(2001);Berger等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)28:2911-14(2000);Loakes等，J.Mol.Biol.(分子生物學雜誌)270:426-35(1997);Verma和Eckstein,Ann.Rev.Biochem.(生物化學綜述年刊)67:99-134(1998);公布的PCT申請號US02/33619,以及Patron和Pervin,美國專利號6,433,134中找到。當兩個不同的寡核苷酸與同一線性互補核酸的不同區域退火，並且一個寡核苷酸的3，-端朝向或者相對另一個寡核苷酸的5，-端時，前者可以叫作"上遊"寡核苷酸，並且後者叫作"下遊"寡核苷酸。某些示例性成分術語"裂解酶"是指這樣的任何多肽，即，當與核酸裂解結構(有時叫作重疊突出(flap)結構或侵入性裂解反應底物)組合併且在適當的條件下時，其可以將下遊裂解探針的非退火突出部分裂解，以產生包含可連接的缺口的結構。裂解酶的非限制性實例包括結構-特異的核酸酶，例如但不限於，來自細菌和噬菌體的某些DNA聚合酶，包括其分離的5，核酸外切酶結構域；Cleavase⑧酶(ThirdWaveTechnologies,Inc.(第三波技術公司)，Madison，WI);真核突出核酸內切酶；和古細菌突出核酸內切酶(參見，例如，Lyamichev等，Science(科學)260:778-83(1993);L傳,J.Biol.Chem.(生物的化學雜誌)270:22109-12(1995);Wu等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)24:2036-43(1996);Hosfidd等,J.Biol,Chem.(生物的化學雜誌)273:27154-61(1998);Kaiser等,J.Biol.Chem.(生物的化學雜誌)274:21387-94(1999);Allawi等，J.Mol.Biol.(分子生物學雜誌)328:537-54(2003);以及美國專利號5，614,402和6,706，471)。核酸裂解結構典型地包括與裂解探針對雜交的模板鏈(通常是靶核酸，單鏈擴增子，或雙鏈擴增子的分開的鏈)，所述裂解探針對包括兩個重疊的探針，其與所述模板鏈雜交形成"突出"。第一或上遊裂解探針包括與所述模板鏈的第一部分互補的序列，並且與第二或下遊裂解探針的模板-互補序列的5'-端重疊，所述第二或下遊裂解探針包括(1)與鄰近所述模板鏈的第一部分的模板鏈的第二部分互補的序列，和(2)含有至少一個可以或可以不與所述模板鏈互補的核苷酸的5'-區域，但是當與所述模板鏈雜交時，所述區域被上遊裂解探針的3'-端置換(參見，例如，Lyamichev等,Nat.Biotechnol.(自然生物技術)17:292-96(1999),特別是圖l;Neville等，BioTechniques(生物技術)32:S34-43(2002),特別是圖2A;Allawi等，J.Mol.Biol.(分子生物學雜誌)328:537-54(2003),特別是圖2;以及Brow等,美國專利號6，706，471，例如在圖32和65)。將本發明的某些裂解酶抑制劑設計成在第一溫度採取類似於或模擬核酸裂解結構的構象。某些公開的裂解酶抑制劑可以在第一溫度形成核酸裂解結構，但是至少一種寡核苷酸包括至少一種核苷酸類似物和/或至少一種不能被所述裂解酶裂解或被所述裂解酶緩慢裂解的核苷酸間連接("不可裂解的核苷酸間連接")。不可裂解的核苷酸間連接的非限制性實例包括硫代磷酸酯，其包括但不限於二硫代磷酸酯；甲基磷酸酯；氨基磷酸酯；和硼代磷酸酯(boranophosphates)。"連接酶"是一種這樣的多肽，即，在適當條件下，其催化在相鄰雜交的探針的3'-OH和5'-磷酸之間形成磷酸二酯鍵，所述雜交的探針包括但不限於，連接探針組的第一和第二連接探針，或者第一可裂解探針和已經被裂解酶裂解的第二裂解探針的雜交的片段。溫度敏感性連接酶，包括但不限於，噬菌體T4連接酶和大腸桿菌連接酶。熱穩定性連接酶的非限制性實例包括4A連接酶，7^連接酶，W連接酶，M/Z2連接酶，7狄連接酶，rAHB8連接酶，7^連接酶，棲熱菌屬(772mww)物種AK16D連接酶，^e連接酶，Z/g7x連接酶，Aae連接酶，7w連接酶，和戶/w連接酶(參見，例如，Housby等.，Nuc.AcidsRes.(核酸研究)28:el0，2000;Tong等，Nud.AcidsRes.(核酸研究)28:1447-54,2000;Nakatani等，Eur.J.Biochem.(歐洲生物化學雜誌)269:650-56,2002;禾口Sriskanda等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)11:2221-28，2000)。熟練的技術人員應該理解，可以從嗜溫性、嗜熱性或超嗜熱性生物體獲得許多嗜溫的、熱穩定的和/或超嗜熱的連接酶，包括DNA連接酶和RNA連接酶，所述嗜溫的、嗜熱的或超嗜熱的生物體例如，某些真細菌和古細菌物種，並且包括感染這樣的嗜溫性、嗜熱性或超嗜熱性生物體的某些病毒；並且這樣的連接酶可以適用於本發明公開的複合物、方法和試劑盒。當用於本文時，術語"核酸染料"是指這樣的螢光分子，即，其對雙鏈多核苷酸特異，並且當與雙鏈多核苷酸締合時，其至少表現出比與單鏈多核苷酸締合基本上更高的螢光增強。典型的核酸染料分子通過嵌入到雙鏈片段的鹼基對之間，通過與雙鏈片段的大溝或小溝結合，或者二者，而與多核苷酸的雙鏈片段締合。核酸染料的非限制性實例包括溴化乙錠，DAPI，Hoechst衍生物，其包括但不限於Hoechst33258和Hoechst33342，嵌入劑，其包括鑭系元素螯合物(例如但不限於，攜帶兩個螢光四配位基的P-二酮-Eu3+螯合物(NDI(BHHCT-Eu3+)2)，參見，例如，Nojima等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)增刊No.1,105-06(2001))，溴化乙錠，和某些不對稱的花青染料，如SYBRGreen,PicoGreen,禾口BOXTO。某些公開的酶抑制劑的核酸序列包括適體。適體以高特異性、構象-依賴性方式，典型地以非常高的親和力，而結合靶分子，儘管本領域的技術人員應該理解，如果需要，可以選擇具有更低結合親和力的適體。已經表明適體基於非常小的結構差別如存在或不存在甲基或羥基基團而區分靶，並且某些適體可以區分D-和L-對映體。已經獲得結合小分子耙的適體，所述小分子靶包括藥物、金屬離子、和有機染料、肽、生物素和蛋白質，所述適體包括但不限於鏈黴抗生物素蛋白，VEGF，病毒蛋白和各種酶類，其包括但不限於DNA-依賴性DNA聚合酶，RNA-依賴性DNA聚合酶.RNA-依賴性RNA聚合酶、解旋酶和蛋白酶(參見，例如，Lin和Jayasena，J.Mol.Biol.(分子生物學雜誌)271:100-11(1997);Thomas等，J,Biol.Chem.(生物的化學雜誌)272:27980-86(1997);Kulbachinskiy等，Eur.J.Biochem.(歐洲生物化學雜誌)271:4921-31(2004);Hannoush等，Chembiochem.(化學生物化學)5:527-33(2004);Bellecave等，Oligonucleotides(寡核苷酸)13:455-63(2003);和Nishikawa等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)31:1935-43(2003))。已經表明在生物素醯化、螢光素標記後，並且當附著到玻璃表面和微球體上時，適體保留功能活性。適體，包括speigelmers，通過體外選擇方法鑑定，例如但不限於已知為通過指數富集配體的系統進化技術(SELEX)的方法進行鑑定。在所述SELEX方法中，非常大的組合寡核苷酸文庫，例如1014到1015個個體序列，通常如60-100個核苷酸長度那樣大，常規通過體外選擇和擴增的重複方法而進行篩選。大部分靶在8-15個循環內親和富集，並且所述方法已經自動化允許更快的適體分離。熟練的技術人員應該理解，適體可以按照常規方法獲得，並且無需過度實驗。除了其它地方之外，適體以及它們的選擇的描述可以在L.Gold,J,Biol.Chem.(生物的化學雜誌),270(23):13581-84(1995);L.Gold等，Ann.Rev.Biochem.(生物化學綜述年刊)64:763-97(1995);Wilson和Szostak,Ann.Rev.Biochem.(生物化學綜述年刊)68:611-47(1999);Cox等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)30:el08(2002);Hermann和Patel,Science(科學)287:820-25(2000);Vuyisich和Beal，Chem.&Biol.(化學和生物)9:907-13(2002);S.Jayasena,Clin.Chem.(臨床化學)，45:1628-50(1999);Cox和Ellington，Bioorg,Med.Chem.(生物有機和醫學化學)9:2525-31(2001);Eulberg等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)33:e5(2005);以及Jayasena和Gold,美國專利號6，183,967中找到。術語"DNA聚合酶"在本文中以廣義應用，並且是指可以以模板-依賴性方式通過加入脫氧核糖核苷酸和/或某些核苷酸類似物而催化雜交的引物的5'-3'延伸的任何多肽。例如但不限於，在引物延伸反應過程中，向與核酸模板退火的引物的3'-端順序添加脫氧核糖核苷酸。DNA聚合酶的非限制性實例包括RNA-依賴性DNA聚合酶，其包括但不限於反轉錄酶，以及DNA-依賴性DNA聚合酶。應該理解，某些DNA聚合酶(例如但不限於某些A型真細菌DNA聚合酶和r^DNA聚合酶)還可以包括結構-特異性核酸酶活性，並且當擴增反應包括侵入性裂解反應，例如但不限於，FEN-LCR或PCR-FEN(參見，例如，Bi等，美國專利號6,511,810;和Neville等，BioTechniques(生物技術)32:S34-43(2002))時，其中所述裂解酶包括DNA聚合酶，在侵入性裂解的情形中，這樣的聚合酶在本文中叫作裂解酶，並且對應的酶活性包括結構-特異性的寡核苷酸裂解。在某些實施方案中，DNA聚合酶提供多聚化活性和結構-特異性裂解活性。術語"RNA聚合酶"是指DNA-依賴性RNA聚合酶或RNA-依賴性聚合酶(有時叫作RNA複製酶)，並且包括可以以模板-依賴性方式催化核糖核苷酸的5'-3'添加的任何多肽。在某些實施方案中，RNA聚合酶與啟動子序列結合，並且催化轉錄。RNA聚合酶的非限制性實例包括來自噬菌體T3，T7，SP6,f2,MS2,和Qp的RNA聚合酶。術語"引物"是指多核苷酸，通常是包含典型地約12到約35個核苷酸長的"靶"結合部分的寡核苷酸，其被設計成在適當的嚴格條件下，選擇性地雜交靶核酸旁側序列或擴增產物的相對應的引物-結合位點；並且作為從模板的3，-端合成與相對應的多核苷酸模板互補的核苷酸序列的起始點。術語"正向"和"反向"，當參考引物對的引物應用時，指示所述引物在多核苷酸序列上的相對方向。出於舉例說明的目的，而不是作為限制，考慮水平從左到右方向繪製的單鏈多核苷酸，其5，-端在左側。所述"反向"引物設計成與位於或接近這一以5'到3'方向的示例性多核苷酸的"3'-端"的下遊引物-結合位點退火，從右到左。相對應的"正向"引物設計成與位於或接近以5'到3，"正向"方向的多核苷酸的"5，-端"的上遊引物-結合位點的補體退火，從左到右。因此，所述反向引物包括與多核苷酸的反向或下遊引物-結合位點互補的序列，並且所述正向引物包括與正向或上遊引物-結合位點相同或基本上相同的序列。應該理解，在本段中所用的術語"3，-端"和"5'-端"只是舉例說明性的，並不必按字面意思是指多核苷酸的每一端。相反，唯一的限制是這一示例性引物對的反向引物與位於正向引物-結合位點的下遊的反向引物-結合位點退火，其包括與相對應的正向引物的"靶"結合部分相同的序列或基本上相同的序列。本領域的普通技術人員應該認識到，這些術語並不意欲是限制，而是在給出的實施方案中提供舉例說明的方向。本發明的"引物對"包括正向引物和相對應的反向引物。所述正向引物包括第一靶-特異性部分，其包括與第一或上遊靶旁側序列的核苷酸序列相同或基本上相同的序列，並且其被設計成與特別存在於反向擴增產物中的上遊耙旁側序列的補體選擇性地雜交。引物對的反向引物包括第二靶-特異性部分，其包括與特別存在於正向擴增產物中的第二或下遊靶區域旁側序列互補或基本上互補的序列，並且所述序列設計成與特別存在於正向擴增產物中的第二或下遊靶區域旁側序列選擇性地雜交。在某些實施方案中，正向引物、反向引物、或引物對的正向引物和反向引物還包括報導探針結合位點，通用引物-結合位點，和/或報導基團，例如但不限於螢光報導基團。在一些實施方案中，測序引物包括螢光報導基團。在某些實施方案中，引物對的正向引物和相對應的反向引物具有不同的解鏈溫度，以允許進行基於溫度的不對稱PCR。按照本發明的某些實施方案可以使用通用引物或引物組。在某些實施方案中，通用引物或通用引物組雜交並且可以用來擴增兩種或多種不同的靶核酸種類和/或兩種或多種不同種類的需要的擴增子。術語"探針"是指這樣的多核苷酸，即，其包括設計成以序列-特異性方式與在特定的核酸序列上，例如但不限於靶核酸或擴增產物的互補探針-結合位點雜交的部分。在某些實施方案中，將連接探針組的相應的探針連接在一起形成連接的探針。在一些實施方案中，裂解探針組中的相應的探針與模板鏈退火，形成核酸裂解結構，其在適當的條件下可以被適當的裂解酶裂解，以形成包括模板鏈、上遊裂解探針和第二裂解探針的雜交的片段的雜交結構。在某些實施方案中，所退火的上遊裂解探針和下遊裂解探針的雜交的片段連接在一起，形成連接的探針。在某些實施方案中，探針包括報導基團，例如但不限於，報導探針。在一些實施方案中，探針包括引物-結合位點。本發明的探針和引物的序列4寺異性部分長度足夠長，以允許與靶核酸和需要的擴增子中的互補序列特異性退火。除了其它地方之外，引物和探針設計的詳細描述可以在Dieffenbach和Dveksler，PCRPrimer,ALaboratoryManual(PCR弓I物，實驗室手冊)，ColdSpringHarborPress(冷泉港出版社)(1995;以下為"PCRPrimer(PCR引物)");R.Rapley,TheNucleicAcidProtocolsHandbook(核酸方法手冊)(2000),Humana出版社，Totowa,NewJersey(以下為"Rapley");Schena;和Kwok等，Nucl.AcidRes.(核酸研究)18:999-1005(19卯)中找到。引物和探針設計軟體程序也是可以商購獲得的，包括但不限於，PrimerExpress,AppliedBiosystems(應用生物系統)，FosterCity,CA;PrimerPremierandBeacon設計軟體，PREMIERBiosoftInternational(國際PREMIER生物軟體)，PaloAlto,CA;PrimerDesigner4,Sci-Ed軟體，Durham,NC;PrimerDetective(引物檢測)，ClonTech,PaloAlto，CA;Lasergene，DNASTAR,公司，Madison，WI;Oligo軟體，NationalBiosciences,Inc.(國家生物科學公司)，Plymouth,MN;iOligo,Caesar軟體,Portsmouth,NH;禾Q在全球資訊網reattimeprimerdatabase.ht,st或在medgen31.urgent.be/primerdatabase/index(還參見，Pattyn等，Nucl.AcidRes.(核酸研究)31:122-23(2003))的RTPrimerDB。熟練的技術人員應該理解，所公開的探針和引物的補體、靶核酸、需要的擴增子或它們的組合，可以用於本發明的某些實施方案中。例如，但不限於，基因組DNA樣品可以包括靶核酸序列及其補體。因此，在某些實施方案中，當將基因組樣品變性時，所述靶核酸及其補體都以單鏈序列存在於樣品中。在某些實施方案中，引物、連接探針對、裂解探針對或它們的組合可以設計成選擇性地雜交適當的序列，所述適當的序列包括但不限於，靶核酸、所述靶核酸的補體、擴增子和/或擴增子的補體。術語"報導探針"是指這樣的核苷酸和/或核苷酸類似物的序列，艮卩，其與靶核酸和/或擴增子退火，並且當檢測，包括但不限於強度或發射的波長的變化時，其在終點或實時檢測技術例如但不限於Q-PCR技術中用於鑑定和/或定量相對應的耙核酸。大部分報導探針可以基於它們作用模式分類，例如但不限於核酸酶探針，其包括但不限於TaqMan⑧探針(參見，例如，Livak,GeneticAnalysis:BiomolecularEngineering(遺傳分析生物分子加工)14:143-149(1999);Yeung等，BioTechniques(生物技術)36:266-75(2004》;延伸探針，如蠍子引物，LuxTm引物，Amplifl畫，等等；雜交探針，如分子beacons，Edipse探針，照亮(lightup)探針，單一標記的報導探針對，雜交探針對，等；或它們的組合。在某些實施方案中，報導探針包括PNA,LNA,通用鹼基或它們的組合，並且可以包括莖-環和無莖的報導探針構型。某些報導探針是單一標記的，而另一些報導探針是雙標記的。在鄰近雜交的探針之間包括FRET的雙探針系統在術語報導探針的目的範圍內(參見，例如，Zhang等,H印atology(肝臟病學)36:723-28(2003))。"不對稱的花青染料(unsymmetricalcyaninedye)"，在本領域中有時描述為不對稱的花青染料(asymmetriccyaninedye)或不對稱花青染料(asymmetricalcyaninedye)，是指具有通式R2N[CH-CH]nCH-NR2的染料分子，其中n是小的數字，並且R基團典型地包括至少一個吲哚基團和至少一個喹啉基團或至少一個吡啶基團。不對稱花青染料的非限制性實例包括[2-[AK3-二甲基氨基丙基)-iV-丙基氨基]-4-[2,3-二氫-3-甲基-(苯並-l,3-噻唑-2-基)-亞甲基]-1-苯基-喹啉鑰](SYBRGreen),[2-[7V-雙-(3-二甲基氨基丙基)-氨基)-氨基]-4-[2,3-二氫-3-甲基-(苯並-1,3-噻唑-2-基)-亞甲基]-1-苯基-喹啉鎗](PicoGreen),4-[(3-甲基-6-(苯並噻唑-2-基)-2,3-二氫-(苯並-l,3-噻唑)-2-亞甲基)]-l-甲基吡啶鑰碘化物(BEBO)，BOXTO,禾卩BETO。除了其它地方之外，不對稱花青染料的描述可以在Karlsson等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)31:6227-34(2003);Zipper等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)32:el03(2004);Bengtsson等,Nud.AcidsRes.(核酸研究)31:e45(2003);和Goransson等，Asymettriccyaninedyes(不對稱的花青染料)，DNATechnology(DNA技術)2005,Chalmers技術大學(2005;可獲自全球資訊網:molbiotech.Chalmers.se/research/mk/Asymmetric%cyanine%o^/7a);蟲，其包括但不限於秀麗隱杆線蟲(C.e/egmw);植物，其包括但不限於擬南芥"raZ)Wo戸&);以及動物，其包括但不限於人、小鼠、家畜或非人靈長類；並且包括原核細胞以及從真核生物獲得的細胞、組織和器官，其例如但不限於臨床活組織切片材料、口腔拭子、培養的細胞和血細胞。病毒核酸也在本發明的範圍之內。在某些實施方案中，所述靶核酸可以以雙鏈或單鏈形式存在。熟練的技術人員應該理解，gDNA不但包括全長物質，而且包括通過許多方法例如但不限於酶消化、超聲、剪切力等而產生的片段，並且所有這樣的物質，不管是全長的還是片段的，都代表可以作為本發明的擴增反應的模板的gDNA的形式。靶核酸可以是合成的或天然存在的。在適當的情形中，包含旁側序列的特定的靶核酸可以使用本領域公知的寡核苷酸合成方法而合成。除了其它地方之外，這樣的技術的詳細描述可以在Beaucage;和Blackburn與Gait中找到。用於合成靶核酸以及其它寡核苷酸，包括但不限於某些酶抑制劑、探針和引物的自動化DNA合成儀可以從許多來源商購獲得，例如，包括應用生物系統DNA合成儀381A，391,392和394型(AppliedBiosystems(應用生物系統)，FosterCity，CA)。靶核酸，在適當的情形中，其包括旁側區域，以及其它寡核苷酸還可以使用本領域公知的體內方法和/或體外方法而生物合成產生。除了其它地方以外，這樣的技術的描述可以在Sambrook等，MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆，實驗室手冊)，冷泉港出版社(1989)(以下為"Sambrook等，，)；和Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology(現代分子生物學方法)，JohnWiley和Sons，公司，包括2005年9月26日的補充(以下為"Ausubd等")中找到。用於本發明的方法中的靶核酸，包括但不限於，gDNA可以使用本領域已知的任何適當的樣品製備技術而從生物材料獲得。商購的核酸提取儀器和系統特別包括ABIPRISM6100核酸PrepStation和ABIPRISM6700核酸自動工作站(ABIPRISM6700NucleicAddAutomatedWorkStation)。核酸樣品製備試劑和試劑盒也可以商購，包括但不限於，NucPrep化學，BloodPrep化學，ABIPRISMTransPrep系統，和PrepManTM超樣品製備試齊lJ(全部來自應用AppliedBiosystems(應用生物系統))和miRvanaRNA分離試劑盒(Ambion,Austin,TX)。純化的或部分純化的核酸，包括但不限於，gDNA和總RNA以及組織-特異性核酸製備物，可從許多商業來源商購獲得，包括但不限於，Coriell細胞儲藏處，Coridl醫學研究院(CoriellInstituteforMedicalResearch)，Camden,NJ;血清學公司(SerologicalsCorp.),Norcross,GA;Stratagene，LaJollaCA;Ambion,Austin,TX;以及美國典型培養物收藏中心(AmericanTypeCultureCollection(ATCC))，Manassas,VA。術語"擴增(amplifying)"和"擴增(amplification)"以廣義應用，並且是指本領域已知的任何技術，在所述技術中再生產或複製靶核酸、擴增子、至少靶核酸的部分、或至少擴增子的部分(包括互補鏈的合成或連接探針的形成)，典型地以模板-依賴性方式進行，包括廣泛範圍的線性地或指數性地擴增核酸序列的技術。一些擴增技術等溫地進行；一些擴增技術使用溫度循環進行；一些擴增技術包括至少一個等溫擴增步驟和至少一個包括熱循環的擴增步驟。擴增技術的一些非限制性實例包括引物延伸，其包括但不限於PCR,RT-PCR，異步PCR(asynchronousPCR(A-PCR))，不對稱PCR，定量或Q-PCR;連接酶鏈式反應(LCR),連接酶檢測反應(LDR)，其包括但不限於每一種的缺口填補和缺口寡核苷酸形式(參見，例如，Cao,DNAAmplification(DNA擴增)中第1.3章CurrentTechniquesandApplications(現代技術和應用)，Demidov和Broude，編，Horizon生物科學(2004;以下為"Demidov和Broude");Abravaya等，Nud.AcidsRes.(核酸研究)23:675-82(1995);Lizardi等,Nat.Genetics(自然遺傳學)19:225-32(1998);和Segev,美國專利號6,004,826);旋轉循環擴增(RCA)，有時叫作滾環複製(RCR);鏈置換擴增(SDA)和多置換擴增(MDA);基於核酸鏈的擴增(NASBA)，有時叫作轉錄介導的擴增(TMA)或自我-維持的複製(3SR);SPIAT，BRiboSPIAT，;^(參見，例如，Kurn,美國專利號6,251,639和美國專利申請公布號US2003/0017591Al);以及解旋酶-依賴性擴增(HDA;參見，例如，Vincent等，EMBO報告5:795-800(2004))，並且包括但不限於多鏈體形式和/或它們的組合，例如但不限於，OLA/PCR,PCR/LDR,PCR/LCR，這還叫作組合的鏈式反應(CCR)某些擴增技術的描述可以特別在下列各項中找到MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆，實驗室手冊)，Sambrook和Russell,編，ColdSpringHarborPress,第3版.(2001;以下為"Sambrook和Russell，，)；Sambrook等；Ausubel等；PCRPrimer(PCR引物);McPh固n;Rapley;Lizardi等，NatGenetics(自然遺傳學)19:225-32(1998);Wiedmann等，S51-64,在PCRMethodsandApplications(PCR方法和應用)中，冷泉港實驗室出版社(1994);Cao,TrendsinBiotechnol(生物技術的趨勢)22:38-44(2004);以及Wenz和Schroth,美國專利申請公布號US2003/0190646A1。在某些實施方案中，擴增技術包括至少一個擴增循環，例如但不限於，下列步驟將雙鏈核酸變性，以分離組成鏈；將引物雜交到耙旁側序列或擴增子的引物-結合位點上(或其補體，適當地)；並且使用DNA聚合酶以模板-依賴性方式合成核苷酸鏈。在某些實施方案中，擴增循環包括下列步驟將雙鏈核酸變性，以分離組成鏈；將第一連接探針和相對應的第二連接探針雜交到(l)靶核酸或所述靶核酸的補體上，或(2)擴增子上；並且將鄰近雜交的探針用連接酶連接，以形成連接的探針(代表性的擴增子)。在某些實施方案中，擴增循環包括下列步驟將雙鏈核酸變性，以分離組成鏈；將上遊裂解探針和相對應的下遊裂解探針雜交到(l)靶核酸或所述耙核酸的補體上，或(2)擴增子上，以形成核酸裂解結構；將所述裂解結構裂解，以釋放突出，並且形成包括鄰近下遊裂解探針的雜交片段而退火的上遊裂解探針的雜交結構；並且任選地將鄰近雜交的探針用連接酶連接，以形成連接的探針。所述循環可以重複或可以不重複。在某些實施方案中，擴增循環包括多個擴增循環，例如但不限於20個循環，25個循環,30個循環,35個循環,40個循環,45個循環或多於45個循環的擴增。在一些實施方案中，擴增包括使用儀器的熱循環，所述儀器例如但不限於，GeneAmpPCR系統9700,9600,2700,或2400熱循環儀(全部來自應用生物系統(AppliedBiosystems))。在某些實施方案中，在擴增反應，例如但不限於不對稱PCR或A-PCR中，產生單鏈擴增子。已經開發了這樣的裝置，其可以使用含有核酸染料的反應組合物進行熱循環反應和檢測，發射特定波長的光束，讀取從與雙鏈核酸締合的核酸染料分子發射的螢光信號的強度，並且在每個循環後顯示螢光的強度。包括熱循環儀、光束髮射器和螢光信號檢測器的裝置，例如，已經在美國專利號5，928,907;6,015,674;和6,174,670中描述，並且包括但不限於，ABIPrism7700序列檢測系統((AppliedBiosystems(應用生物系統),Foster市，加利福尼亞)和ABIGeneAmp5700序列檢測系統((AppliedBiosystems(應用生物系統)，Foster市，加利福尼亞)。在某些實施方案中，這些功能可以通過分開的裝置進行。例如但不限於，如果應用Q-P複製酶反應進行擴增，所述反應可以不在熱循環儀中發生，而是在這樣的儀器的反應容器中發生，所述儀器可以包括在特定波長發射的光束，螢光信號的檢測，以及在監測儀或其它讀取裝置上計算並且顯示擴增產物的量。在某些實施方案中，組合的熱循環和螢光檢測裝置可以用於精確定量樣品中的靶核酸序列。在某些實施方案中，螢光信號可以在一個或多個熱循環過程中和/或一個或多個熱循環後檢測並且顯示，因此允許當反應"實時"發生時監測擴增產物。在某些實施方案中，人們可以使用擴增產物的量和擴增循環的數目來計算擴增前在樣品中有多少靶核酸序列。在一些實施方案中，提供一種連接探針組用於靶核酸，並且所述靶進行線性擴增，例如但不限於LDR。在某些實施方案中，提供兩個連接探針組用於靶核酸，並且對所述靶進行指數擴增，例如但不限於LCR。在一些實施方案中，第一裂解探針和相對應的第二裂解探針與靶核酸退火，形成核酸裂解結構，所述核酸裂解結構包括形成裂解酶的適當的底物的重疊或突出序列(flapsequence)。在某些實施方案中，在裂解後，所述第一裂解探針和第二裂解探針的雜交的片段可以連接以形成連接的探針。在一些實施方案中，連接的探針包括引物-結合位點，並且可以作為引物延伸反應，例如但不限於PCR的模板。按照本發明的引物延伸是一種擴增方法，其包括使用DNA聚合酶以5'到3，方向將與模板退火的引物延伸。按照某些實施方案，使用適當的緩衝劑、鹽、pH、溫度和適當的NTPs(其可以，但不必包括核苷酸類似物)，DNA聚合酶結合與從退火的引物的3，-端起始的模板鏈互補的核苷酸，以生成互補鏈。在某些實施方案中，用於引物延伸的DNA聚合酶缺少或基本上缺少5，-核酸外切酶活性，3，-核酸外切酶活性或二者。在一些實施方案中，引物延伸包括反轉錄，並且DNA聚合酶包括反轉錄酶或在特定條件下包括反轉錄酶活性的DNA-依賴性DNA聚合酶，例如但不限於，嗜熱棲熱菌(T7zwmitfAwmcip/z//^1(Tif/7」DNA聚合酶，重組37/zDNA聚合酶pol)，GeneAmpAccuRTRNAPCR酶，或棲熱菌屬物種Z05(TZ05)DNA聚合酶(參見，例如，Smith等，在PCRPrimer(PCR引物)中，第211畫219頁)。在某些實施方案中，引物延伸包括反轉錄酶和DNA-依賴性DNA聚合酶。在某些這樣的實施方案中，反應組合物可以包括一種DNA聚合酶抑制劑或至少兩種不同的DNA聚合酶抑制劑，例如但不限於，可以與反轉錄酶形成複合物的第一DNA聚合酶和可以與DNA-依賴性DNA聚合酶形成複合物的第二DNA聚合酶抑制劑。特定的引物延伸反應的描述可以特別在Sambrook等，Sambrook和Russell,Ausubel等，和Chen等，美國專利申請系列號10/947,460中找到。在本發明的一些實施方案中，擴增包括兩步反應，其包括但不限於，預擴增步驟，其中發生有限數目的擴增循環(例如，但不限於，2,3,4,或5個擴增循環)，然後通常將得到的擴增子稀釋，並且將部分的稀釋的擴增子在後續擴增步驟中進行其它的擴增循環(參見，例如，Marmaro和Gordes,美國專利號6,605,451;以及Andersen和Ruff,美國專利申請公布號US2004/0175733)。在一些實施方案中，預擴增步驟，後續擴增步驟，或者兩者，包括DNA聚合酶抑制劑。在某些實施方案中，擴增反應包括多重擴增，其中使用多種不同的引物組、多種不同的連接探針組、多種不同的裂解探針組或它們的組合，同時擴增多種不同的靶核酸和/或多種不同的擴增產物種類(參見，例如，Henegariu等，BioTechniques(生物技術)23:504-11,1997;Belgrader等，DevelopmentofaMultiplexLigationDetectionReactionDNATypingAssay(多鏈體連接檢測反應DNA分型測定的開發)，SixthInternationalSymposiumonHumanIdentification(第六次人類鑑定國際研討會)(1995);和Rapley，特別在第79章)。所公開的方法的某些實施方案包括多重擴增反應和單重(single-plex)擴增反應，包括平行進行的多個單重或更低重(lower-plexy)反應(例如但不限於，雙重(two-plex)、三重(three-plex)、四重(four畫plex)、五重(five-plex)或六重(six-plex)反應)。在某些實施方案中，擴增反應包括不對稱PCR。按照某些實施方案，不對稱PCR包括這樣的反應組合物，其包括(i)至少一種引物對，其中相對於所述引物對的相對應的引物，存在過量的一種引物，例如但不限於，5倍、10倍或20倍過量；(ii)只包含正向引物或只包含反向引物的至少一種引物對；(iii)至少一種引物對，在給定的擴增條件下，其包括導致一條鏈擴增的引物和失去能力的相對應的引物；或(iv)滿足上述(i)和(iii)的描述的至少一種引物對。因此，當擴增耙核酸和/或擴增子時，生成隨後的擴增產物的過量的一條鏈(相對於其補體)。不對稱的PCR的描述可以特別在McPherson,特別是第5章；和Rapley,特別是第64章中找到。在某些實施方案中，人們可以使用至少一種引物對，其中所述引物中的一種的Tm高於另一種引物的Tm，有時叫作A-PCR(參見，例如，Chen等，美國專利申請公布號US2003/0207266A1)。在某些實施方案中，正向引物的Tm與相對應的反向引物的Tm有至少4-15。C的差別。在某些實施方案中，正向引物的Tm與相對應的反向引物的Tm有至少8-15t:的差別。在某些實施方案中，正向引物的Tm與相對應的反向引物的Tm有至少10-15"C的差別。在某些實施方案中，正向引物的Tm與相對應的反向引物的Tm有至少10-12'C的差別。在某些實施方案中，在至少一種引物對中，正向引物的Tm與相對應的反向引物的Tm的差別在於至少約4'C，至少約8'C，至少約10。C，或至少約12。C。在A-PCR的某些實施方案中，除了引物對中的引物的Tm的差異之外，相對於引物對中的另一種引物，還存在過量的一種引物。在某些實施方案中，相對於引物對中的另一種引物，存在5倍到20倍過量的一種引物。在某些A-PCR的實施方案中，引物的濃度為至少50nM。按照某些A-PCR實施方案，人們可以在第一個擴增循環中使用常規的PCR，以致兩個引物退火，並且雙鏈擴增子或靶核酸的兩條鏈都得到擴增。然而，在同一擴增反應的後續循環中通過升高溫度，可以使得具有更低Tm的引物失去能力，以致只有一條鏈得到擴增。因此，其中具有更低Tm的引物失去能力的後續的A-PCR循環導致不對稱的擴增。所以，當擴增靶核酸或擴增產物時，生成後續擴增產物的過量的一條鏈(相對於其補體)。按照某些A-PCR實施方案，可以通過改變第一階段的常規PCR循環過程中的循環數而控制擴增的水平。在這樣的實施方案中，通過改變初始的常規循環的數目，人們可以改變在具有更低Tm的引物失去能力的更高的溫度進行後續PCR循環的雙鏈擴增產物的量。最優化擴增反應的特定的方法是本領域的技術人員已知的。例如，已知PCR可以通過改變用於退火、聚合和變性的時間和溫度，以及改變反應組合物中的緩衝劑、鹽、和其它試劑而最優化。最優化還可以受所用的探針和/或引物的設計的影響。例如，探針和/或引物的長度，以及G-C:A-T比例可以改變退火的效率，因此改變擴增反應。擴增最優化的描述可以特別在下列各項中找到JamesC.Wetmur,"NucleicAcidHybrids,FormationandStructure(核酸雜化體，形成和結構)，"在MolecularBiologyandBiotechnology(分子生物學和生物技術)中，第605-8頁，(RobertA.Meyers編，1995);McPherson,特別是第4章；Rapley;以及Protocols&ApplicationsGuide(方法和應用指南),rev.9/04,普洛麥格(Promega)。某些反應組合物還包含dUTP和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG;例如，AmpErase,應用生物系統(AppliedBiosystems))或尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG;紐英倫生物實驗室(NewEnglandBioLabs),Beverly,MA)。例如，在擴增反應中應用dUTP和UNG的討論可以在Kwok等，Nature(自然)，339:237-238，1989;McPherson;Longo等，Gene(基因)，93:125-128,1990;和Gelfand等，美國專利號5，418，149中找到。在某些方法實施方案中，擴增包括解旋酶，其包括但不限於，大腸桿菌UvrD解旋酶，DnaB解旋酶，或噬菌體T7基因4蛋白；DNA聚合酶，其包括但不限於DNA聚合酶III或DNA聚合酶I的克列諾片段；解旋酶輔助蛋白,其包括但不限於，MutL蛋白；單鏈結合蛋白(SSB)，其包括但不限於，大腸桿菌SSB,T7基因2.5SSB，T4基因32蛋白，和/或RB49基因32蛋白；或它們的組合。在某些實施方案中，包含核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑設計成當所述酶抑制劑和解旋酶在第一溫度彼此締合形成複合物時，抑制解旋酶的酶活性，但是在第二溫度不抑制，在第二溫度，所述酶抑制劑和解旋酶解聚。在某些實施方案中，解旋酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。在一些實施方案中，解旋酶抑制劑的核苷酸序列可以在第一溫度形成雙鏈片段，但是典型地不在第二溫度形成。在一些實施方案中，擴增包括連接酶-介導的擴增技術，例如但不限於，LDR,LCR,FEN-LCR,連接介導的擴增方法的缺口寡核苷酸和缺口-填補形式，連接酶-介導的擴增的扣鎖形式，和與PCR和/或其它擴增方法偶聯的連接方法，並且包括它們的多重形式(參見，例如，Demidov和Broude,特別是第1.3章；Lizardi等,Nat.Genetics(自然遺傳學)19:225-32(1998);Bi等，美國專利號6,511，810;以及Wenz和Schroth,美國專利申請公布號US2003/10190646A1)。按照某些包括連接酶-介導的擴增的方法，連接酶和包含核苷酸序列和猝滅劑的連接酶抑制劑在第一溫度締合，以形成連接酶-連接酶抑制劑複合物。當與所述連接酶抑制劑締合時，連接酶的酶促活性被抑制，其減少在不存在連接酶抑制劑時可能發生的至少一些錯誤連接，因此減少某些次級擴增子，並且減少背景螢光。當將包括連接酶-連接酶抑制劑複合物的反應組合物加熱到第二溫度時，所述連接酶抑制劑與所述連接酶解聚，並且鄰近雜交的探針可以有效地連接。在某些實施方案中，當它們雜交到靶核酸或其補體上時，5，-端下遊連接探針和相對應的上遊連接探針的3，-端不是緊密鄰近的，並且應用缺口-填補步驟，以將上遊探針的3'-端延長到與下遊探針的5'-端毗鄰。在其它實施方案中，在下遊探針的5'-端和上遊探針的3，-端之間存在缺口，以致"缺口寡核苷酸"可以在所述連接探針相對的末端之間的缺口中雜交。在某些這樣的實施方案中，5，-端下遊探針可以與缺口寡核苷酸的3，-端連接，並且上遊探針的3'-端可以與缺口寡核苷酸的5'-端連接。在某些實施方案中，連接酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。在一些實施方案中，連接酶抑制劑的核苷酸序列可以在第一溫度形成雙鏈片段，但是典型地不在第二溫度形成。按照某些缺口-填補LCR或缺口-填補LDR擴增技術，可以在第一溫度形成包括DNA聚合酶和DNA聚合酶抑制劑的複合物，抑制所述DNA聚合酶的活性。在某些實施方案中，連接酶和連接酶抑制劑在第一溫度形成複合物，以抑制錯誤退火的連接探針的連接，所述的錯誤退火有時叫作錯誤連接。本領域的技術人員應該理解，所公開的酶抑制劑、複合物、方法和試劑盒可以用於各種不同的情形中，在所述情形中，進行可以進行引物和/或探針的錯誤退火併且隨後形成不需要的次級擴增子的酶-介導的擴增反應。可以受益於使用包含猝滅劑的酶抑制劑以至少減少背景螢光的任何酶-介導的擴增技術在本發明的目的範圍內。擴增的或測序的靶核酸可以通過本領域已知的任何適當的技術檢測，其包括測量、定量和/或直接或間接地觀察可猝滅的發射，其包括但不限於，螢光、化學發光、生物發光、磷光等，例如但不限於，雷射誘導的螢光和電化學發光。按照所公開的方法的一些實施方案，檢測可以包括任何適當的實時或終點檢測技術。適當的檢測技術的一些非限制性的實例包括解鏈曲線分析、Q-PCR或其它包括核酸染料，並且在一些實施方案中，包括至少一種報導探針的實時技術；以及電泳技術，其包括但不限於凝膠電泳。本領域的技術人員應該理解，各種猝滅劑部分是可用的，其籠統地涵蓋寬範圍的可檢測的發射，並且通過將具有適當的吸收譜的猝滅劑與發射源配對，其可以減少來自所述源的發射中的至少一些。在一些實施方案中，本發明的方法包括Q-PCR。術語"定量PCR"或"Q-PCR"，還叫作實時PCR，是指用於特異性地、非特異性地或二者定量PCR擴增產物的各種方法(參見，例如，Raeymakers,Mol.Biotechnol.(分子生物技術)15:115-22(2000);Joyce,定量RT-PCR,在MethodsinMolBiol.(分子生物學方法)中，巻193,O，Connell,編，Humana出版社;Pierson等,Nucl.AcidsRes.(核酸研究)31(14):e73(2003))。這樣的方法典型地分類為基於動力學的系統，其通常確定或比較擴增因素，諸如確定閾值循環(Q)，或分類為共擴增方法，其通常比較從靶和標準模板同時擴增而產生的產物的量。Q-PCR技術典型地包括報導探針，核酸染料，或二者。例如但不限於TaqMan⑧探針(應用生物系統(AppliedBiosystems)),i-探針，分子be羅s,Edipse探針,蠍子引物，Lux頂引物，FRET引物,溴化乙錠，以及不對稱的花青染料，例如但不限於，SYBRGreenI(分子探針(MolecularProbes))，YO-PRO-1,Hoechst33258,BOXTO(TATAA生物中心(Biocenter)，Goteborg，瑞典)和PicoGreen⑧(分子探針)。在一些實施方案中，本發明的方法在測序反應之前或與之聯合進行。術語"測序"以廣義用於此，並且是指本領域已知的允許鑑定在至少部分多核苷酸，例如但不限於靶核酸或擴增子中的至少一些連續的核苷酸的次序的任何技術。測序技術的一些非限制性的實例包括桑格雙脫氧終止子方法和Maxam和Gilbert的化學裂解方法，包括這些方法的變化；通過雜交測序；通過合成測序；以及限制性作圖。一些測序方法包括電泳，其包括毛細電泳和凝膠電泳；通過雜交測序包括微陣列雜交；質譜；和單分子檢測。在一些實施方案中，測序包括直接測序，雙鏈體測序，循環測序，單鹼基延伸測序(SBE)，固相測序，或它們的組合。在一些實施方案中，測序包括使用儀器檢測測序的產物，所述儀器例如，但不限於，ABIPRISM377DNA測序儀，ABIPRISM310,3100，3100-Avant,3730，或3730xl基因分析儀，ABIPRISM3700DNA分析儀(全部來自應用生物系統(AppliedBiosystems)),或質譜儀。在一些實施方案中，測序包括在擴增產物中結合dNTP，其包括dATP,dCTP，dGTP,dTTP,dUTP,dITP或它們的組合，並且包括dNTPs的雙脫氧核糖核苷酸類似物。本領域的那些技術人員應該理解，所用的測序方法典型地不是本發明方法的限制。相反，提供至少部分相對應的擴增子或靶核酸的至少一些連續的核苷酸的次序的任何測序技術可以典型地與本方法一起應用。在一些實施方案中，在測序步驟之前，通過酶降解，其包括但不限於核酸外切酶I和蝦鹼性磷酸酶消化，例如但不限於ExoSAP-IT⑧試劑(USB公司，Cleveland,OH)，而去除未結合的引物和/或dNTPs。在一些實施方案中，未結合的引物，dNTPs,和/或ddNTPs通過凝膠或柱純化、沉澱、過濾、珠子、磁力分離或基於雜交的選出而適當地去除(參見，例如，ABIPRISMDuplex384WellF/R序列捕獲試劑盒，應用生物系統(AppliedBiosystems)P/N4308082)。在某些實施方案中，將包含擴增產物的反應組合物，或至少部分這樣的反應組合物，未進行之間的純化步驟而進行測序反應(參見，例如，Baskin等，美國專利申請公布號US2002/0137047Al)。測序技術的描述可以特別在下列各項中找到McPherson，特別是第5章;Sambrook禾口Russell;Ausubel等；Siuzdak,TheExpandingRoleofMassSpectrometryinBiotechnology(質譜在生物技術中的擴大作用)，MCC出版社,2003，特別是第7章；以及Rapley,特別是第VI章。在一些實施方案中，所公開的方法和試劑盒包括微觀流體裝置，"在晶片上的實驗室"，或micrototal分析系統(W「AS)。在一些實施方案中，使用微觀流體裝置進行樣品製備。在一些實施方案中，使用微觀流體裝置進行擴增反應。在一些實施方案中，使用微觀流體裝置進行測序或實時PCR反應。在一些實施方案中，使用微觀流體裝置獲得至少部分擴增產物的核苷酸序列。示例性微觀流體裝置的描述可以特別在下列各項中找到公布的PCT申請號WO/0185341和WO04/011666;Kartalov和Quake,Nucl.AcidsRes.(核酸研究)32:2873-79，2004;以及Fiorini和Chiu,BioTechniques(生物技術)38:429-46,2005。某些示例性實施方案本發明提供用於擴增靶核酸並且用於減少背景螢光的組合物、方法和試劑盒，典型地在包含至少一種酶和至少一種酶抑制劑的反應組合物中，所述酶抑制劑包括至少一種核苷酸序列和至少一種猝滅劑。所述酶抑制劑包含核苷酸序列和猝滅劑。設計這樣的酶抑制劑的核苷酸序列，以通過在第一溫度抑制酶的活性而減少不需要的擴增產物的形成，特別是由於在非靶序列的錯誤引發事件，連接和/或裂解探針的錯誤退火，以及引物二聚體的形成而導致的不需要的擴增產物的形成，而在第二溫度不抑制酶的活性。減少的次級擴增子形成的水平減少反應組合物中的非特異性螢光的至少一種成分。所公開的酶抑制劑還設計成在適當條件下自我猝滅。所公開的抑制劑的猝滅劑部分設計成吸收在第一溫度範圍內通過核酸染料分子與所述酶抑制劑的雙鏈片段的締合而產生的螢光信號中的至少一些，而不管所述酶抑制劑是在溶液中游離的還是與酶複合的。因此，所述酶抑制劑的猝滅劑減少這種背景螢光的次級來源中的至少一些，進一步減少反應組合物中的非特異性螢光。某些示例性酶抑制劑按照本發明，包含核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑設計成在所述酶抑制劑與所述酶在酶抑制劑-酶複合物中締合時，而抑制酶的至少一種酶活性。設計所述酶抑制劑的核苷酸序列，以致它們可以形成包括至少一個雙鏈片段的結構，並且選擇所述猝滅劑以能夠吸收在與所述酶抑制劑的雙鏈片段締合時從核酸染料發射的螢光中的至少一些。在第一溫度，例如，但不限於，室溫(典型地約22°C-28°C)以及低於、處於或略高於需要的模板延伸溫度的溫度，可以形成所述酶-酶抑制劑複合物和/或保持締合。當將包含酶-酶抑制劑複合物的反應組合物加熱到第二溫度時，所述酶隨著所述複合物解聚而釋放。所公開的RNA聚合酶抑制劑設計成在所述抑制劑和RNA聚合酶在複合物中締合時而抑制RNA聚合酶的聚合活性。所公開的連接酶抑制劑設計成在所述連接酶抑制劑和所述連接酶在複合物中締合時，這包括錯誤退火的連接探針的連接，而抑制在模板上兩個相鄰雜交的核苷酸鏈之間的磷酸二酯的形成。所公開的解旋酶抑制劑設計成在所述解旋酶抑制劑和所述解旋酶在複合物中締合時，抑制所述解旋酶催化雙鏈核酸的解旋的能力。某些公開的裂解酶抑制劑設計成在所述裂解酶抑制劑和所述裂解酶在複合物中締合時，而抑制所述裂解酶的5'-核酸酶活性。在某些實施方案中，連接酶抑制劑、RNA聚合酶抑制劑、解旋酶抑制劑、和/或裂解酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。本發明的酶抑制劑的抑制能力典型地不顯著依賴於所述抑制劑的精確序列。相反，所述酶抑制劑的整體結構及其解鏈溫度是酶抑制劑是否將抑制相對應的酶的目的酶活性的主要決定因素。在某些實施方案中，將酶抑制劑設計成在第一溫度採用模擬相對應的酶的底物的構象，允許所述酶與所述抑制劑締合形成複合物，在所述複合物中抑制所述酶的酶活性。在第二溫度，所述酶抑制劑的構象可以改變，以致它不再模擬底物，並且將所述酶從所述複合物中釋放出來。因此，當它們基本上是單鏈的和/或不與所述酶在複合物中時，所公開的抑制劑典型地表現出顯著更少的抑制作用，如果有抑制作用的話。在一些實施方案中，酶抑制劑的核苷酸序列包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核苷酸類似物、非核苷酸接頭或它們的組合。所公開的連接酶抑制劑顯著地不幹擾連接探針或裂解探針與靶核酸或需要的擴增子，例如但不限於，連接的探針上的相對應的序列的退火。所公開的解旋酶抑制劑顯著地不幹擾引物與相對應的靶旁側序列或擴增子的雜交。所公開的裂解酶抑制劑顯著地不幹擾裂解探針或連接探針與靶核酸或需要的擴增子上的相對應的序列的退火，或者引物與相對應的靶旁側序列和/或擴增子的雜交。將所公開的DNA聚合酶抑制劑設計成在所述抑制劑與所述DNA聚合酶，並且任選地NTP和/或核苷酸類似物，在第一溫度在DNA聚合酶抑制劑-DNA聚合酶複合物中締合時，而抑制DNA聚合酶的聚合活性，所述第一溫度例如但不限於，近似等於或低於引物的Tm的溫度。本發明的DNA聚合酶抑制劑的抑制能力通常不顯著地依賴所述抑制劑的精確的序列。相反，DNA聚合酶抑制劑的整體結構及其解鏈溫度是DNA聚合酶抑制劑是否將抑制所述DNA聚合酶的酶活性即，聚合的主要決定因素。典型地，所公開的DNA聚合酶抑制劑在它們包括雙鏈片段並且與所述DNA聚合酶，任選地NTP和/或核苷酸類似物，在複合物中締合時，將幹擾所述DNA聚合酶的聚合活性。然而，當它們是單鏈的，並且與所述DNA聚合酶不在複合物中時，所公開的DNA聚合酶抑制劑表現出顯著更少的抑制作用，如果有一些抑制作用的話。在某些實施方案中，選擇DNA聚合酶抑制劑的Tm近似等於或低於在所選的聚合或引物延伸反應中所用的退火引物的引物延伸所用的溫度，但巧是總是這樣。在一些實施方案中，DNA聚合酶抑制劑的解鏈溫度稍微高於引物延伸溫度，例如但不限於其中所述DNA聚合酶抑制劑以低濃度使用的反應組合物。典型地，本發明的DNA聚合酶抑制劑在處於或低於第一溫度時包括至少一個雙鏈片段，但是在處於或高於第二溫度時，是單鏈的或基本上單鏈的。因此在第一溫度，在複合物中的DNA聚合酶的酶活性被抑制，而在第二溫度，所述DNA聚合酶是活性的，並且可以發生擴增反應。示例性的第一溫度包括22°C,23°C,24°C，25°C,26°C，27°C,28°C,29°C,30°C，約22。C到約40°C，約25。C到約35°C，以及約22。C到約28°C，並且清楚地包括在指定的第一溫度範圍內的所有居間溫度。示例性的第二溫度包括42°C，43°C,44。C,45。C，46°C，47°C，48。C,49°C,50°C,51°C，52°C,53°C,54°C,55°C,56°C,57°C,58°C,59°C,60°C,61。C,62°C,63°C,64°C,65°C，66°C,67°C,68°C,69°C,70°C，7rC，72°C,73°C，約48。C到約73。C，約53。C到約67。C,約63。C到約67。C,以及約64。C到約66°C，並且清楚地包括在指定的第二溫度範圍內的居間溫度。本領域的技術人員應該理解，對於給定的擴增反應的適當的第一和第二溫度將至少部分取決於所述酶、所述酶抑制劑的Tm、和/或所述引物禾卩/或探針的Tm，但是，使用本領域己知的和本發明告知的方法，可以常規確定適當的溫度，無需過度的實驗。在某些實施方案中，本發明的DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括單一寡核苷酸。在一些實施方案中，這樣的DNA聚合酶抑制劑包括第一區域、第二區域、第三區域，並且任選地，第四區域；並且所述第一區域與所述第三區域互補。在適當的條件下，包括在第一溫度下，這樣的DNA聚合酶抑制劑的第一區域和第三區域可以退火，並且形成至少一個雙鏈片段，以致所述DNA聚合酶抑制劑採取莖-環或髮夾構象。在某些實施方案中，只有在第一區域中的部分子集核苷酸與在第三區域中的相對應的部分子集核苷酸互補。在一些實施方案中，所公開的DNA聚合酶抑制劑包括可以影響或可以不影響所述DNA聚合酶抑制劑的Tm的核苷酸類似物。一些包含一種寡核苷酸的示例性的DNA聚合酶抑制劑在圖1中示例性地描述。在圖1A中所示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括在整個圖1中用黑色條帶顯示的第一區域(l)，在整個圖1中用波浪線顯示的第二區域(2)，第三區域(3)，和任選地第四區域([4]，以中括號顯示，以表明在本實施方案中它是任選地)，其在整個圖1中以黑色陰影顯示。由於末端核苷酸包括雙脫氧胞嘧啶(以ddC顯示)，所以這種示例性抑制劑的3'-端是不可延伸的。所述第一區域(1)還包括猝滅劑(5)。所述示例性的抑制劑顯示第一區域(1)與第三區域(3)退火形成雙鏈片段，以致所述抑制劑是以莖-環構象存在，其中第二區域(2)形成所述環，並且第四區域(4)作為5'單鏈突出端。在某些實施方案中，這樣的DNA聚合酶抑制劑的第四區域的單鏈突出端包括至少一些核糖核苷酸，特別是當將所述抑制劑設計成與特定的反轉錄酶複合時。在圖1B中顯示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括第一區域(l)、第二區域(2)、和第三區域(3)，但是沒有第四區域。顯示所述第一區域(1)和第三區域(3)退火形成莖，並且第二區域(2)形成環結構，並且還包括猝滅劑(5)。在圖1C中顯示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括第一區域(l)，其包括第一猝滅劑(6)，顯示為Qh第二區域(2)，其包括第二猝滅劑(7)，顯示為Q2;和第三區域(3);以及任選地第四區域([4])。在圖1D中顯示的示例性的DNA聚合酶抑制劑包括第一區域(l)，第二區域(2)，第三區域(3)，以及任選地第四區域([4])，所述第四區域在5'-端包括猝滅劑(5)，顯示為Q。在特定的DNA聚合酶抑制劑實施方案中，所述核苷酸序列包括第一區域、第二區域、第三區域、第四區域、第五區域和第六區域；其中所述第一區域與第三區域互補，並且所述第一區域和第三區域可以在第一溫度形成至少一個雙鏈片段；其中所述第四區域與第六區域互補，並且所述第四區域和第六區域可以在第一溫度形成至少一個雙鏈片段；其中在第六區域的3'-端和第一區域的5'-端之間存在至少一個單鏈區域；並且其中第六區域的3'-端包括不可延伸的核苷酸。在其它DNA聚合酶抑制劑實施方案中，所述核苷酸序列包括至少兩種不同的寡核苷酸，例如但不限於，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。在某些實施方案中，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括兩種寡核苷酸，第一寡核苷酸包括第一區域，並且第二寡核苷酸包括第三區域，並且任選地，包括第四區域，並且第一寡核苷酸的第一區域與第二寡核苷酸的第三區域互補。在某些實施方案中，第一區域中只有子集的核苷酸與第三區域相對應的片段互補。在適當條件下，包括在第一溫度下，第一寡核苷酸的第一區域和第二寡核苷酸的第三區域可以退火，形成包括至少一個雙鏈片段的雙鏈體。當將本發明的DNA聚合酶抑制劑加熱到第二溫度時，例如但不限於在第二溫度範圍內，它們採取單鏈的或基本上單鏈的構象，不是莖-環或雙鏈體構象。一些包括兩種或多種寡核苷酸的示例性酶抑制劑示例性顯示在圖2中。在圖2A中顯示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括與第二寡核苷酸退火的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括在整個圖2中以黑色條帶顯示的第一區域(l)，所述第二寡核苷酸包括第三區域(3)和在整個圖2中以黑色陰影顯示的第四區域(4)。這種示例性DNA聚合酶抑制劑的第一寡核苷酸還包括猝滅劑，表示為Q。在圖2B中顯示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括與第二寡核苷酸退火的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一區域(l)，所述第二寡核苷酸包括第三區域(3)和第四區域(4)。在這種示例性的DNA聚合酶抑制劑中，顯示猝滅劑(Q)附著在第四區域(4)上。在圖2C中顯示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括含有第一猝滅劑(表示為Ql)的第一區域(l)，所述第二寡核苷酸包括第三區域(3)以及包含第二猝滅劑(表示為Q2)的第四區域(4)。在圖2D中顯示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括與第二寡核苷酸退火的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一區域(l)，所述第二寡核苷酸包括第三區域(3)，其中所述第二寡核苷酸包括猝滅劑(表示為Q)。在圖2E中顯示的示例性DNA聚合酶抑制劑包括第一寡核苷酸，其包括第一區域(1)並且與包含第三區域(3)的第二寡核苷酸退火，其中所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸都包括猝滅劑(表示為Ql和Q2)。在某些實施方案中，DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括與之結合的適體，並且當被適體結合時抑制所述DNA聚合酶的酶活性。在一些實施方案中，DNA聚合酶抑制劑包括包含至少一個雙鏈片段的適體。當所述適體在溶液中游離，或者在複合物中與所述DNA聚合酶結合時，所述猝滅劑吸收由與所述適體締合的核酸染料分子產生的螢光信號中的至少一匙。所公開的DNA聚合酶抑制劑不顯著地幹擾引物與相對應的靶旁側序列和/或擴增子加雜交。除了減少與DNA聚合酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料分子的螢光強度並且減少次級擴增子的形成之外，相對於不包含所述DNA聚合酶抑制劑的平行擴增反應，本發明的一些DNA聚合酶抑制劑提高需要的擴增子的產量。在一些實施方案中，DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列的3'-端不能通過DNA聚合酶延伸，典型地是由於存在不可延伸性核苷酸，其包括但不限於含有封閉基團的末端核苷酸。封閉基團是可以添加到核苷酸或核酸上以防止或使通過DNA聚合酶的核苷酸添加最少化的化學部分。通過將封閉基團添加到末端3'-OH上，所述核苷酸不再能夠參與由DNA聚合酶催化的磷酸二酯鍵形成。封閉基團的一些非限制性實例包括烷基基團、非核苷酸接頭、硫代磷酸酯、鏈垸二醇殘基、PNA、LNA、包含替代3'-羥基基團的3'氨基基團的核苷酸類似物、包含替代5'磷酸基團的5'羥基基團的核苷酸類似物、以及缺少3'OH基團的核苷酸衍生物。烷基封閉基團是飽和烴，其可以是直鏈的、支鏈的、環形的或它們的組合。不可延伸的核苷酸的一些非限制性的實例包括具有已經被修飾，如通過用氫或氟取代或通過形成酯、醯胺、硫酸酯或糖苷而修飾的3'-羥基基團的核苷酸。這些核苷酸通常是不可鏈延伸的。可以使用的不可延伸的核苷酸的其它實例包括具有修飾的核糖部分的核苷酸。在某些實施方案中，核糖核苷酸可以作為不可延伸的核苷酸，原因在於在核糖核苷酸中終止的寡核苷酸不能通過特定的DNA聚合酶延伸。可以修飾所述核糖，以包含3'-脫氧衍生物，其包括其中3'-羥基被除氫以外的官能團如疊氮基團取代的那些。在某些實施方案中，不可延伸的核苷酸包括雙脫氧核苷酸(ddN)，例如但不限於，雙脫氧腺苷(ddA)、雙脫氧胞嘧啶(ddC)、雙脫氧鳥苷(ddG)、雙脫氧胸苷(ddT)或雙脫氧尿苷(ddU)。在一些實施方案中，酶抑制劑包含兩種猝滅劑、三種猝滅劑或多於三種猝滅劑。在某些抑制劑實施方案中，第一區域包含猝滅劑和/或第三區域包含第三猝滅劑。在某些實施方案中，第二區域包含猝滅劑。在一些實施方案中，第四區域包含猝滅劑。在某些實施方案中，第五區域包含猝滅劑。在某些實施方案中，第六區域包含猝滅劑。在一些實施方案中，酶抑制劑在核苷酸序列的3'-端、核苷酸序列的5'-端和/或內部包含猝滅劑。在一些實施方案中，酶抑制劑包含第二區域，並且在一些實施方案中，包含形成莖-環構象的環的第五區域。在某些實施方案中，環包含猝滅劑。所公開的連接酶抑制劑沒有顯著地幹擾連接探針與相對應的耙核酸和/或擴增子的退火，並且在某些實施方案中，沒有顯著地幹擾裂解探針與相對應的靶核酸和/或擴增子的退火，和/或引物與相對應的耙核酸和/或擴增子的退火。所公開的裂解酶抑制劑沒有顯著地幹擾裂解探針與相對應的靶核酸或擴增子的退火，並且在某些實施方案中，沒有顯著地幹擾連接探針與相對應的靶核酸或擴增子的退火，和/或引物與相對應的靶核酸或擴增子的退火。所公開的解旋酶抑制劑沒有顯著地幹擾引物與相對應的靶核酸和/或擴增子的退火，並且在某些實施方案中，沒有顯著地幹擾裂解探針和/或連接探針與相對應的靶核酸和/或擴增子的退火。除了減少與酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料分子的螢光強度並且減少次級擴增子的形成之外，相對於不包含所述酶抑制劑的平行擴增反應，本發明的一些酶抑制劑可以增加需要的擴增子的產量。在某些實施方案中，酶抑制劑的雙鏈片段包含內部鹼基對錯配。在某些實施方案中，酶抑制劑包含環結構，典型地是包含雙鏈片段和單鏈環的莖-環結構。在某些實施方案中，酶抑制劑包含兩個環結構。在一些實施方案中，在第一溫度，當抑制劑的互補序列彼此退火時，酶抑制劑的第二區域和/或第五區域可以形成環結構，例如但不限於，第一區域與第三區域退火；和/或第四區域與第六區域退火。在某些實施方案中，所述核苷酸序列的第二區域、第五區域或第二區域和第五區域包括2-12個核苷酸和/或核苷酸類似物，並且在一些實施方案中，包括2-6個核苷酸和/或核苷酸類似物。在一些實施方案中，所述第二和/或第五區域包括非核苷酸接頭。在某些實施方案中，酶抑制劑的第二區域、第五區域、或第二和第五區域由序列(T)n組成，基本上由序列(T)n組成，或者包括序列(T)n，其中n是在1和8之間的任何數目的T核苷酸，例如但不限於，TT,TTT，TTTT,或TTTTT。在其它實施方案中，所述第二區域和/或第五區域由核苷酸A，C,和/或G組成，基本上由核苷酸A,C,和/或G組成，或者包括核苷酸A，C，和/或G，包括但不限於任意這些核苷酸的核苷酸類似物。在一些實施方案中，所述第二區域和/或第五區域包括(l)至少一個核苷酸類似物，例如但不限於PNA禾Q/或LNA，和/或(2)非核苷酸接頭，例如但不限於包含烴基團(-CH2-)的非核苷酸，包括但不限於，包括烷、烯或炔部分，以及乙二醇的接頭，其包括但不限於聚乙二醇(PEG)。典型地所述接頭基團不是疏水性的。在某些實施方案中，接頭是親水性的，或者接頭的至少部分具有親水特性。本領域的技術人員應該理解，在所公開的酶抑制劑中的接頭的組成通常沒有限制，條件是所述接頭不幹擾酶-酶抑制劑的相互作用，並且所述接頭足夠靈活，足以允許所述酶抑制劑在第一溫度自我退火。在一些實施方案中，DNA聚合酶抑制劑包含在所述核苷酸序列的3，-端、5'-端或3'-端和5'-端兩端上的小溝結合物。在一些實施方案中，所述小溝結合物位於內部。在某些實施方案中，所述小溝結合物還包含猝滅劑，例如但不限於，MGB-NFQ(應用生物系統(AppliedBiosystems))。小溝結合物的非限制性實例包括，抗生素如紡錘菌素，偏端黴素，重氮氨苯脒乙醯甘氨酸鹽，噴他脒及其它芳香二脒，Hoechst33258，SN6999，金黴(aureolic)抗腫瘤藥如色黴素和光神黴素，CC-1065,二氫環吡咯並吲哚三肽(DPl3)，1，2-二氫-(3H)-吡咯並[3,2-e]吲哚-7-羧酸酯(CDPl3),以及相關的化合物和類似物。小溝結合物的描述可以特別在下列各項中找到NucleicAcidsinChemistryandBiology(化學和生物學中的核酸)，第2版，Blackburn和Gait,特別在第8.3部分中；Kumar等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)26:831-38:1998;Kutyavin等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)28:655-61，2000;Turner和Denny,Curr.DrugTargets(現代藥物耙)1:1-14,2000;Kutyavin等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)25:3718-25,1997;Lukhtanov等，Bioconjug.Chem,(生物綴合物化學)7:564-7，1996;Lukhtanov等，Bioconjug.Chem.(生物綴合物化學)6:418-26,1995;美國專利號6,426,408;和PCT公布申請號WO03/078450。本領域的技術人員明白小溝結合物典型地提高它們所附著的寡核苷酸的Tm，允許這樣的寡核苷酸有效地在更高的溫度雜交。小溝結合物可以特別從應用生物系統(AppliedBiosystems)(FosterCity,CA)和Epoch生物科學(EpochBiosciences)(Bothell,WA)商購。在一些實施方案中，酶抑制劑的核苷酸序列包含通用鹼基。在一些實施方案中，DNA聚合酶抑制劑包括第四區域或包含通用鹼基的第六區域。在某些實施方案中，緊鄰DNA聚合酶抑制劑的第三區域的第四區域的核苷酸包含通用鹼基。在某些實施方案中，緊鄰在DNA聚合酶抑制劑的第六區域和第一區域之間的單鏈區域的第六區域的核苷酸包含通用鹼基。在一些實施方案中，所述通用鹼基與NTP在DNA聚合酶抑制劑-DNA聚合酶複合物中相互作用。本領域的技術人員應該理解，使用公知的方法和通過本發明的指導，並且無需過度實驗，可以經驗性地確定酶抑制劑的Tm;或者Tm可以應用運算法則估計。用於計算估計的Tm，包括含有常用核苷酸和/或核苷酸類似物的嵌合的寡聚體的Tm的一些公式和計算機運算法則是本領域公知的。按照一個用於寡核苷酸的這樣的預測公式，1^1=(4乂0+<:的數目)+(2XA+T的數目)。特定的寡核苷酸如酶抑制劑、探針或引物的Tm，還可以使用已知的方法無需過度實驗而常規確定。Tm/解鏈溫度以及它們的計算的描述可以特別在Rapley;Nielsen,ExiqonTechnicalNoteLNA02/07.2002,ExiqonA/S;McPherson;Finn等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)17:3357-63,1996中找到。本發明的酶抑制劑的解鏈溫度可以以各種方法計算。例如，本領域的那些技術人員明白第一和第三區域，並且在某些實施方案中，第四和第六區域的互補序列的長度和/或組成，可以不同，以增加或減少酶抑制劑的解鏈溫度；在某些抑制劑實施方案中，第四和第六區域的互補序列的長度和/或組成可以不同，以增加或減少所述酶抑制劑的Tm。因此，一般地，與具有更少數目的雜交鹼基對的雙鏈片段相比，具有更多數目的雜交鹼基對的雙鏈片段通常在更高的溫度解鏈。然而，如果需要長的雙鏈片段，本領域的技術人員可以引入鹼基對錯配，例如但不限於，G:T鹼基對，以調節解鏈溫度。在某些實施方案中，酶抑制劑的雙鏈片段含有一個錯配的鹼基對，兩個錯配的鹼基對，三個錯配的鹼基對，四個錯配的鹼基對，或多於四個錯配的鹼基對，其中兩個或多個錯配的鹼基對可以，但是不必要，是相鄰的。因此，所公開的酶抑制劑的雙鏈片段不必是100%互補的。相反，雙鏈片段可以具有許多或特定百分比的錯配或擺動鹼基對。例如，所述雙鏈片段可以具有約2%，約3%,約4%，約5%,約6%,約7%,約8%，約9%,約10%,約11%,約12%，約13%,約14%,約15%,約16%,約17%，約18%,約19%,或約20%的鹼基對錯配。在某些實施方案中，通過設計包含無鹼基的核苷酸類似物的雙鏈片段，而調節酶抑制劑的解鏈溫度，所述無鹼基的核苷酸類似物例如但不限於，包含糖或糖類似物和磷酸酯或磷酸酯類似物而不是核苷酸鹼基或核苷酸鹼基類似物的類似物，其特別消除雙鏈區域內的鹼基對。包含第二區域和/或第五區域的酶抑制劑的解鏈溫度還可以通過增加或減少在環中的核苷酸和/或核苷酸類似物的數目而調節。包含單一寡核苷酸的酶抑制劑的解鏈溫度還可以通過在可以在第一溫度包含至少一個雙鏈片段的區域與在第一溫度不包含雙鏈片段的區域之間的結合處存在或不存在一個或多個"GC夾"而進行調節。例如但不限於環結構的鹼基，其包括但不限於，在某些實施方案中，鄰近第二區域並且與鄰近第二區域的第三區域的核苷酸退火的第一區域的核苷酸(參見，例如，圖IA)，和/或在一些實施方案中，鄰近第五區域並且與鄰近第五區域的第六區域的核苷酸退火的第四區域的核苷酸(參見，例如，圖1E)。類似地，包含兩種或多種寡核苷酸的酶抑制劑的Tm可以通過存在或不存在GC夾而調節，特別是在它們位於所述酶抑制劑的第一和第三區域的互補片段的一端或兩端時，其包括但不限於，環的鹼基，如果適當的話；並且在某些實施方案中，位於所述酶抑制劑的第四和第六區域的互補片段的兩端中的一端。酶抑制劑的解鏈溫度還可以通過在所述核苷酸序列的第一和/或第三區域中的核苷酸類似物進行調節，並且在某些實施方案中，所述核苷酸序列的第四和/或第六區域，例如但不限於脫氮-dA。提高Tm的核苷酸類似物的一些非限制性實例包括取代dC的C-5丙炔基-dC或5-甲基-2，-脫氧胞苷；取代dA的2,6-二氨基嘌呤2'-脫氧核苷(2-氨基-dA);以及取代dT的C-5丙炔基-dU;其中每種取代分別提高相對解鏈溫度約2.8。C，1.3°C,3.0°C,和1.7°C。當考慮雙鏈片段的長度時，應該考慮所述酶抑制劑的解鏈溫度。例如但不限於，如果DNA聚合酶抑制劑的Tm太高，那麼它可以在高於在引物延伸擴增中所用的溫度的溫度變性，由此引起需要的聚合反應的抑制和減少的需要的擴增子的產量。如果所述Tm太低，那麼所述DNA聚合酶抑制劑可以在允許引物與非靶核酸雜交並且延伸的溫度解鏈，並且失活。當所述DNA聚合酶能夠擴增這樣的非靶核酸時，那麼將在終擴增產物混合物中存在許多不需要的產物，包括引物-二聚體。在某些實施方案中，酶抑制劑具有適當地接近，但不是顯著高於擴增反應的所選的延伸、連接和/或裂解反應溫度的解鏈溫度。在一些實施方案中，特別是當所述酶抑制劑以低濃度應用時，可以使用具有適當地高於引物延伸溫度、連接溫度、或裂解反應溫度的解鏈溫度的酶抑制劑。典型地，本領域的技術人員可以確定酶抑制劑在將要使用其的條件下，例如，在核酸聚合條件下的解鏈溫度。一種示例性的DNA聚合酶抑制劑包括下述，由下述組成或基本上由下述組成5，-「TCTGGlGATA(脫氮dA)TT〖脫氮dA)TGGTA(脫氮dA)ATATGT(DABCYL-T)TTC7r7Y應飾々淡賓詢rarC(MGB-NFQ)-3，(SEQIDNO:)，其中第四區域以中括號表示，第三區域以下劃線表示，第二區域以黑體表示，並且第一區域以斜體表示，並且其中所述第二區域包括第一猝滅劑(在本實施例中表示為DABCYL)，並且所述第一區域包括包含第二猝滅劑(在本實施例中表示為MGB-NFQ)的小溝結合物。由於在這兩個區域之間的兩個內部G:T鹼基對錯配，所以第一區域基本上與第三區域互補，但是所述DNA聚合酶抑制劑仍然在第一溫度自我退火。在這種示例性DNA聚合酶抑制劑的一些實施方案中，在所述DNA聚合酶抑制劑的3，-端上的末端C核苷酸包括核苷酸類似物雙脫氧胞嘧啶(ddC)。在一些實施方案中，第二區域包括TT,TTT,或TTTTT，由TT，TTT，或TTTTT組成或基本上由TT，TTT，或TTTTT組成。在其它實施方案中，第二區域包含非核苷酸接頭。在一些實施方案中，第二區域不包含猝滅劑。在某些實施方案中，所述DNA聚合酶抑制劑的5'-端還包含猝滅劑。在某些實施方案中，所述DNA聚合酶抑制劑的至少一個G核苷酸包含核苷酸類似物脫氮-dG。在一些實施方案中，替代或除了DABCYL部分之外，所述第一猝滅劑包括TAMRATM(羧基四甲基羅丹明)；黑洞猝滅劑(blackholequencher)染料，例如但不限於BHQ-1,BHQ-2,或BHQ-3(生物搜索技術公司(BiosearchTechnologies,Inc.));OREGONGREEN⑧染料(分子探針)；ROXTM(羧基-X-羅丹明)；DABSYL(4-二甲基氨基偶氮苯_4，-磺醯氯)；或TET(四氯螢光素)。在一些實施方案中，替代或除了MGB-NFQ之外，所述第二猝滅劑包括DABSYL，DABCYL,TAMRA，黑洞猝滅劑，ROX,OREGONGREEN，或TET。猝滅劑的選擇典型地不限於本發明，條件是所選擇的猝滅劑可以吸收在所述核酸染料特有的波長的螢光，並且所述猝滅劑和/或所述猝滅劑在抑制劑中的位置基本上不減少所述抑制劑自我退火和/或與酶複合的能力。另一種示例性DNA聚合酶抑制劑包括下述，由下述組成或基本上由下述組成^4rL47^/C-3，(SEQIDNO.)，其中所述第四區域以中括號表示，第三區域用下劃線表示，第二區域以黑體表示，並且第一區域以斜體表示，並且其中第四區域包含猝滅劑(在本實施例中表示為TET)。第一區域與第三區域互補。在所述DNA聚合酶抑制劑的第一區域的3，-端的末端C核苷酸包括核苷酸類似物雙脫氧胞嘧啶(ddC)，使得這一示例性的DNA聚合酶抑制劑不可延伸。在一些實施方案中，第二區域包括TT，TTTT,或TTTTT，由TT,TTTT,或TTTTT組成或基本上由TT,TTTT,或TTTTT組成。在一些實施方案中，第二區域包括非核苷酸接頭。在某些實施方案中，第二區域不包含猝滅劑。在某些實施方案中，所述DNA聚合酶抑制劑的5'-端還包含猝滅劑。在某些實施方案中，至少一個G核苷酸包括核苷酸類似物脫氮-dG，至少一個A核苷酸包括核苷酸類似物脫氮-dA，或者至少一個G核苷酸包括脫氮-dG和至少一個A核苷酸包括脫氮-dA。在一些實施方案中，替代或除了TET部分之外，所述猝滅劑包括TAMRA,黑洞猝滅劑染料，ROX，OREGONGREEN,DABCYL,或DABSYL。本領域的技術人員應該理解，典型地，所公開的酶抑制劑的長度與核苷酸和/或核苷酸類似物的組成可以變化，以便當在複合物中締合時，最優化所述抑制劑，特別是雙鏈片段的穩定性，並且提高其抑制相對應的酶的酶活的能力。本領域的技術人員還應該理解，當所述酶-酶抑制劑複合物在第一溫度的解離速率，有時叫作"脫離-速率(off-rate)"是低的時，所公開的酶抑制劑典型地更有效地抑制次級擴增產物的形成。然而，在某些應用中，人們可以能夠通過使用更高濃度的酶抑制劑而補償"更快"的脫離速率。本領域的技術人員應該明白，用於特定應用的適當的酶抑制劑濃度可以憑經驗確定。當檢測包括解鏈曲線分析，有時叫作解離曲線分析時，本發明的酶抑制劑是特別有用的。為了產生解鏈或解離曲線，將反應組合物加熱，典型地以逐步或遞增方式加熱，並且在適當的時間間隔檢測反應混合物的螢光。首先，在最初加熱過程中，由於所述酶抑制劑的猝滅劑部分，其在第一溫度範圍內，減少從與所述酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料分子發射的螢光，所以反應組合物中的非特異性螢光減少。隨著溫度升高到第二溫度，所述酶抑制劑的雙鏈片段開始解鏈，將已經與所述酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料分子釋放。由於所述酶抑制劑解離，其將使得一種或多種擴增子的評估變得複雜，所以預計將在解離曲線(以螢光的一階導數相對溫度作圖)中出現峰值。由於在所述酶抑制劑中存在猝滅劑，與所述抑制劑解鏈相關的解離峰減小或不被檢測到，原因在於所述猝滅劑吸收從締合的染料分子發射的螢光中的至少一些，這至少減小了所述酶抑制劑的解離峰(參見，例如，圖3-6)。通常，本發明的DNA聚合酶抑制劑可以用於其中使用DNA聚合酶的任何擴增方法中。例如，所公開的DNA聚合酶抑制劑可以用於一種或多種下述方法中DNA測序，DNA擴增，RNA擴增，反轉錄,DNA合成和/或引物延伸。所公幵的DNA聚合酶抑制劑可以用於反應組合物中以用來通過引物延伸而擴增靶核酸，所述引物延伸例如但不限於，PCR和/或反轉錄。本發明的DNA聚合酶抑制劑還可以用於某些測序技術中。所公開的DNA聚合酶抑制劑可以用於使用終止子核苷酸通過單一核苷酸引物延伸的單核苷酸多態性(SNPs)檢測中。任何這樣的方法，包括其變體，例如但不限於，多核苷酸或引物標記，微型測序等，考慮與本文公開的DNA聚合酶抑制劑一起應用。在一些實施方案中，連接酶抑制劑包括可以在第一溫度作為連接底物模擬物的寡核苷酸，其是一種包含不能通過連接酶連接的切口的底物。在一些實施方案中，連接酶抑制劑包括兩個鄰近雜交的核酸末端，但是至少一個末端的至少一個末端核苷酸不與所述抑制劑的"模板"鏈雜交，並且所述兩端不能連接在一起。在某些實施方案中，連接酶抑制劑包括兩個鄰近雜交的核酸末端，但是至少一個末端包括不被連接酶連接的末端核苷酸。例如，3'末端核苷酸不包含3'-羥基基團，5'末端核苷酸不包含5'-磷酸基團，或者二者。圖1E中顯示了一個包含不能通過連接酶閉合的切口的示例性的連接酶抑制劑實施方案。這種示例性的連接酶抑制劑包括第一區域(1)，第二區域(2),第三區域(3),第四區域(4),第五區域(8)，和第六區域(9)。所述第二區域(2)，以環結構表示，還包含第一猝滅劑(6);和第五區域(8)，也以環結構表示，還包括第二猝滅劑(7)。顯示第一區域(l)與第三區域(3)退火形成第一雙鏈片段；並且顯示第四區域(4)與第六區域(9)退火形成第二雙鏈片段，例如，其可以在第一溫度發生。第六區域(9)的3'-端包含不可連接的末端(IO)，例如但不限於，缺少3'-OH基團的末端核苷酸(表示為X)。在某些實施方案中，這樣的示例性連接酶抑制劑的第六區域的3，-端和域第一區域的5，-端不與"模板鏈"(在這一舉例說明中，分別為第四區域(4)和/或第三區域(3))退火。在某些實施方案中，連接酶抑制劑的上遊末端(在圖1E中所示的所述示例性連接酶抑制劑中表示為9)包括8個核苷酸，9個核苷酸，IO個核苷酸，ll個核苷酸，12個核苷酸，13個核苷酸，14個核苷酸，15個核苷酸，16個核苷酸，17個核苷酸，18個核苷酸，19個核苷酸,20個核苷酸，或多於20個核苷酸。應該理解，連接酶抑制劑的"上遊鏈"的長度應該典型地設計成至少與所需要的連接酶的足跡一樣長，並且可以更長。在某些實施方案中，連接酶抑制劑包括可以與模板鏈鄰近雜交的2個寡核苷酸，但是切口的相對末端不適合連接在一起，例如，但不限於，上遊鏈的3'-端不包含3'-OH基團，下遊鏈的5'-端不包含5，-磷酸基團，或者二者。一些連接酶抑制劑實施方案包括至少三個寡核苷酸第一寡核苷酸，第二寡核苷酸和第三寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包括第一區域，所述第二寡核苷酸包括第三區域和第四區域，並且所述第三寡核苷酸包括第六區域，其中所述第一區域與第三區域互補，並且第四區域與第六區域互某些連接酶抑制劑包括兩個寡核苷酸，包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包括第一區域，第二區域，第三區域和第四區域，並且所述第二寡核苷酸包括第六區域，並且其中所述第一區域與第三區域互補，並且第四區域與第六區域互補。在適當的條件下，包括在第一溫度下，所述第一區域和第三區域可以退火，並且形成至少一個雙鏈片段，並且第四區域和第六區域可以退火，形成至少一個雙鏈片段。其它連接酶抑制劑實施方案包括多於兩個寡核苷酸，在適當的條件下，包括在第一溫度下，其可以退火，形成在兩個鄰近雜交的寡核苷酸末端之間包含不能通過連接酶閉合的切口或缺口的雜交結構。在某些連接酶抑制劑實施方案中，位於或者接近上遊寡核苷酸的3-端、下遊寡核苷酸的5，-端、或者上述兩端的至少一個核苷酸，不與第三寡核苷酸的相對應的核苷酸互補，其中所述第一和第二寡核苷酸與所述第三寡核苷酸鄰近退火。因此，至少一個相對末端不能與模板有效退火併且連接酶不能將它們連接在一起。在某些實施方案中，裂解酶抑制劑包括突出序列，其包括至少一個不可被所述裂解酶裂解或被之緩慢裂解的核苷酸間連接。這樣的抑制劑的一個示例性實施方案在圖1F中示例性顯示。所述示例性抑制劑包括第一區域(1),第二區域(2),包含第一猝滅劑(6)的第三區域(3),第四區域(4),第五區域(8),和第六區域(9)，在本示例性抑制劑中所述第六區域(9)包含第二猝滅劑(7)。顯示所述第一區域(1)和第三區域(3)退火，形成第一雙鏈片段，第四區域(4)和第六區域(9)退火，形成第二雙鏈片段，並且第二區域(2)和第五區域(8)分別表示為環結構。在第一區域(l)的上遊是突出序列(ll)，在本示例性實施方案中，其包括不能被裂解酶裂解的多種核苷酸間連接(12)。在這種構象中，所述示例性酶抑制劑形成裂解結構模擬物，其為類似於核酸裂解結構的二級結構，但是其作為所述裂解酶的無效底物。在某些實施方案中，例如但不限於，當所述裂解酶包括具有聚合活性的DNA聚合酶時，和/或當反應組合物包括裂解酶和DNA聚合酶時，所述裂解酶抑制劑的3'-端包括不可延伸的核苷酸，其包括但不限於ddN。在某些實施方案中，酶抑制劑的核苷酸序列包括適體，其包括至少一個雙鏈片段，並且其與酶結合，並且當所述酶結合適體時，其抑制酶的酶促活性。當所述適體在低於第二溫度下在溶液中游離時，或者在複合物中與酶結合時，所述猝滅劑吸收由與所述適體締合的核酸染料分子產生的螢光信號中的至少一些。某些示例性複合物按照本發明的複合物包括與酶締合的酶抑制劑，以致所述酶的至少一種酶促活性被抑制。在某些實施方案中，複合物包括與擴增酶如包含在擴增反應中的任何酶締合的酶抑制劑。在一些實施方案中，複合物包括與RNA聚合酶抑制劑締合的RNA聚合酶。在一些實施方案中，複合物包括與連接酶締合的連接酶抑制劑。在一些實施方案中，複合物包括與解旋酶締合的解旋酶抑制劑。在某些實施方案中，複合物包括與裂解酶抑制劑締合的裂解酶。一些複合物還包括其它的成分，例如但不限於，脫氧核糖核苷酸(dNTP)，核糖核苷酸(rNTP)，核苷酸類似物，解旋酶輔助蛋白，SSB，或酶輔因子，其包括但不限於ATP和煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，並且包括其可以參與某些酶-酶抑制劑複合物的形成和/或穩定的不可裂解的類似物，或它們的組合。在某些實施方案中，酶-酶抑制劑複合物包括與DNA聚合酶抑制劑締合的DNA聚合酶。在某些實施方案中，包括DNA聚合酶抑制劑和DNA聚合酶的複合物還包括NTP和/或核苷酸類似物，其可以參與所述DNA聚合酶抑制劑-DNA聚合酶複合物。按照本發明，當DNA聚合酶與DNA聚合酶抑制劑以及任選地NTP和/或核苷酸類似物複合(即，在複合物中締合)時，所述DNA聚合酶關於其催化向引物或新生多核苷酸鏈的3'-端添加核苷酸的酶促活性被抑制。典型地，設計所公開的DNA聚合酶抑制劑，以在第一溫度形成至少一個雙鏈片段並且與DNA聚合酶複合。當將所述複合物加熱到第二溫度時，所述DNA聚合酶抑制劑的雙鏈片段變性並且複合物解離。當從所述複合物釋放時，所述DNA聚合酶的合成活性恢復，並且，在適當的條件下，可以擴增特定的核酸序列。按照某些實施方案，複合物包括與DNA聚合酶締合的DNA聚合酶抑制劑，以致所述DNA聚合酶的酶促活性被抑制。在一些實施方案中，複合物包括與DNA聚合酶締合的以單或雙莖-環構象的DNA聚合酶抑制劑。在一些實施方案中，複合物包括與DNA聚合酶抑制劑締合的DNA聚合酶，所述DNA聚合酶抑制劑包括退火形成至少一個雙鏈片段的至少兩個寡核苷酸。典型地，DNA聚合酶抑制劑的第一和第三區域在第一溫度退火形成雙鏈片段，並且所述DNA聚合酶抑制劑適當地採取莖-環構象或雙鏈體構象。在某些實施方案中，DNA聚合酶抑制劑的第四和第六區域在第一溫度退火形成雙鏈片段，並且所述DNA聚合酶抑制劑適當地採取莖-環構象、雙莖-環構象或雙鏈體構象。當以莖-環或雙鏈體構象的DNA聚合酶抑制劑與DNA聚合酶結合時，所述DNA聚合酶抑制劑和所述DNA聚合酶可以締合形成複合物，其中所述DNA聚合酶的活性被抑制。隨著反應溫度升高，在或者接近第二溫度時，所述DNA聚合酶抑制劑的雙鏈片段變性，使得所述複合物解離，並且免除對所述DNA聚合酶的抑制。本發明的DNA聚合酶典型地包括，但不限於，DNA-依賴型DNA聚合酶和RNA-依賴型DNA聚合酶，包括反轉錄酶。某些反轉錄酶在特定的反應條件下擁有DNA-依賴型DNA聚合酶活性，這包括AMV反轉錄酶和MMLV反轉錄酶。這樣的具有DNA-依賴型DNA聚合酶活性的反轉錄酶可以適用於所公開的方法，並且清楚地在本發明的考慮中。DNA聚合酶的描述可以特別在下列各項中找到LehningerPrinciplesofBiochemistry(生物化學原理)，第3版,Nelson和Cox,Worth出版社，紐約，NY，2000，特別是第26禾口29章；Twyman，AdvancedMolecularBiology:AConciseReference(高級分子生物學簡明參考)，生物科學出版社(BiosScientificPublishers),紐約，NY,1999;Ausubel等；Lin禾Waysena,J.Mol.Biol.(分子生物學雜誌)271:100-11,1997;Pavlov等，TrendsinBiotechnol.(生物技術趨勢)22:253-60:2004;禾卩EnzymaticResourceGuide:DNApolymerases(酶資、源指南DNA聚合酶)，1998,普洛麥格(Promega),Madison,WI。DNA聚合酶活性的抑制可以關於通過所述DNA聚合酶的次級擴增子的合成或更一般地，關於全部核酸的合成而觀察到。通常，本領域的技術人員可以選擇最優化需要的擴增子的合成，同時最小化假的副產物的合成。因此，在產生需要的擴增子時，當與不存在所選擇的DNA聚合酶抑制劑時合成的次級擴增子的量相比時，所公開的DNA聚合酶抑制劑可以抑制次級擴增子的合成約5°/。，約10%,約15%，約20%,約25%，約30%,約35°/0，約40%,約45%，約50%,約55%，約60°/。，約65%,約70%，約75°/。，約85%,約90%，約95%，約96%，約97%,約98%，約99%,或大於約99%。連接酶活性的抑制可以關於通過在反應組合物中，例如但不限於，其中發生LCR,LDR，LDR-PCR，PCR-LDR,或FEN-LCR的反應組合物中，不需要的副產物，包括但不限於，錯誤連接產物的合成或更一般地，關於全部核酸的擴增而觀察到。通常，本領域的技術人員可以選擇最優化需要的擴增子的合成，同時最小化假的副產物的合成。因此，在產生需要的擴增子時，當與不存在所選擇的連接酶抑制劑時產生的次級擴增子的量相比時，所公開的連接酶抑制劑可以抑制不需要的副產物的合成約5%,約10%，約15%，約20%，約25%，約30%,約35%，約40%，約45%,約50%,約55%，約60%，約65%,約70%,約75%，約85%,約90%,約95%，約96%,約97%,約98%，約99%,或大於約99%。裂解酶活性的抑制可以關於在反應組合物中，例如但不限於，其中發生FEN-LCR的反應組合物中，不需要的副產物的合成或更一般地，關於全部核酸的擴增而觀察到。通常，本領域的技術人員可以選擇最優化需要的擴增子的合成，同時最小化假的副產物的合成。因此，在產生需要的擴增子時，當與不存在所選擇的裂解酶抑制劑時合成的次級擴增子的量相比時，所公開的裂解酶抑制劑可以抑制不需要的副產物的合成約5%,約10%，約15%，約20%，約25%,約30%，約35%，約40%,約45%,約50%，約55%，約60%,約65%，約70%,約75%，約85%,約90%,約95%,約96%,約97%，約98%,約99%,或大於約99%。解旋酶活性的抑制可以關於在反應組合物中，例如但不限於，其中發生HDA的反應組合物中，次級擴增子的合成或更一般地，關於全部核酸的合成而觀察到。通常，本領域的技術人員可以選擇最優化需要的靶核酸的合成，同時最小化假的副產物的合成。因此，在產生需要的擴增子時，當與不存在所選擇的解旋酶抑制劑時產生的次級擴增子的量相比時，所公開的解旋酶抑制劑可以抑制次級擴增子的合成約5%,約10%，約15%，約20%，約25%，約30%，約35%，約40%，約45°/。，約50%，約55%，約60%,約65%,約70%，約75%,約85%,約90%,約95%,約96%,約97%,約98%,約99%,或大於約99%。所公開的酶抑制劑可以與所述酶以各種比例或濃度結合，以形成複合物。在一些實施方案中，所述酶抑制劑以比所述酶更高的摩爾濃度存在。在其它實施方案中，所述酶抑制劑以與所述酶大約相同或更低的摩爾濃度存在。本領域的技術人員可以選擇使用大於l:1(抑制劑酶)的酶抑制劑與酶的摩爾比例，以確保存在足夠的酶抑制劑，以致每個酶分子可以與酶抑制劑締合形成複合物。通常，高度有效的酶抑制劑可以以比較不有效的酶抑制劑更低的濃度應用。因此，酶抑制劑可以以各種濃度提供在反應組合物中。例如，這樣的濃度可以從約lnM到約10mM，或從約5nM到約lmM,或從約10nM到約100pM，或者由本領域的技術人員選擇的其它便利的濃度而不同。本文公開的酶抑制劑可以在擴增反應之前或過程中與酶結合以形成複合物，條件是所述擴增反應條件包括在第一溫度的至少一個步驟。在某些實施方案中，在形成反應組合物之前，酶和酶抑制劑在第一溫度結合。這樣的預溫育步驟可以促進酶抑制劑-酶複合物的形成，並且幫助減少或消除不需要的副產物如錯誤引發的擴增子、錯誤連接的探針和寡聚體化的引物的合成。某些示例性方法所公開的酶抑制劑在本發明的方法中起至少兩種作用。第一，在第一溫度，所公開的酶抑制劑作用抑制相對應的酶的酶促活性，減少次級擴增子形成，所述次級擴增子特別由於引物和/或探針與除靶核酸以外的序列的錯誤退火以及引物二聚體形成而引起。本領域的那些技術人員應該理解，通過減少次級擴增產物的形成，本發明的酶抑制劑可以減少反應組合物的非特異性螢光。第二，由於所述至少一種猝滅劑部分可以吸收由與所述酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料分子發射的螢光中的至少一些，所以，所公開的酶抑制劑還可以減少在反應組合物中由於所述酶抑制劑的自我-猝滅能力引起的非特異性螢光。在某些實施方案中，酶抑制劑還在所公開的方法中增加擴增子的產量。本發明提供擴增靶核酸的方法。按照某些方法實施方案，反應組合物在第一溫度形成，其中所述反應組合物包括DNA聚合酶；DNA聚合酶抑制劑，其包含核苷酸序列和猝滅劑；核苷三磷酸酯(NTP)，典型地是脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)的混合物；靶核酸；引物；以及核酸染料。在某些實施方案中，反應組合物還包括核苷酸類似物。在一些實施方案中，所述DNA聚合酶、DNA聚合酶抑制劑、以及任選地NTP和/或核苷酸類似物，在形成所述反應組合物之前結合。在某些實施方案中，在形成反應組合物之前，將所述DNA聚合酶和所述DNA聚合酶抑制劑在第一溫度預溫育。在第一溫度下，所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括至少一個雙鏈片段，並且所述DNA聚合酶與所述DNA聚合酶抑制劑可以締合形成複合物。相對於在包括相同的DNA聚合酶抑制劑核苷酸序列但是缺少猝滅劑的平行反應組合物中檢測到信號，所述猝滅劑吸收由與所述核苷酸序列的雙鏈片段締合的核酸染料分子發射的螢光信號中的至少一些。然後，將所述反應組合物加熱到接近、處於或高於所述DNA聚合酶抑制劑的解鏈溫度的第二溫度，使得雙鏈片段變性，並且使所述複合物解離。隨著所述DNA聚合酶抑制劑從所述複合物釋放，所述DNA聚合酶的酶促活性不再被抑制。將所述反應組合物進行至少一個擴增循環，以產生多個擴增子。本發明提供減少在反應組合物中的非特異性螢光的方法。按照某些這樣的方法，反應組合物在第一溫度形成，其中所述反應組合物包括DNA聚合酶；DNA聚合酶抑制劑，其包含核苷酸序列和猝滅劑；NTP，典型地是dNTPs的混合物；耙核酸；引物；以及核酸染料。在某些實施方案中，反應組合物還包括核苷酸類似物。在一些實施方案中，所述DNA聚合酶、DNA聚合酶抑制劑、以及任選地NTP和/或核苷酸類似物，在形成所述反應組合物之前結合。在某些實施方案中，在形成反應組合物之前，將所述DNA聚合酶和所述DNA聚合酶抑制劑在第一溫度預溫育以形成複合物。相對於在包括相同的DNA聚合酶抑制劑核苷酸序列但是缺少猝滅劑的平行反應組合物中檢測到的信號，所述猝滅劑吸收由與所述核苷酸序列的雙鏈片段締合的核酸染料分子發射的螢光信號中的至少一些。然後，將所述反應組合物加熱到接近、處於或高於所述DNA聚合酶抑制劑的解鏈溫度的第二溫度，使得雙鏈片段變性，並且使所述複合物解離。隨著所述DNA聚合酶從所述複合物釋放，所述DNA聚合酶的聚合活性不再被抑制。將所述反應組合物進行至少一個擴增循環，以產生多個擴增子。在適當的檢測條件下，可以檢測在所述反應組合物中與多種擴增子締合的核酸染料的螢光，然而，與所述DNA聚合酶^]製劑的核苷酸序列的雙鏈片段締合的核酸染料的螢光至少被所述猝滅劑減少。在一些實施方案中，所述至少一個擴增循環包括多個擴增循環，例如但不限於，至少10個循環，至少15個循環，至少20個循環，至少25個循環,至少30個循環，至少35個循環，至少40個循環，或者多於40個循環的擴增。在一些實施方案中，將所述反應組合物進行至少一個擴增循環包括PCR，其包括PCR的變體，例如但不限於，RT-PCR，不對稱PCR，或定量或實時PCR(參見，例如，Rapley,特別是第VII部分；Protocols&ApplicationsGuide(方法和應用指南),rev.9/04,普洛麥格(Promega);McPh固n)。所公開的方法的某些實施方案包括多重擴增步驟，其包括但不限於，多個平行單重或更低重的擴增反應(例如，2-重、3-重，4-重，5-重，或6-重擴增反應)；多重檢測步驟，其包括但不限於，多個平行的單重或更低重的檢測步驟(例如，其中在同一反應組合物中檢測二、三、四、五或六種不同的擴增子)；或者多重擴增反應和多重檢測方法二者。在一些實施方案中，所述靶核酸包括多種不同的靶核酸，所述引物包括多種不同的引物或多種不同的引物對，多種擴增子包括多種不同的擴增子，並且所述檢測包括檢測與所述多種不同的擴增子締合的核酸染料的螢光。使用所公開的DNA聚合酶抑制劑獲得的酶促抑制的程度可以不同，並且可以依賴於所用的方法，DNA聚合酶，所選的DNA聚合酶抑制劑的結構和解鏈溫度，以及其它因素，如引物延伸溫度。這些變量中的每一個可以由本領域的技術人員使用本發明和/或可用的方法進行最優化，以獲得具有最少的非靶核酸產量的需要的產物的優化產量。類似地，非特異性螢光減少的程度可以不同，除了其它因素，這特別取決於在所述核苷酸序列中的特別的猝滅劑，每種DNA聚合酶抑制劑所用的猝滅劑的數目，所用的核酸染料，反應條件，以及所述DNA聚合酶抑制劑減少次級擴增產物的量的效力。本領域的那些技術人員應該理解，在特定的DNA聚合酶抑制劑中的特定的一種猝滅劑或多種猝滅劑的數目和放置，特定的DNA聚合酶與特定的DNA聚合酶抑制劑的配對，以及特定的猝滅劑與特定的核酸染料的配對，可以使用本領域己知的常規方法無需過度實驗而憑經驗進行評估，以最優化在特定的反應組合物和擴增技術中的非特異性螢光的減少。按照某些方法實施方案，在包括靶核酸和連接探針對的反應組合物中，連接酶與連接酶抑制劑在第一溫度形成複合物。在某些實施方案中，在形成反應組合物之前，將所述連接酶與所述連接酶抑制劑結合，並且進行預溫育。在第一個第二溫度，所述連接酶-連接酶抑制劑複合物解離，釋放連接酶。所述連接探針對的上遊和下遊連接探針選擇性地與靶核酸雜交，並且所述連接酶催化形成連接的探針。一些這樣的實施方案包括多個擴增循環，其包括下列步驟變性，將上遊和下遊連接探針退火，並且連接所述探針，以產生連接的探針。在某些實施方案中，所述反應組合物包括設計成與所連接的探針的補體的至少一部分特異性雜交的連接探針對。在一些實施方案中，連接的探針包括引物-結合位點，並且所述反應組合物包括引物以及DNA聚合酶-DNA聚合酶複合物。按照某些公開的方法，在第一溫度，裂解酶與裂解酶抑制劑形成複合物，並且連接酶與連接酶抑制劑形成複合物。在某些實施方案中，在第一個第二溫度，所述裂解酶-裂解酶抑制劑複合物解離。然後，釋放的裂解酶可以從某些重疊的突出結構裂解突出部分，所述重疊的突出結構包括(1)靶核酸或單鏈擴增子，(2)上遊裂解探針，和(3)對應的下遊裂解探針，其包括與上遊裂解探針的3，-端至少重疊一個核苷酸的5'-突出端或突出序列。當所述突出被裂解酶裂解時，形成包括模板鏈、上遊裂解探針和下遊裂解探針的雜交的片段的雜交結構，在上遊裂解探針的3'-端和下遊裂解探針的雜交的片段的5，-端之間具有可連接的切口。在一些實施方案中，在第二個第二溫度，所述連接酶-連接酶抑制劑複合物解離，並且釋放的連接酶可以連接在雜交結構中的切口，以產生包括連接的探針和模板鏈的雙鏈體。在某些實施方案中，連接的探針包括至少一個引物-結合位點。本領域的那些技術人員應該理解，所述第一個第二溫度和所述第二個第二溫度可以近似是相同的溫度，或者它們可以是不同的溫度。在第一溫度，一些方法實施方案還包括DNA聚合酶-DNA聚合酶抑制劑複合物。在適當的第三個第二溫度下，所述DNA聚合酶-DNA聚合酶抑制劑複合物解離。在適當的條件下，引物與連接的探針的引物-結合部分特異性地雜交，並且可以發生引物延伸。本領域的那些技術人員應該理解，當在反應組合物中使用不同的酶抑制劑時，下列各項中的至少兩者第一個第二溫度，第二個第二溫度，和第三個第二溫度，可以是近似相同的溫度或者它們可以全部是不同的溫度。在所公開的複合物、方法和試劑盒中所用的示例性的裂解酶包括，但不限於，大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶I，水生棲熱菌(77zerm^a《wa"a^)DNA聚合酶I，嗜熱棲熱菌(T72ermw"/zwmo;/n7ws)DNA聚合酶I,哺乳動物FEN-l,閃爍古生球菌(^c/weog/o6^/"/g^tf)FEN-l,詹氏甲垸球菌(Me^z朋ococcws_/wmsc/2")FEN-l,激烈熱球菌(jP,ococcws/wn'osws)FEN-1，秉A自養甲烷桿菌(Afe^awoZac/eWwwf/7erwoflwto^o//7/cww)FEN-1，嗜熱棲熱菌(TTzenm^f/zem2op/n7ws)FEN畫l,Cleavase酶(第三波公司(ThirdWave,Inc.)，Madison,WI)，酉良酒酵母(Sacc/7aram7cescerev&〖ae)RTH1，酉良酒酵母(Sce^v^'ae)RAD27慄酒裂殖酵母(Sc/7iza^cc/7"ro附;^^;70wZ)e)rad2,噬菌體T55，-3，核酸外切酶，極端嗜熱球古菌(/yoccw/zor汰o^//)FEN-1，人核酸外切酶l，牛胸腺5，-3'核酸外切酶，包括其在真細菌，真核細胞，和古菌(archaea)中的同系物，諸如結構特異酶的II類家族的成員。除了其它地方之外，裂解酶的描述可以特別在下列各項中找到Lyamichev等，Science(科學)260:778-83(1993);Eis等，Nat.Biotechnol.(自然生物技術)19:673-76(2001);Shen等，TrendsinBio.Sci.(生物科學趨勢)23:171-73(1998);Kaiser等，J.Biol.Chem.(生物的化學雜誌)274:21387-94(1999);Ma等，J.Biol.Chem.(生物的化學雜誌)275:24693-700(2000);Allawi等，J.Mol.Biol.(分子生物學雜誌)328:537-54(2003);Sharma等，J.Biol.Chem.(生物的化學雜誌)278:23487-96(2003);以及Feng等,Nat.Struct.Mol.Biol.(自然結構分子生物學)11:450-56(2004)。按照某些公開的方法，DNA聚合酶與DNA聚合酶抑制劑，以及任選地NTP和/或核苷酸類似物結合，以形成複合物。在某些實施方案中，所述DNA聚合酶包括反轉錄酶，DNA-依賴型DNA聚合酶，其包括但不限於，熱穩定性DNA聚合酶，或反轉錄酶和DNA-依賴型DNA聚合酶。在一些實施方案中，所述DNA聚合酶抑制劑包括(l)第一DNA聚合酶抑制劑，其在適當的第一溫度可以與反轉錄酶形成複合物，(2)第二DNA聚合酶抑制劑，其在適當的第一溫度可以與DNA依賴型DNA聚合酶形成複合物，或(3)第一DNA聚合酶抑制劑，其在適當的第一溫度可以與反轉錄酶形成複合物，和第二DNA聚合酶抑制劑，其在適當的第一溫度可以與DNA-依賴型DNA聚合酶形成複合物，其中所述第一DNA聚合酶抑制劑和所述第二DNA聚合酶抑制劑包括相同的核苷酸序列或不同的核苷酸序列，其中適用於第一DNA聚合酶抑制劑的第一溫度和適用於第二DNA聚合酶抑制劑的第一溫度是相同的溫度或不同的溫度。按照某些公開的方法，擴增包括兩階段PCR反應，其包括兩種不同的反應組合物第一反應組合物和第二反應組合物，每種包括DNA聚合酶和DNA聚合酶抑制劑。在某些這樣的實施方案中，第一反應組合物包括第一DNA聚合酶，第一DNA聚合酶抑制劑，NTP，典型地是NTPs的混合物，和引物，典型地是多種不同的引物對。在某些實施方案中，將DNA聚合酶，DNA聚合酶抑制劑，和任選地NTP和/或核苷酸類似物在形成第一反應組合物之前組合。將所述第一反應組合物進行有限數目的擴增循環，例如但不限於，2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、ll個、12個、13個、14個或15個擴增循環。在所述有限的第一階段擴增後，將第一反應組合物稀釋，並且將所稀釋的第一反應組合物的部分與第二DNA聚合酶，第二DNA聚合酶抑制劑,NTP,典型地是NTPs的混合物，和引物，典型地是引物對組合。在某些實施方案中，將DNA聚合酶，DNA聚合酶抑制劑，和任選地NTP和/或核苷酸類似物在形成第二反應組合物之前組合。將第二反應組合物進行多個擴增循環，例如但不限於，10-45個擴增循環或20-40個擴增循環，包括在所列範圍內的任何數目的擴增循環，正如每個以及每一個擴增數目是在本文中清楚地敘述的。在一些實施方案中，在稀釋的第一>反應組合物中存在足夠的殘留的第一DNA聚合酶，在所述稀釋的第一反應組合物中，第二DNA聚合酶不是必需的。在一些實施方案中，在稀釋的第一反應組合物中存在足夠的殘留的第一DNA聚合酶抑制劑，在所述稀釋的第一反應組合物中，第二DNA聚合酶抑制劑不是必需的。在某些實施方案中，所述第一DNA聚合酶和第二DNA聚合酶是相同的聚合酶或不同的聚合酶，其包括但不限於，反轉錄酶和DNA-依賴型DNA聚合酶。在一些實施方案中，所述第一DNA聚合酶抑制劑和所述第二DNA聚合酶抑制劑是相同的抑制劑或不同的抑制劑。出於舉例說明的目的，而不是這樣的實施方案的限制，考慮一種示例性的RT-PCR反應，其包括第一反應，所述第一反應包括反轉錄酶、第一DNA聚合酶抑制劑、以及任選地NTP和/或核苷酸類似物；和第二反應組合物，所述第二反應組合物包括熱穩定的DNA-依賴型DNA聚合酶、第二DNA聚合酶抑制劑、以及任選地NTP和/或核苷酸類似物。所述第一DNA聚合酶抑制劑可以設計成在低於反轉錄的最佳溫度的溫度(即，示例性第一階段第一溫度)下抑制反轉錄酶活性，但是處於或高於最佳反轉錄溫度(即，示例性第一階段第二溫度)時不抑制。所述第二DNA聚合酶抑制劑可以設計成在低於第二階段第一溫度的溫度下抑制熱穩定性DNA聚合酶的酶活性，所述低於第二階段第一溫度的溫度例如但不限於，低於至少一個PCR引物的Tm(即，示例性第二階段第一溫度)約5。C到約1(TC或者約4。C更低到約6。C的溫度，但是不高於所述PCR引物的Tm(即，示例性第一階段第二溫度)。本發明的方法可以典型地與任何靶核酸一起應用。所公開的方法不但用於生產大量的需要的擴增子，還用於生產或測序已知存在但是沒有完全測序或純化的核酸。人們只需要充分詳細地知道在靶的一端或兩端，艮P，靶旁側序列的充分數目的鹼基的相同性，以致可以製備至少一種可以作為測序引物的引物。在可接受的第二靶旁側序列的測序和鑑定後，可以製備第二引物，並且位於旁側序列之間的靶核酸可以指數擴增，並且在一些實施方案中，定量。在其它實施方案中，當已經獲得足夠多的序列時，可以合成適當的連接探針組和/或適當的裂解探針組。在所公開的方法的某些實施方案中，檢測包括評估內標或對照序列，並且可以包括將需要的擴增子的量與標準曲線或內部大小標準進行比較。在一些實施方案中，對照序列、被動參照染料或二者包含在反應組合物中，以解釋泳道-與-泳道、毛細管-與-毛細管和/或測定-與-測定的可變性。本方法的某些實施方案還包括多孔反應容器，其包括但不限於，多孔板或多室微觀流體裝置，在其中進行多種擴增反應，並且在一些實施方案中，進行多種檢測，典型地平行進行。在某些實施方案中，產生擴增子的一種或多種多重反應在同一反應容器中進行，所述反應容器包括但不限於，多孔板，如96孔、384孔、1536孔板等；或在微觀流體裝置中進行，例如但不限於，TaqMan⑧低密度陣列(應用生物系統(AppliedBiosystems))。在一些實施方案中，大規模的平行擴增步驟包括多孔反應容器，包括含有多個反應孔的板，例如但不限於，24孔板、96孔板、384孔板、或1536孔板；或多室微觀流體裝置，例如但不限於，TaqMan低密度陣列，其中每個室或每個孔適當地包括適當的引物、引物組、和/或報導探針。典型地，這樣的擴增步驟以一系列平行的單重、兩重、三重、四重、五重或六重反應發生，儘管更高水平的平行多重方法也在本發明的目的範圍內。在某些實施方案中，所述反應組合物還包括被動參照染料。所述被動參照染料包含在反應組合物中作為內部對照，以允許在螢光上對非PCR相關的變量進行標準化，例如但不限於，孔-與-孔、管-與-管、板-與-板、以及測定_與_測定變量。被動參照提供標準化的基線，原因在於其螢光在擴增反應過程中沒有變化。典型地，所述被動參照不幹擾擴增反應。被動參照染料以及基於所述被動參照的標準化計算，例如但不限於，Rn和ARn的應用，是本領域公知的(參見，例如，Killigore等，J.Clin.Micro.(臨床微生物學雜誌)，38:2516-19,2000;使用AmpliTaqGoldDNA聚合酶方法的TaqMan⑧PCR試劑試劑盒，應用生物系統(AppliedBiosystems)P/N402823Rev.D2003;BrilliantSYBRGreenQRT-PCRMaster混合試劑盒,l-步使用手冊，Rev,#75003a,Stratagene,2005;和實時PCR的綱要(EssentialofRealTimePCR),應用生物系統(AppliedBiosystems))。在一些實施方案中，所述被動參照染料包括ROXTM或TAMRATM。某些示例性試劑盒本發明還提供設計成迅速進行某些公開的方法的試劑盒。試劑盒可以通過組裝實施所述方法必需的兩個或多個成分而迅速進行某些公開的方法。在某些實施方案中，試劑盒包含預先測量的單位量的成分，以將終端使用者測量的需要最小化。在一些實施方案中，試劑盒包括進行一種或多種所公開的方法的用法說明。優選地，將所述試劑盒成分最優化，以與另一種聯合實施。某些公開的試劑盒包括含有核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑。在某些實施方案中，試劑盒包括下列各項中的至少一種連接酶抑制劑，解旋酶抑制劑，RNA聚合酶抑制劑，裂解酶抑制劑，和/或DNA聚合酶抑制劑。本發明的某些試劑盒還包括下列各項中的至少一種連接酶，解旋酶，RNA聚合酶，和裂解酶。某些試劑盒包括酶抑制劑，並且還包括下列各項中的至少一種引物，其包括但不限於隨機引物或包含寡dT的引物，或引物對；連接探針對；裂解探針組；連接酶輔因子，其包括但不限於ATP或NAD;SSB;和/或解旋酶輔助蛋白。在一些實施方案中，試劑盒包括引物，DNA聚合酶，連接酶，或它們的組合。在某些實施方案中，試劑盒包括NTP，核苷酸類似物或二者。某些試劑盒實施方案包括含有核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑。在某些實施方案中，試劑盒包括DNA聚合酶；對照序列，例如但不限於，內標序列如持家基因和/或共擴增序列(參見，例如，Siebert和Larrick，BioTechniques(生物技術)14:244-49(1993);Joyce,QuantitativeRT-PCR(定量RT-PCR),83-92,在MethodsinMolBiol.(分子生物學方法)中，巻193,O，Connell,編，Humana出版社；Raeymaekers,Mol.Biotechnol.(分子生物技術)115-22(2000))或包含分子大小或重量標準的多核苷酸梯度；引物和/或引物對；報導探針；核酸染料；被動參照染料；或它們的組合。在某些實施方案中，試劑盒包括多種不同的引物對。在一些實施方案中，試劑盒包括正向引物、反向引物、或正向引物和反向引物，其還包括報導基團。在一些這樣的實施方案中，引物對的正向引物的報導基團與所述引物對的反向引物的報導基團不同。熟練的技術人員應該理解，許多不同種類的報導基團可以用於本發明，不管是單個的或與一種或多種不同的報導基團組合。在某些實施方案中，報導基團發射螢光，化學發光，生物發光，磷光或電化學發光信號。報導基團的一些非限制性的實例包括螢光團，放射性同位素，色原，酶，抗原，其包括但不限於表位標記，半導體納米晶體，如量子點，重金屬，染料，磷光基團，化學發光基團，電化學檢測部分，結合蛋白，磷(phosphors)，稀土螯合劑，過渡金屬螯合劑，近紅外染料，電化學發光標記，和質譜-相容的報導基團，如質量標記、電荷標記和同位素(參見，例如，Hafff卩Smirnov,Nucl.AcidsRes.(核酸研究)25:3749-50,1997;Xu等，Anal.Chem.(化學年刊)69:3595-3602,1997;Sauer等，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)31:e63,2003)。除了其它地方，將報導基團附著到核酸上的詳細方法可以特別在下列各項中找到Hermanson,BioconjugateTechniques(生物綴合物技術),學院出版社(AcademicPress),SanDiego,1996;CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry(現代核酸化學方法)，Bea固ge等，編，JohnWiley和Sons，紐約，紐約(2000),包括從2005年8月起的增刊;以及Haugland，HandbookofFluorescentProbesandResearchProducts(螢光探針和研究產物手冊)，第10版，MolecularProbes(分子探針)-Invitrogen，2005。在某些實施方案中，試劑盒包括兩種或多種不同的酶抑制劑，例如但不限於，連接酶抑制劑和裂解酶抑制劑；裂解酶抑制劑，連接酶抑制劑，和DNA聚合酶抑制劑；或解旋酶抑制劑和DNA聚合酶抑制劑。在一些實施方案中，試劑盒包括兩種或多種不同的DNA聚合酶抑制劑。在某些實施方案中，試劑盒包括兩種不同的酶，其包括但不限於，DNA-依賴型DNA聚合酶和RNA-依賴型DNA聚合酶，如反轉錄酶；連接酶和裂解酶；RNA聚合酶和DNA聚合酶，例如但不限於，反轉錄酶；以及解旋酶和DNA聚合酶。在某些實施方案中，試劑盒包括熱穩定性DNA聚合酶。本發明，己經如上文所述，可以通過參考實施例更好地理解。下述實施例只是意欲舉例說明的目的，並不應該以任何方式解釋為限制本發明的範圍。實施例l:為了評估某些示例性酶抑制劑的猝滅劑部分吸收從與所述示例性酶抑制劑的雙鏈片段締合的核酸染料分子發射的螢光中的至少一些的作用，合成了五種示例性DNA聚合酶抑制劑，如在表l(如下)中所示。特性、位置以及猝滅劑部分的數目是不同的。表l.tableseeoriginaldocumentpage80在室溫下形成一系列平行組合物，每種包括在lX反應緩衝液(50mMTris緩衝液，pH9，5mMMgCl"250dATP，dCTP和dGTP,500dUTP,60nMROX被動參照染料)中的1XSYBRGreenI核酸染料(分子探針)，以及在表1中所示的一種示例性DNA聚合酶抑制劑，其適當地以5nM,10nM,25nM，50nM,75nM，或100nM的濃度存在。如在表l中看出，除了在DNA聚合酶抑制劑D的3'-端的核苷酸是C，而"DNA聚合酶抑制劑"A、DNA聚合酶抑制劑B和DNA聚合酶抑制劑C的3'-端的核苷酸都包括核苷酸類似物雙脫氧胞嘧啶(ddC)以外，"DNA聚合酶抑制劑"A、DNA聚合酶抑制劑B、DNA聚合酶抑制劑C、以及DNA聚合酶抑制劑D享有相同的核苷酸序列。"DNA聚合酶抑制劑"A缺少猝滅劑部分(因此，A不是本發明的真正的DNA聚合酶抑制劑，其用引號標記"DNA聚合酶抑制劑"指示)；DNA聚合酶抑制劑B在其5'-端包含DABCYL猝滅劑部分；DNA聚合酶抑制劑C在其5'-端包含ROX猝滅劑部分；並且DNA聚合酶抑制劑D在其3，-端包含含有非螢光猝滅劑(MGB-NFQ)的小溝結合物。DNA聚合酶抑制劑E包括這樣的核苷酸序列，g卩，其在其第一和第三區域包含4個脫氮-dA核苷酸類似物(表示為脫氮A)和兩個G:T鹼基對錯配。DNA聚合酶抑制劑E還包含兩個猝滅劑部分，在第二區域環中的DABCYL部分和在其3，-端的MGB-NFQ。使用ABIPRISM7900HT實時序列檢測系統儀器(應用生物系統(AppliedBiosystems))在3(TC到95。C的溫度範圍，對於每一種組合物生成解離曲線。使用相關的解離曲線軟體計算螢光相對於溫度的導數。如在圖3中所示，在這一核苷酸序列的Tm(約56。C)從包含IOOnM"DNA聚合酶抑制劑"A(表示為100nMA)的組合物獲得的解離峰比從包含100nM,75nM，或50nMDNA聚合酶抑制劑B(分別表示為100nMB，75nMB,和50nMB)的組合物獲得的解離峰高得多。如在圖3中所示，相對於"DNA聚合酶抑制劑"A，可能歸因於從與DNA聚合酶抑制劑B的雙鏈片段締合的核酸染料分子發射的螢光信號的背景螢光減小。從包含IOOnM"DNA聚合酶抑制劑"A，100nMDNA聚合酶抑制劑C,75nMDNA聚合酶抑制劑C,和50nMDNA聚合酶抑制劑C的組合物中獲得的解離曲線顯示在圖4中。如在圖4中所示，用100nM"DNA聚合酶抑制齊IJ"A獲得的解離峰基本上高於與IOOnM,75nM，或50nM的DNA聚合酶抑制劑C相關的解離峰。從包含50nM"DNA聚合酶抑制劑"A的組合物和包含50nMDNA聚合酶抑制劑D的組合物獲得的解離曲線顯示在圖5中。從包含50nM"DNA聚合酶抑制劑，，A的組合物獲得解離峰(在圖5中顯示為A)基本上高於從包含50nMDNA聚合酶抑制劑D的組合物獲得的解離峰(顯示為D)。圖6顯示從包含100nM,75nM，50nM,25nM，10nM或5nM"DNA聚合酶抑制劑"A(分別顯示為IOOnM/Std,75nM/Std,50nM/Std,25nM/Std,10nM/Std，和5nM/Std)和100nM,75nM,50nM,25nM,10nM或5nMDNA聚合酶抑制劑E的組合物獲得的解離曲線。如在圖6中所示，從包含"DNA聚合酶抑制劑"A的每種組合物獲得的解離峰是可檢測地更高的，並且一般基本上高於從包含DNA聚合酶抑制劑E的組合物獲得的解離峰，後者基本上在"基線"處消失，並且不容易區分。應該理解，這些示例性的DNA聚合酶抑制劑目的是作為各種DNA聚合酶抑制劑設計的非限制性實例，例如但不限於，核苷酸序列變化，有和無小溝結合物，以及不同的猝滅劑部分，其包括但不限於每個抑制劑不同數目的猝滅劑，在所述抑制劑中不同的猝滅劑位置(例如，3'-端、5'-端和內部)，以及不同的特異性猝滅劑(例如，DABCYL,ROX,和NFQ)。本領域的那些技術人員應該理解，各種DNA聚合酶抑制劑設計是可能的，並且適當的DNA聚合酶抑制劑可以通過由本發明告知的各種設計的常規評估而獲得，用於與特別的DNA聚合酶和給定的反應條件組一起應用。^MMl^在gDNA的纖溶酶原激活物尿激酶(PAU)基因中的示例性靶核酸的PCR擴增過程中，抑制次級擴增子為了評估DNA聚合酶抑制劑E在擴增gDNA中的靶核酸中的抑制能力，進行PCR反應。在室溫下形成6種平行的20]LiL反應組合物，每種反應組合物包括40ng人gDNA(Coridl);PAU靶核酸-特異的引物對，其包括2.25正向引物5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCATATTCTCTCATCCTCCTGTCCC-3，(SEQIDNO:)和2.25^M反向引物5，-CAGGAAACAGCTATGACCAAGCGGCTTTAGGCCCACCT腸3，(SEQIDNO:);和終濃度分別為5，10,25,50,75或100nMDNA聚合酶抑制劑E;在lXPCR緩衝液(50mMTris-HCl,pH9，250jiMdATP,dCTP和dGTP,500dUTP,5mMMgCl2,0.6UAmpliTaqDNA聚合酶(應用生物系統(AppliedBiosystems)),60nMROX被動參照染料，8%甘油，0.01%吐溫-20,0.01%NaN3，IXSYBRGreenI核酸染料)中。除了沒有gDNA，並且DNA聚合酶抑制劑E的終濃度是50nM之外，在包含與另外六種相同的製劑的第七平行反應組合物中包括無模板對照。將所述反應組合物在室溫下溫育大約15分鐘，然後在ABIPRISM900HT實時序列檢測系統儀器(應用生物系統(AppliedBiosystems))中進行熱循環。應用下述循環95°C2分鐘，40個循環96°C5秒和60。C2分鐘。為了評估在每種熱循環的反應組合物中產生的擴增產物，將15每種反應組合物加載到非變性4。/。瓊脂糖E-凝膠(InVitrogen，Carlsbad,CA)的分開的泳道中，與加載包括500鹼基對、400鹼基對、300鹼基對、200鹼基對和100鹼基對的標記的分子大小梯度(低範圍DNA標記，InVitrogen)的兩個泳道一起。反應組合物加載在凝膠的泳道中，如下泳道B,5nM抑制劑E;泳道C,10nM抑制劑E;泳道D，25nM抑制劑E;泳道E,50nM抑制劑E;泳道F，75nM抑制劑E;泳道G，100nM抑制劑E;泳道H，50nM抑制劑E,無模板對照。將樣品電泳15分鐘，並且通過溴化乙錠顯示。如在圖7中所示，需要的擴增子(11)的量隨著DNA聚合酶抑制劑濃度增加而增加，直到抑制劑的濃度約為75nM(泳道F)。相反，次級擴增子條帶的密度隨著DNA聚合酶抑制劑濃度增加而減少。^MM^在PCR擴增cDNA中的人細胞色素P450的示例性靶核酸過程中，抑制次級擴增子在室溫下形成7種平行的20ML反應組合物，每種反應組合物包括10ng通用參照人cDNA(Stratagene);P"0靶核酸-特異的引物對，其包括200nM正向引物5'陽TGGGAGTCCTGGAAGCAGC-3，(SEQIDNO:)和200nM反向引物5，-TGGCTTCTGGTCAACAAGTGC-3，(SEQIDNO:);和終濃度分別為O，5,10，25，50,75或100nMDNA聚合酶抑制劑E;在1XPCR緩衝液(50mMTris-HCl,pH9，250(^MdATP，dCTP和dGTP，500dUTP,5mMMgCl2,1,5UAmpliTaqDNA聚合酶，60nMROX被動參照染料，8%甘油，0.01%吐溫-20，0.01%NaN3,1XSYBRGreenI核酸染料)中。除了沒有cDNA，並且DNA聚合酶抑制劑E的終濃度是50nM之外，在包含與另外七種相同的製劑的第八平行反應組合物中包括無模板對照。將所述反應組合物在室溫下溫育15分鐘，然後在ABIPRISM7900HT實時序列檢測系統儀器中進行熱循環，並且在非變性瓊脂糖凝膠上分析擴增產物，如在實施例2中所述。反應組合物加載在凝膠的泳道中，如下泳道B,0nM抑制劑E;泳道C,5nM抑制劑E;泳道D,10nM抑制劑E;泳道E，25nM抑制劑E;泳道F,50nM抑制劑E;泳道G，75nM抑制劑E;泳道H，100nM抑制劑E;和泳道I，50nM抑制劑E，無模板對照。如從在圖8所示的凝膠所看出的，需要的擴增子(21)的量隨著DNA聚合酶抑制劑濃度增加而增加，直到抑制劑的濃度約為75nM。在不包含DNA聚合酶抑制劑E的反應組合物中(泳道A)，觀察到幾乎很少到沒有的需要的擴增子。次級擴增子條帶的密度隨著DNA聚合酶抑制劑濃度增加而減少。SMM^抑制包括引物二聚體的次級擴增產物獲得5種商購引物對和相應的TaqMan報導探針(應用生物系統(AppliedBiosystems))，用於驗證基因表達測定，其包括用於下列各項的測定白介素l，P(IU(3;測定IDHs00174097一ml),TRAF家族成員-相關的NFKB激活物(TANK;測定IDHs00370305一ml),脂肪酸合酶(FASN;測定IDHs00188012—ml),溶質載體家族2，成員l(SLC2A1;測定IDHs00197884一ml),和磷脂酶D1，磷脂醯膽鹼-特異的(PLD1;測定IDHs00160118_ml)。為了評估示例性酶抑制劑對引物二聚體擴增子形成的作用，平行製備5對缺少靶核酸的相應的反應組合物。每種20piL的反應組合物對包括適當的引物對和相應的以lX濃度的TaqMan⑧探針；250dATP,dCTP禾口dGTP;500jxMdUTP;5mMMgCl2;2UAmpliTaqDNA聚合酶；60nMROX被動參照；8%甘油；0.01%吐溫-20;0.01%NaN3;在50mMpH9Tris-HCl緩衝液中的1XSYBRGreenI;以及50nM聚合酶抑制劑E或無抑制劑。將這5組平行的反應組合物在室溫下溫育30分鐘，然後轉移到ABIPRISM7900HT實時序列檢測系統儀器中。將反應組合物加熱到95'C持續2分鐘，然後進行40個擴增循環，包括96。C5秒和60'C2分鐘。將15^L熱循環的反應組合物加載至化/。瓊脂糖E凝膠(Iiwitrogen)的單個泳道上，如下IL1J3測定，泳道B(無抑制劑)和C(50nM聚合酶抑制劑E);TANK測定，泳道D(無抑制劑)和E(50nM聚合酶抑制劑E);FASN測定，泳道F(無抑制劑)和G(50nM聚合酶抑制劑E);SLC2Al觀ij定，泳道H(無抑制劑)和I(50nM聚合酶抑制劑E);以及PLD1測定，泳道J(無抑制劑)和K(50nM聚合酶抑制劑E)。將包括1200,800，400，200,和100鹼基對標記的分子量標準加載到泳道A和L上。將凝膠電泳15分鐘，並且通過用核酸染料溴化乙錠染色而顯示(在圖9中所示)。當與缺少抑制劑的相應的反應組合物相比較時，例如，比較泳道B(IL1(3測定，無抑制劑)與C(IL1(3測定，50nM聚合酶抑制劑E)或者D(TANK測定，無抑制齊lj)與E(TANL測定，50nM聚合酶抑制劑E)，在包含抑制劑的反應組合物中，不需要的引物二聚體產物的量至少被減少。SMM^減少與酶抑制劑相關的非特異性螢光為了使用PCR擴增和解鏈曲線分析而評估示例性聚合酶抑制劑的示例性猝滅劑部分的作用，製備兩種反應組合物。每種20^L的反應組合物包括來自TANK測定(在實施例4中描述)的以1X濃度的引物和報導探針；10ng通用參照人cDNA(Stratagene);250dATP，dCTP和dGTP;500pMdUTP;5mMMgCl2;2UAmpliTaqDNA聚合酶，60nMROX被動參照，8%甘油，0.01%吐溫-20，0.01%NaN3,在50mMpH9Tris-HCl緩衝液中的lXSYBRGreenI以及50nM"聚合酶抑制劑A"或50nM聚合酶抑制劑E。將反應組合物在室溫下溫育15分鐘，然後轉移到ABIPRISM7900HT實時序列檢測系統儀器中，並且如在實施例4中所述進行熱循環。使用所述儀器相關的軟體，設定為默認條件，產生關於兩種熱循環反應組合物的解離曲線，顯示在圖10中。當所述熱循環的反應組合物包括"聚合酶抑制劑A"時，觀察到兩個解離峰，包括峰A("聚合酶抑制劑A")和峰B(TANK擴增子)。相反，使用包含聚合酶抑制劑B的熱循環反應組合物獲得的解離曲線包含關於TANK擴增子的峰(在更低組中表示為C)，但是關於聚合酶抑制劑E沒有解離峰是容易辨別的。本發明的酶抑制劑、酶-酶抑制劑複合物、方法和試劑盒己經在本文中進行了廣泛而全面地描述。落入總公開內容中的每種更窄的種類和亞類分組也形成本發明的一部分。這包括本發明的總描述，限制性條件或負性限制是從所述種類去除任何主題，而不管所去除的物質是否在本文中特別引用。前述實施例是用於舉例說明目的，並且不意欲限制本發明的範圍。儘管已經參考各種酶抑制劑、酶-酶抑制劑複合物、方法以及試劑盒描述了所公開的發明，但是應該理解，可以進行各種不背離本發明的變化和修改。提供前述實施例，以更好地舉例說明本發明，並且不意欲限制本發明的範圍。可以依據附上的權利要求進一步理解本發明的某些方面。權利要求1.一種包含DNA聚合酶和DNA聚合酶抑制劑的複合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑包含核苷酸序列和猝滅劑。2.權利要求1的複合物，其還包含核苷酸三磷酸(NTP)、核苷酸類似物或NTP與核苷酸類似物。3.權利要求l的複合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括第一區域、第二區域、第三區域、並且任選地，第四區域；並且其中所述第一區域與第三區域互補。4.權利要求3的複合物，其還包含NTP、核苷酸類似物、或NTP與核苷酸類似物。5.權利要求3的複合物，其中所述核苷酸序列不可通過DNA聚合酶延伸。6.權利要求3的複合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑還包括小溝結合物。7.權利要求l的複合物，其中所述核苷酸序列包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包括第一區域，並且所述第二寡核苷酸包括第三區域，並且任選地，第四區域，並且其中所述第一寡核苷酸的第一區域與所述第二寡核苷酸的第三區域互補。8.權利要求7的複合物，其還包含NTP、核苷酸類似物、或NTP與核苷酸類似物。9.權利要求7的複合物，其中所述第一寡核苷酸不能通過DNA聚合酶延伸，所述第二寡核苷酸不能通過DNA聚合酶延伸，或者所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸不能通過DNA聚合酶延伸。10.權利要求1的複合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。11.權利要求1的複合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括至少兩種不同的猝滅劑。12.權利要求1的複合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序13.權利要求12的複合物，其中所述核苷酸類似物包括7-脫氮-2'-脫氧腺苷(脫氮-dA),7-脫氮_2，-脫氧鳥苷(脫氮-dG),雙脫氧核苷酸(ddN),鎖定核酸(LNA),肽核酸(PNA),或它們的組合。14.一種包含DNA聚合酶，DNA聚合酶抑制劑，和任選地，NTP，核苷酸類似物，或NTP與核苷酸類似物的複合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括核苷酸序列和猝滅劑；其中所述核苷酸序列包含第一區域、第二區域、第三區域，和任選地，第四區域；其中所述第一區域與第三區域互補；其中所述第一區域、第三區域或第一區域和第三區域包含至少一個核苷酸類似物；並且其中所述第一區域包含第一猝滅劑，並且所述第二區域包含第二猝滅劑。15.權利要求14的複合物，其中所述第三區域不能通過DNA聚合酶延伸，或者所述第四區域不能通過DNA聚合酶延伸。16.權利要求14的複合物，其中所述核苷酸類似物包括脫氮-dA,脫氮-dG，ddN,LNA,PNA，或它們的組合。17.權利要求14的複合物，其中所述DNA聚合酶抑制劑還包括小溝結合物。18.—種DNA聚合酶抑制劑，其包括核苷酸序列和猝滅劑。19.權利要求18的DNA聚合酶抑制劑，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括第一區域、第二區域、第三區域，和任選地，第四區域；並且其中所述第一區域與第三區域互補。20.權利要求19的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸序列不能通過DNA聚合酶延伸。21.權利要求19的DNA聚合酶抑制劑，其還包括小溝結合物。22.權利要求18的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸序列包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包括第一區域，並且所述第二寡核苷酸包括第三區域，和任選地，第四區域，並且其中所述第一寡核苷酸的第一區域與所述第二寡核苷酸的第三區域互補。23.權利要求22的DNA聚合酶抑制劑，其中所述第一寡核苷酸不能通過DNA聚合酶延伸，所述第二寡核苷酸不能通過DNA聚合酶延伸，或者所述第一寡核苷酸與所述第二寡核苷酸不能通過DNA聚合酶延伸。24.權利要求18的DNA聚合酶抑制劑，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。25.權利要求18的DNA聚合酶抑制劑，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括至少兩種不同的猝滅劑。26.權利要求18的DNA聚合酶抑制劑，其還包括核苷酸類似物。27.權利要求26的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸類似物包括脫氮-dA,脫氮-dG,ddN,LNA,PNA,或它們的組合。28.—種包含核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸序列包括第一區域、第二區域、第三區域，和任選地，第四區域；其中所述第一區域與第三區域互補；其中所述第一區域包括核苷酸類似物，所述第三區域包括核苷酸類似物，或者所述第一區域與所述第三區域包含核苷酸類似物；並且其中所述第一區域包括第一猝滅劑，並且所述第二區域包括第二猝滅劑。29.權利要求28的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸序列不能通過DNA聚合酶延伸。30.權利要求28的DNA聚合酶抑制劑，其還包括小溝結合物。31.權利要求28的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸類似物包括脫氮-dA,脫氮-dG,ddN,PNA，LNA，或它們的組合。32.—種包括核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸序列包括5，-TCTGGGATA(脫氮-dA)TT(脫氮-dA)TGGTA(脫氮-dA)ATATG(Tn)C(脫氮-dA)TATTTATT(脫氮-dA)TA(脫氮-dA)TTATC-3',並且其中Tn包括TT，TTT，TTTT,TTTTT,或TTTTTT。33.權利要求32的DNA聚合酶抑制劑，其中所述猝滅劑包括至少兩種不同的猝滅劑。34.權利要求32的DNA聚合酶抑制劑，其還包括小溝結合物。35.權利要求32的DNA聚合酶抑制劑，其中所述核苷酸序列包括5'-TCTGGGATA(脫氮-dA)TT(脫氮-dA)TGGTA(脫氮-dA)ATATGTTTTC(脫氮-dA)TATTTATT(脫氮-dA)TA(脫氮-dA)TTATC-3，，並且所述猝滅劑包括至少兩種不同的猝滅劑。36.權利要求35的DNA聚合酶抑制劑，其還包括小溝結合物。37.權利要求36的DNA聚合酶抑制劑，其中所述第一猝滅劑包括DABCYL,DABSYL,TAMRA,TET,和ROX中的至少一種；並且所述小溝結合物還包括第二猝滅劑。38.—種減少非特異性螢光的方法，其包括在第一溫度，形成包括DNA聚合酶，包含核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑，核苷酸三磷酸(N丁P),靶核酸，引物，核酸染料，以及任選地核苷酸類似物的反應組合物，其中所述核苷酸序列包括至少一個雙鏈片段，其中所述DNA聚合酶和所述DNA聚合酶抑制劑締合形成複合物，並且其中所述猝滅劑抑制與所述核苷酸序列的雙鏈片段締合的核酸染料的螢光；將所述反應組合物加熱到第二溫度，以使所述複合物解離；將所述反應組合物進行至少一個擴增循環，以產生多種擴增子；和在反應組合物中檢測與多種擴增子締合的核酸染料的螢光，其中所述猝滅劑抑制與所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列的雙鏈片段締合的核酸染料的螢光。39.權利要求38的方法，其中所述檢測包括實時檢測。40.權利要求38的方法，其中所述檢測包括終點檢測。41.權利要求40的方法，其中所述終點檢測包括解鏈曲線分析。42.權利要求38的方法，其中在第一溫度形成反應組合物之前，將所述DNA聚合酶，DNA聚合酶抑制劑，以及任選地NTP和/或核苷酸類似物在一起溫育，以形成複合物。43.權利要求38的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括第一區域、第二區域、第三區域，並且任選地，第四區域；並且其中所述第一區域與所述第三區域互補。44.權利要求43的方法，其中所述核苷酸序列不能通過DNA聚合酶延伸。45.權利要求38的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑還包括小溝結合物。46.權利要求38的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包括第一區域，並且所述第二寡核苷酸包括第三區域，和任選地，第四區域，並且其中所述第一寡核苷酸的第一區域與所述第二寡核苷酸的第三區域互補。47.權利要求46的方法，其中所述第一寡核苷酸不能通過DNA聚合酶延伸，所述第二寡核苷酸不能通過DNA聚合酶延伸，或者所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸不能通過DNA聚合酶延伸。48.權利要求38的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。49.權利要求38的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括至少兩種不同的猝滅劑。50.權利要求38的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括核苷酸類似物。51.權利要求50的方法，其中所述核苷酸類似物包括脫氮-dA,脫氮-dG,ddN,LNA,PNA,或它們的組合。52.權利要求38的方法，其中所述靶核酸包括多種不同的靶核酸，所述引物包括多種不同的引物，並且所述多種擴增子包括多種不同的擴增子。53.權利要求38的方法，其中所述檢測還包括檢測探針。54.權利要求38的方法，其中所述靶核酸包括RNA。55.權利要求54的方法，其中所述RNA包括信使RNA(mRNA)。56.權利要求54的方法，其中所述RNA包括小RNA分子。57.權利要求56的方法，其中所述小RNA分子包括微小RNA(miRNA)。58.權利要求38的方法，其中所述第一溫度是約22T:到約4(rC。59.權利要求38的方法，其中所述第二溫度是約48'C到約73'C。60.權利要求59的方法，其中所述第二溫度是約53X:到約67T:。61.權利要求60的方法，其中所述第二溫度是64t:到67。C。62.權利要求38的方法，其中所述靶核酸包括DNA。63.權利要求38的方法，其中所述引物包括引物對，並且所述至少一個擴增循環包括DNA聚合酶鏈式反應(PCR)。64.—種擴增靶核酸的方法，其包括在第一溫度，形成包括DNA聚合酶，包含核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑，NTP，靶核酸，引物，核酸染料，以及任選地核苷酸類似物的反應組合物，其中所述核苷酸序列包括至少一個雙鏈片段，其中所述DNA聚合酶和所述DNA聚合酶抑制劑締合形成複合物，並且其中所述猝滅劑抑制與所述核苷酸序列的雙鏈片段相締合的螢光；將所述反應組合物加熱到第二溫度，以使所述複合物解離；並且將所述反應組合物進行至少一個擴增循環，以產生多種擴增子。65.權利要求64的方法，其中所述耙核酸包括RNA。66.權利要求65的方法，其中所述RNA包括mRNA。67.權利要求65的方法，其中所述RNA包括小RNA分子。68.權利要求67的方法，其中所述小RNA分子包括miRNA。69.權利要求64的方法，其中所述靶核酸包括DNA。70.權利要求64的方法，其中所述引物包括引物對，並且所述至少一個擴增循環包括PCR。71.權利要求64的方法，其中在第一溫度形成反應組合物之前，將所述DNA聚合酶、DNA聚合酶抑制劑、和任選地，NTP和/或核苷酸類似物在一起溫育，以形成複合物。72.權利要求64的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括第一區域、第二區域、第三區域，和任選地，第四區域；並且其中所述第一區域與所述第三區域互補。73.權利要求72的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列不能通過DNA聚合酶延伸。74.權利要求64的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑還包括小溝結合物。75.權利要求64的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包括第一區域，並且所述第二寡核苷酸包括第三區域，和任選地，第四區域，並且其中所述第一寡核苷酸的第一區域與所述第二寡核苷酸的第三區域互補。76.權利要求75的方法，其中所述第一寡核苷酸不能通過DNA聚合酶延伸，所述第二寡核苷酸不能通過DNA聚合酶延伸，或者所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸不能通過DNA聚合酶延伸。77.權利要求64的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。78.權利要求64的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括至少兩種不同的猝滅劑。79.權利要求64的方法，其中所述DNA聚合酶抑制劑包括核苷酸類似物。80.權利要求79的方法，其中所述核苷酸類似物包括脫氮-dA,脫氮-dG，ddN，LNA，PNA,或它們的組合。81.權利要求64的方法，其中所述耙核酸包括多種不同的耙核酸；所述引物包括多種不同的引物，多種不同的引物對，或它們的組合；並且多種擴增子包括多種不同的擴增子。82.權利要求64的方法，其中所述第一溫度是約22'C到約4(TC。83.權利要求64的方法，其中所述第二溫度是約48。C到約73。C。84.權利要求83的方法，其中所述第二溫度是約53'C到約67'C。85.權利要求83的方法，其中所述第二溫度是63"C到67'C。86.—種試劑盒，其包括包含核苷酸序列和猝滅劑的DNA聚合酶抑制劑。87.權利要求86的試劑盒，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。88.權利要求86的試劑盒，其中所述核苷酸序列包括第一區域、第二區域、第三區域，和任選地，第四區域；其中所述第一區域與第三區域互補。89.權利要求88的試劑盒，其中所述第一區域、第三區域、或第一區域與第三區域包括核苷酸類似物；並且其中所述第一區域包括第一猝滅劑，所述第二區域包括第二猝滅劑，或者所述第一區域包括第一猝滅劑，以及所述第二區域包括第二猝滅劑。90.權利要求86的試劑盒，其中所述核苷酸序列包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包括第一區域，並且所述第二寡核苷酸包括第三區域，和任選地，第四區域，並且其中所述第一寡核苷酸的第一區域與所述第二寡核苷酸的第三區域互補。91.權利要求86的試劑盒，其中所述DNA聚合酶抑制劑還包括小溝結合物。92.權利要求86的試劑盒，其還包括核酸染料。93.權利要求92的試劑盒，其中所述核酸染料包括，溴化乙錠，4，,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),不對稱的花青染料，或它們的組合。94.權利要求93的試劑盒，其中所述不對稱花青染料包括[2-[AH3-二甲基氨基丙基HV-丙基氨基]-4-[2,3-二氫-3-甲基-(苯並-l，3-噻唑-2-基)-亞甲基]-l-苯基-喹啉鑰](SYBRGreen),[2-[iV-雙-(3-二甲基氨基丙基)-氨基)-氨基]-4-[2,3-二氫-3-甲基-(苯並-l,3-噻唑-2-基)-亞甲基]-l-苯基-喹啉鎗](PicoGreen),4-[(3-甲基-6-(苯並噻唑-2-基)-2，3-二氫-(苯並-l,3-噻唑)-2-亞甲基)]-l-甲基吡啶鐵碘化物(BEBO),BOXTO,BETO，或它們的組合。95.權利要求86的試劑盒，其中所述DNA聚合酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。96.權利要求86的試劑盒，其中所述核苷酸序列包括第一區域、第二區域、第三區域，和任選地，第四區域；其中所述第一區域與第三區域互補。97.權利要求86的試劑盒，其還包括報導探針。98.—種包含酶和酶抑制劑的複合物，其中所述酶抑制劑包括核苷酸序列和猝滅劑。99.權利要求98的複合物，其中所述酶包括RNA聚合酶，連接酶，解旋酶，裂解酶，或它們的組合。100.權利要求98的複合物，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。101.權利要求98的複合物，其中所述抑制劑的核苷酸序列包括第一區域、第二區域、第三區域，和任選地，第四區域；並且其中所述第一區域與第三區域互補。102.權利要求98的複合物，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包括一種寡核苷酸，兩種寡核苷酸，或三種寡核苷酸。103.權利要求98的複合物，其中所述酶抑制劑包括至少兩種猝滅劑。104.—種酶抑制劑，其包括核苷酸序列和猝滅劑。105.權利要求103的酶抑制劑，其中所述核苷酸序列包括適體。106.權利要求104的酶抑制劑，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包括一種寡核苷酸，兩種寡核苷酸，或三種寡核苷酸。107.權利要求104的酶抑制劑，其中所述核苷酸序列包括第一區域、第二區域、第三區域、第四區域、第五區域和第六區域；其中所述第一區域與所述第三區域互補，並且所述第四區域與所述第六區域互補。108.權利要求107的酶抑制劑，其還包括不可連接的核苷酸。109.權利要求107的酶抑制劑，其還包括不可裂解的突出序列。110.權利要求109的酶抑制劑，其中所述不可裂解的突出序列包括不可裂解的核苷酸間連接。111.一種減少非特異性螢光的方法，其包括在第一溫度，形成包括酶，包含核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑，靶核酸，引物和核酸染料的反應組合物，其中所述核苷酸序列可以形成至少一個雙鏈片段，其中所述酶和所述酶抑制劑締合形成複合物，並且其中所述猝滅劑抑制與所述酶抑制劑的核苷酸序列的雙鏈片段締合的核酸染料的螢光；將所述反應組合物加熱到第二溫度，以使所述複合物解離；在所述反應組合物中擴增所述靶核酸，以產生多種擴增子；並且在反應組合物中檢測與多種擴增子締合的核酸染料的螢光，其中所述猝滅劑抑制與所述酶抑制劑的核苷酸序列的雙鏈片段締合的核酸染料的螢光。112.權利要求lll的方法，其中所述酶包括RNA聚合酶，連接酶，解旋酶，裂解酶，或它們的組合。113.權利要求lll的方法，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。114.權利要求lll的方法，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包括一種寡核苷酸、兩種寡核苷酸或三種寡核苷酸。115.權利要求lll的方法，其中所述反應組合物包括引物、引物對、連接探針對、裂解探針對、或它們的組合。116.—種擴增耙核酸的方法，其包括-在第一溫度，形成包括酶，酶抑制劑，耙核酸，和核酸染料的反應組合物；其中所述酶抑制劑包括核苷酸序列和至少一種猝滅劑；其中所述核苷酸序列可以形成至少一個雙鏈片段；其中所述酶和所述酶抑制劑締合形成酶-酶抑制劑複合物;並且其中所述至少一種猝滅劑抑制與所述核苷酸序列的雙鏈片段相締合的螢光；將所述反應組合物加熱到第二溫度，以使所述複合物解離；並且在所述反應組合物中擴增所述靶核酸，以產生多種擴增子。117.權利要求116的方法，其中所述酶包括RNA聚合酶，連接酶，解旋酶，裂解酶，或它們的組合。118.權利要求116的方法，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包括適體。119.權利要求116的方法，其中所述酶抑制劑的核苷酸序列包括一種寡核苷酸、兩種寡核苷酸或三種寡核苷酸。120.權利要求116的方法，其中所述反應組合物包括引物、引物對、連接探針對、裂解探針對、或它們的組合。121.—種試劑盒，其包括包含核苷酸序列和猝滅劑的酶抑制劑。122.權利要求121的試劑盒，其中所述酶抑制劑包括RNA聚合酶抑制劑，連接酶抑制劑，解旋酶抑制劑，裂解酶抑制劑，或它們的組合。123.權利要求122的試劑盒，其還包括引物、DNA聚合酶、連接酶或它們的組合。全文摘要本發明涉及用於擴增靶核酸同時減少非特異性螢光和不需要的擴增產物，有時叫作次級擴增產物或假的副產物，的組合物、方法和試劑盒。本發明公開的酶抑制劑包括核苷酸序列和至少一種猝滅劑。本發明還提供包括與酶締合的酶抑制劑的複合物，其中所述酶的至少一種酶促活性被抑制。本發明公開了用於擴增靶核酸同時減少不需要的擴增產物的方法，其是減少非特異性螢光的方法。本發明還提供了迅速進行某些公開的方法的試劑盒。文檔編號C12P19/34GK101321877SQ200680043159公開日2008年12月10日申請日期2006年9月29日優先權日2005年10月3日發明者丹尼·H·李,瓊科·史蒂文斯,董守連申請人:阿普裡拉股份有限公司