細菌檢測器具、細菌檢測方法及細菌檢測試劑盒的製作方法

2023-05-30 05:35:06

專利名稱：細菌檢測器具、細菌檢測方法及細菌檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及細菌檢測器具、細菌檢測方法及細菌檢測試劑盒，具體涉及細菌的特異性寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具、使用該細菌檢測器具的極其準確且操作性高的細菌檢測方法及細菌檢測試劑盒。
背景技術：
例如麥芽酒精飲料中混入有害微生物時，會產生渾濁、風味劣化等現象，從而成為質量劣化的原因。更加具體地說，如對於啤酒來說，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、梳狀菌屬(Pectinatus)等是代表性的有害細菌。其中，短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、Lactobacillus lindneri是有名的啤酒汙染菌。作為檢測這些有害細菌的方法，現在最普通的方法是，用膜過濾器將對象啤酒過濾後，在適當的培養基中培養，然後檢測生長的菌落。
作為判斷該菌落是否為上述有害細菌的方法，使用的方法是將從菌落中提取的DNA作為模板，使用上述有害細菌特異性引物進行PCR反應，通過電泳來判斷是否能夠得到PCR產物(如參照日本國特開平7-289295號公報(
公開日平成7年11月7日))。但是，因為在該方法中每個菌種都需要使用多數引物進行多次PCR反應，操作極其煩雜，在快速性方面存在問題。此外，為了縮短時間，雖然可將多數引物混合併在1個試管內進行擴增反應，但可使用的引物數量有限，所以難於根據微量檢體進行準確判斷。
為了解決上述問題點，使用了下述方法，即、設計含有各種菌種內普遍存在的基因的種特異性序列的部分可擴增的引物，擴增後用識別種特異性序列的限制酶切割擴增產物，以電泳得到的電泳帶的大小來特定其為何種菌種的基因。但是，能夠識別所有對象菌種的限制酶未必都存在，並且，需要用多種類限制酶分別切割得到的擴增產物提供給電泳這樣極其煩雜的操作，在快速性、簡便性方面存在問題。
進而，為了解決上述問題，還實施了下述方法，即、用種特異性序列作探針，通過雜交來判斷被檢體中的DNA或RNA中是否存在與該序列互補的序列。
但是，上述通過雜交進行判斷的方法，對於非常近緣的DNA同源性高的菌種，也存在頻繁發生與別的菌種進行錯誤雜交的交叉雜交問題，有時難於準確鑑定菌種。
特別是，在上述代表性的啤酒汙染菌即屬於乳酸桿菌屬的種中近緣菌非常多，使用頻繁發生交叉雜交的方法，不能達到檢測、鑑定有害細菌的目的。
鑑於上述問題，本發明的目的是提供可以準確判斷特定細菌是否存在的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具、使用該細菌檢測器具通過簡便操作能夠進行快速準確判斷的細菌檢測方法及細菌檢測試劑盒。

發明內容
本發明者為了解決上述課題進行了精心研究，其結果在麥芽酒精飲料的代表性汙染細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中，發現了特定屬或特定種特異性序列；並且發現使用根據該鹼基序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的器具，通過和來源於被檢試料的核酸進行雜交，可快速且準確地檢測、鑑定目的細菌，完成了本發明。
本發明的細菌檢測器具，是用於檢測、鑑定被檢試料中的細菌的器具，其特徵在於，對象細菌是從(1)屬於短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的細菌、(2)屬於Lactobacillus lindneri的細菌、(3)屬於片球菌屬(Pediococcus)的細菌、(4)屬於巨球形菌屬(Megasphaera)的細菌、(5)屬於梳狀菌屬(Pectinatus)的細菌中選擇的至少2種或2種以上的細菌，根據對象細菌所屬的種或屬特異性鹼基序列設計的寡核苷酸固定在基板表面，通過該寡核苷酸和來源於被檢試料的核酸進行雜交，來檢測、鑑定被檢試料中的細菌。
本發明的(1)～(5)的細菌，例如短乳桿菌(Lactobacillus brevis)是序列號7～9及序列號71所示的鹼基序列全部包含在16S核糖體RNA基因中的細菌。Lactobacillus lindneri是序列號22～24所示的鹼基序列全部包含在16S核糖體RNA基因中的細菌。屬於片球菌屬(Pediococcus)的細菌是序列號36～45所示的鹼基序列中至少2個鹼基序列包含在16S核糖體RNA基因中的細菌。屬於巨球形菌屬(Megasphaera)的細菌是序列號50～55所示的鹼基序列中至少2個鹼基序列包含在16S核糖體RNA基因中的細菌。屬於梳狀菌屬(Pectinatus)的細菌是序列號56～58所示的鹼基序列中至少2個鹼基序列包含在16S核糖體RNA基因中的細菌。
作為本發明的細菌檢測器具的檢測對象細菌，優選包括(6)屬於乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的細菌、(7)屬於鏈球菌屬(Streptococcus)的細菌、(8)屬於明串珠菌屬(Leuconostoc)的細菌、(9)屬於發酵單胞菌屬(Zymomonas)的細菌、(10)屬於Lactobacillus coryniformis的細菌、(11)屬於彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)的細菌、(12)屬於德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)的細菌、(13)屬於發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)的細菌、(14)屬於Lactobacillus malefermentans的細菌、(15)屬於乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)群(Lactobacillus casei、Lactobacillusparacasei、Lactobacillus zeae)的細菌、(16)屬於鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)的細菌、(17)屬於布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)的細菌、(18)屬於耐久腸球菌(Enterococcus durans)的細菌、(19)屬於乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的細菌。
作為固定在基板表面的寡核苷酸，優選為下述所示的寡核苷酸，本發明的細菌檢測器具的特徵是，至少1個或1個以上的所述寡核苷酸固定在基板表面。
(A)其是根據屬於乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同屬的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號1所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號2所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號3所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號4所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號5所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號6所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(B)其是根據短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號7所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號8所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號9所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號71所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(C)其是根據Lactobacillus coryniformis的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號10所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號11所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號12所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(D)其是根據彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號13所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號14所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(E)其是根據德氏乳桿菌(Lactobacillus delbureckii)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號16所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號17所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號18所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(F)其是根據發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列的寡核苷酸，並且是含有序列號19所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號20所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號21所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(G)其是根據Lactobacillus lindneri的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號22所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號23所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號24所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(H)其是根據Lactobacillus malefermentans的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號25所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號26所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號27所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(I)其是根據乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)群(Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus zeae)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei)的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號28所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號29所示的鹼基序列的寡核苷酸；以及是根據玉米乳桿菌(Lactobacillus zeae、且含有乾酪乳桿菌的標準株)特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號30所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號31所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(J)其是根據鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號32所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號33所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(K)其是根據布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號34所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號35所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(L)其是根據屬於片球菌屬(Pediococcus)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同屬的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號36所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號37所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號38所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號39所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號40所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號41所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號42所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號43所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號44所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號45所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(M)其是根據屬於鏈球菌屬(Streptococcus)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同屬的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號46所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號47所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(N)其是根據屬於明串珠菌屬(Leuconostoc)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同屬的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號48所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號49所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(O)其是根據屬於巨球形菌屬(Megasphaera)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同屬的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號50所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號51所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號52所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號53所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號54所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號55所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(P)其是根據屬於梳狀菌屬(Pectinatus)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同屬的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號56所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號57所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號58所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(Q)其是根據屬於發酵單胞菌屬(Zymomonas)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同屬的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號59所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號60所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(R)其是根據屬於耐久腸球菌(Enterococcus durans)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號61所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號62所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(S)其是根據乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸，並且是含有序列號63所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號64所示的鹼基序列的寡核苷酸。
(T)其是含有屬於部分明串珠菌屬(Leuconostoc)的細菌及屬於部分乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列的共同的鹼基序列中的序列號72所示的鹼基序列的寡核苷酸。
通過使用將上述(A)～(T)所述的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，能夠全部檢測、鑑定食品中的汙染菌、特別是麥芽酒精飲料中的汙染菌。
此外，本發明的細菌檢測器具，優選上述基板表面具有碳化二亞胺基或異氰酸酯基，且該碳化二亞胺基或異氰酸酯基與所述寡核苷酸或寡核苷酸末端附加的連接子進行反應形成共價鍵。
本發明的細菌檢測方法，是用於檢測、鑑定被檢試料中的細菌的方法，其特徵在於，包括製備被檢試料中的細菌的核酸的核酸製備步驟、以該核酸為模板製備標記探針的探針製備步驟、將所述探針與固定在上述本發明細菌檢測器具的基板表面的寡核苷酸進行雜交的雜交步驟、檢測雜交信號的信號檢測步驟。
作為本發明細菌檢測方法的被檢試料，優選食品，其中最優選麥芽酒精飲料。
本發明的細菌檢測試劑盒，是用於實施上述本發明細菌檢測方法的試劑盒，包含上述本發明的細菌檢測器具，並且優選包含雜交步驟、信號檢測步驟、探針製備步驟、核酸製備步驟中使用的試劑。
本發明的其他目的、特徵及優點通過下述內容可以充分理解，並且本發明的利益通過下述參照附圖的說明可以得以證明。


表示實施例中使用的本發明的細菌檢測器具的基板上固定的寡核苷酸的排列位置圖。
是表示使用在圖1(a)所示的排列位置上固定寡核苷酸的細菌檢測器具檢測Lactobacillus brevis的結果圖像。
具體實施例方式
對本發明的一種實施方式進行如下說明，此外，本發明並不限於下述實施方式。
(1)本發明的細菌檢測器具本發明的細菌檢測器具用於檢測、鑑定被檢試料中的細菌，根據對象細菌所屬的種或屬特異性鹼基序列設計的寡核苷酸固定在基板表面，通過該寡核苷酸和來源於被檢試料的核酸進行雜交，來檢測、鑑定被檢試料中的細菌。
本發明的細菌檢測器具所使用的基板的材質，只要能夠使寡核苷酸穩定地固定即可。例如可以為聚碳酸酯或塑料等合成樹脂、玻璃等，但並不限於這些材質。基板的形態沒有特別限定，但可優選使用如板狀、薄膜狀等基板。
固定在本發明的細菌檢測器具的基板表面的寡核苷酸，只要是根據檢測對象細菌所屬的種或屬特異性鹼基序列設計的寡核苷酸即可。通過該寡核苷酸和來源於被檢試料的核酸之間進行雜交，可檢測出被檢試料中含有的屬於目的種或屬的細菌。此外，對於根據上述檢測對象細菌所屬種或屬特異性鹼基序列設計的寡核苷酸，以下恰當地稱之為「捕獲性寡核苷酸(capture olig)」。
上述特異性鹼基序列，只要從檢測對象細菌的基因組鹼基序列中選取屬或種特異性鹼基序列即可，優選從檢測對象細菌的核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中選取。其中，已知道細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中具有很多屬或種特異性鹼基序列，特別優選從16S核糖體RNA基因所對應的DNA序列中選取屬或種特異性鹼基序列。核糖體RNA基因的鹼基序列，可以從GenBank、EMBL、DDBJ等的資料庫等中得到。
根據上述屬或種特異性鹼基序列來設計捕獲性寡核苷酸即可。因此，其可以為上述屬或種特異性鹼基序列自身，只要能夠與從檢測對象細菌中製備的核酸進行特異性雜交，也可包含變異，變異的位置沒有特別限定。
捕獲性寡核苷酸的長度(鹼基數)沒有特別限定，如果太短難於對雜交進行檢測，如果太長會發生非特異性雜交。本發明者對捕獲性寡核苷酸的最適合長度進行反覆研究，確定標準長度為12～24個鹼基。更優選13～22個鹼基，但並不限於此。本發明者確認，鹼基長度主要取決於序列特性(特定的鹼基含有率、同一鹼基的重複)，結合性良好的序列即使鏈短，也可進行特異性雜交。
當捕獲性寡核苷酸具有妨礙其與來源於被檢試料的核酸進行雜交的髮夾結構、環狀結構或除此之外的立體結構時，通過將構成捕獲性寡核苷酸的1個或1個以上的核苷酸置換為與肌苷或任何核苷酸不聯會的核酸，可以解除其立體結構。
捕獲性寡核苷酸的合成方法沒有特別限定，根據公知的方法(如Maniatis，T.et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)所述方法)合成即可。一般可以用市售的DNA合成機進行化學合成。
本發明的細菌檢測器具，不僅將根據上述檢測對象細菌所屬的種或屬特異性鹼基序列設計的寡核苷酸固定在基板表面，而且優選在此基礎上將所謂的對照捕獲性寡核苷酸也固定在基板表面。對照捕獲性寡核苷酸包括陽性對照捕獲性寡核苷酸及陰性對照捕獲性寡核苷酸。陽性對照捕獲性寡核苷酸用於判斷下述探針製備步驟中的擴增反應是否順利進行。陰性對照捕獲性寡核苷酸用於確認未發生非特異性雜交，即未發生假陽性雜交。本發明也包含這些陽性對照捕獲性寡核苷酸及陰性對照捕獲性寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具。
陽性對照捕獲性寡核苷酸只要根據從檢測對象細菌中製備的探針中所包含的序列進行設計即可。此外，使用同一細菌檢測器具同時檢測多數檢測對象細菌時，可以對各檢測對象細菌設計陽性對照捕獲性寡核苷酸，或者也可以根據從多數檢測對象細菌中製備的探針中的相同鹼基序列進行設計。從所有檢測對象細菌中製備的探針中沒有相同鹼基序列時，也可分為數組分別設計陽性對照捕獲性寡核苷酸。或者也可以設計引物序列部分相同、與對象細菌序列不同的人工序列，使該序列的一部分成為陽性對照捕獲性寡核苷酸。以上述人工序列作模板製備探針(在本說明書中稱這種探針為對照探針)，通過添加到從被檢試料中製備的探針上，可以驗證雜交的特異性。此外，在下面將對上述探針進行說明。
陰性對照捕獲性寡核苷酸，優選以下述方式設計，即、在陽性對照捕獲性寡核苷酸的鹼基序列中，在1個或1個以上的鹼基且小於該序列具有的鹼基數的未滿20％的範圍內具有包含人工置換鹼基的鹼基序列。進行鹼基置換的鹼基數，取決於與雜交條件之間的關係，可選擇來源於檢測對象細菌的探針不發生雜交的鹼基數。
檢測對象細菌沒有特別限定，可適當選擇要從目的被檢試料中檢測的細菌。例如可以為混入食品中可能汙染該食品的細菌。其中優選可能混入、汙染麥芽酒精飲料的細菌為檢測對象細菌。食品中混入有害細菌已成為公共衛生方面的非常大的問題。此外，對於啤酒、發泡酒等所代表的麥芽酒精飲料，有害細菌混入時成為渾濁、風味劣化等質量劣化的原因，因此，特別期望開發出快速且準確檢測、鑑定這些有害細菌的方法。
作為汙染麥芽酒精飲料的細菌，可以為屬於乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、巨球形菌屬(Megasphaera)以及梳狀菌屬(Pectinatus)的細菌。並且屬於乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的菌種，可以為短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、Lactobacillus coryniformis、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、Lactobacillus lindneri、Lactobacillusmalefermentans、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、玉米乳桿菌(含有Lactobacillus zeae、Lactobacillus casei的標準株)。此外，作為汙染食品的細菌，除上述之外還可以為屬於明串珠菌屬(Leuconostoc)及發酵單胞菌屬(Zymomonas)的細菌，以及耐久腸球菌(Enterococcus durans)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。但檢測對象細菌並不限於上述細菌。
用於檢測、鑑定上述所示細菌的捕獲性寡核苷酸，可以為根據屬於下述菌屬的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的各屬的特異性序列設計的寡核苷酸，所述菌屬為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、巨球形菌屬(Megasphaera)、梳狀菌屬(Pectinatus)及發酵單胞菌屬(Zymomonas)；以及可以為由下述菌種的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的各細菌的種特異性序列設計的寡核苷酸，所述菌種為短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、Lactobacillus coryniformis、彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus malefermentans、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)、玉米乳桿菌(含有Lactobacillus zeae、Lactobacillus casei的標準株)、耐久腸球菌(Enterococcusdurans)以及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。具體來說，可以為含有序列號1～64、71及72所示的任何鹼基序列的寡核苷酸，但並不限於這些寡核苷酸。
表1例舉了通過根據乳酸桿菌屬(Lactobacillus)特異性鹼基序列設計的捕獲性寡核苷酸(序列號1～6)、以及根據部分乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和部分明串珠菌屬(Leuconostoc)所對應的鹼基序列設計的捕獲性寡核苷酸(序列號72)，可以檢測出的乳酸桿菌屬的細菌。但通過具有序列號1～6及72所示的任何鹼基序列的捕獲性寡核苷酸可檢測出的細菌，並不限於這些。



通過根據片球菌屬(Pediococcus)特異性鹼基序列設計的捕獲性寡核苷酸(序列號36～45)可檢測出的細菌如表2所示。但通過具有序列號36～45所示的任何鹼基序列的捕獲性寡核苷酸可檢測出的細菌，並不限於這些。


通過根據鏈球菌屬(Streptococcus)特異性鹼基序列設計的捕獲性寡核苷酸(序列號46、47)可檢測出的細菌如表3所示，但通過具有序列號46或47所示的鹼基序列的捕獲性寡核苷酸可檢測出的細菌，並不限於這些。



通過根據明串珠菌屬(Leuconostoc)特異性鹼基序列設計的捕獲性寡核苷酸(序列號48、49)、以及根據部分乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和部分明串珠菌屬(Leuconostoc)所對應鹼基序列設計的捕獲性寡核苷酸(序列號72)，可檢測出的明串珠菌屬的細菌如表4所示。但通過具有序列號48、49及72所示的任何鹼基序列的捕獲性寡核苷酸可檢測出的細菌，並不限於這些。


通過根據巨球形菌屬(Megasphaera)特異性鹼基序列設計的捕獲性寡核苷酸(序列號50～55)可檢測出的細菌，可以為Megasphaera cerevisiae、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、Megasphaera micronuciformis。但通過具有序列號50～55所示的任何鹼基序列的捕獲性寡核苷酸可檢測出的細菌，並不限於這些。
通過根據梳狀菌屬(Pectinatus)特異性鹼基序列設計的捕獲性寡核苷酸(序列號56～58)可檢測出的細菌，可以為嗜啤酒梳狀菌(Pectinatuscerevisiiphilus)、Pectinatus frisingensis。但通過具有序列號56～58所示的任何鹼基序列的捕獲性寡核苷酸可檢測出的細菌，並不限於這些。
通過根據發酵單胞菌屬(Zymomonas)特異性鹼基序列設計的捕獲性寡核苷酸(序列號59、60)可檢測出的細菌，可以為Zymomonas mobilis、Zymomonaspomaceae。但通過具有序列號59或60所示的任何鹼基序列的捕獲性寡核苷酸可檢測出的細菌，並不限於這些。
本發明的細菌檢測器具的基板表面固定的捕獲性寡核苷酸，只要能夠與從對象細菌中製備的探針進行雜交，沒有特別限定。因此，含有上述序列號1～64、71及72所示的任何鹼基序列的寡核苷酸，可以為只含有序列號1～64、71及72所示的任何鹼基序列組成的寡核苷酸，也可以為含有序列號1～64、71及72所示的任何鹼基序列以外的序列的寡核苷酸。作為含有序列號1～64、71及72所示的任何鹼基序列以外的序列的捕獲性寡核苷酸，可以為具有下述鹼基序列的寡核苷酸，所述鹼基序列為以各16S核糖體RNA基因的鹼基序列為基礎，向序列號1～64、71及72所示的各鹼基序列的5』側或3』側、或者其兩側延伸的鹼基序列，本發明也包含將這種寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具。
1個基板上固定化的捕獲性寡核苷酸至少有1種或1種以上即可，沒有特別限定。一般情況下，檢測試料中混入的細菌時，用1個基板可以全部檢測出被檢試料中的可檢測細菌，從操作的簡便性和檢查的快速性來看可謂優選。因此，本發明的細菌檢測器具也最優選在1個基板上固定多數目的細菌種或屬相對應的捕獲性寡核苷酸，成為所謂的微陣列型器具。例如使麥芽酒精飲料作被檢試料時，優選將屬於乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、巨球形菌屬(Megasphaera)、梳狀菌屬(Pectinatus)、發酵單胞菌屬(Zymomonas)等的細菌所對應的捕獲性寡核苷酸固定在基板表面。

寡核苷酸在基板表面的固定化方法沒有特別限定，可以適當選擇並使用公知的方法。例如可以利用物理吸附、靜電結合或分子共價鍵等一般雜交法所使用的方法。本發明的細菌檢測器具，優選使用表面具有碳化二亞胺基或異氰酸酯基的基材(美國專利US5,908,746、日本國專利特開平8-23975號)進行固定化。
將寡核苷酸點樣時，如果寡核苷酸的點樣量太少，無法充分確保寡核苷酸和探針之間的反應性，因而難於判斷。此外，高密度點樣存在技術問題同時成本較高，並且，使用探針的螢光標記、化學顯色等的雜交信號的檢測，也需要更加精密的昂貴的檢測裝置(例如掃描儀)。因此，優選寡核苷酸以直徑10～1000μm的尺寸固定在基板表面。寡核苷酸在基板上的點樣方法沒有特別限定，例如可通過使用點樣機將寡核苷酸溶液點樣在基板上來進行點樣。因此寡核苷酸溶液通常可點樣為大致的圓形。
(2)本發明的細菌檢測方法本發明的細菌檢測方法是用於檢測、鑑定被檢試料中的細菌的方法，其包括製備被檢試料中的細菌的核酸的核酸製備步驟、以該核酸為模板製備標記探針的探針製備步驟、將根據對象細菌所屬的種或屬特異性序列設計的寡核苷酸與上述標記探針進行雜交的雜交步驟、檢測雜交信號的信號檢測步驟。本檢測方法的雜交步驟優選使用上述本發明的細菌檢測器具。通過使用該細菌檢測器具，可簡便、快速且準確地進行全面的檢測、鑑定。此外，本檢測方法的被檢試料優選食品，特別優選麥芽酒精飲料。下面將分別對各步驟詳細說明。
其為製備被檢試料中的細菌的核酸的步驟。從被檢試料中製備核酸的製備方法，可以適當選擇並使用公知的核酸製備方法。例如製備DNA時，可以根據R-F.Wang介紹的方法進行提取(Molecular and Cellular Probes(2000)14，1-5)。該方法為標準的製備方法，但還有多種替代方法，可以採用任一種方法。此外，也可以使用市售的試劑盒。
其為以上述核酸製備步驟所製備的核酸為模板製備標記探針的步驟。例如可使用設計成含有捕獲性寡核苷酸及陽性對照捕獲性核苷酸的鹼基序列的引物，通過核酸擴增來製作探針。作為核酸擴增的方法，例如可以為通過PCR擴增DNA的方法，或者應用體外轉錄法(in vitro transcription)擴增RNA的方法，但並不僅限於這些方法。
例如通過PCR製備標記探針時，設計PCR使用的引物時使探針含有與捕獲性寡核苷酸及陽性對照捕獲性寡核苷酸互補的鹼基序列。此外，只要能夠雜交，探針可以比捕獲性寡核苷酸及陽性對照捕獲性寡核苷酸長，也可比其短。為了得到標記探針，可預先標記PCR使用的引物。此外也可通過預先標記PCR的基質(脫氧核苷酸三磷酸dNTP)得到標記探針。或者也可在PCR結束後標記探針。標記物質沒有特別限定，例如可以使用與螢光物質、半抗原、放射性物質等通常雜交使用的探針相同的標記物質。具體來說，螢光物質可以為異硫氰酸螢光素(FITC)、羅丹明(Rodamine)、藻紅素(phycoerythrin)(PE)、德州紅(Texas Red)、矢車菊雙甙(cyanin)類蛍光色素等，半抗原可以為生物素(BIOTIN)、地高辛(Digoxigenin)(Dig)、二硝基苯酚(DNP)、螢光素(fluorescein)等。
雜交步驟是根據對象細菌所屬的種或屬特異性鹼基序列設計的寡核苷酸和上述標記探針進行雜交的步驟。雜交可以在固定有上述寡核苷酸的薄膜上等進行，但優選使用本發明的細菌檢測器具。通過使用該細菌檢測器具，可以簡便、快速且準確地進行全面的檢測、鑑定。雜交步驟使用的方法沒有特別限定，可以適當選擇並使用公知的核酸雜交方法。下面所示的是一例具體雜交方法。
在含有SSC(Standard Saline Citrate)等鹽溶液、十二烷基硫酸鈉(SDS)等表面活性劑、牛血清白蛋白(BSA)等阻斷溶液、以及促進融合反應的添加劑的融合液中，加入標記探針。當探針為2條鏈時，通過加熱等進行變性。在基板上加數μl標記探針液後，進行數小時的加熱操作(通常37℃～50℃)，在基板上固定的寡核苷酸和標記探針之間可以雜交。然後在基板上加5×SSC或3M四甲基氯化銨進行加熱(通常37℃～50℃)，從基板上除去沒有形成特異性雜交的標記探針，只有特異性雜交選擇性地留在基板上。
信號檢測步驟是判斷上述雜交步驟是否發生雜交的步驟，通常與上述雜交步驟連續進行。
雜交檢測步驟使用的方法，取決於上述探針製備步驟所製備的探針中導入的標記物質。即、檢測雜交時要使用在探針中導入的螢光物質、半抗原等標記物質。因此，適當選擇使用用於檢測使用的探針中所導入的標記物質的公知方法即可。
例如，使用半抗原時，在基板上加含有識別半抗原的蛋白質或與其結合的蛋白質、鹼性磷酸酯酶或辣根過氧化物酶等的結合體(酶結合物)的溶液，室溫下使反應進行數10分鐘。此外，在該半抗原和酶結合物進行結合反應之前，在固定有寡核苷酸的區域以外的基板區域使用酪蛋白等蛋白質將其完全覆蓋，因此可以阻止酶結合物和基板的非特異性吸附反應。該過程可通過下述方式進行，即、將寡核苷酸固定後在基板上加酪蛋白等蛋白質溶液，室溫下放置數十分鐘。酶結合物和探針中的半抗原的結合反應結束後，用含有表面活性劑的適當緩衝液將沒有與半抗原結合的酶結合物清洗、衝掉。因此，基板上僅留下與探針中的半抗原結合的酶結合物。
為使雜交可視化，僅在半抗原與酶結合物存在的情況下，添加僅可形成不溶化合物的化合物。該不溶化合物的生成通過酶反應可擴增並可視化。作為添加的化合物，當酶結合物中的酶是鹼性磷酸酯酶時，可使用硝基四氮唑藍(NBT)和BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-對甲苯胺鹽)，當酶是辣根過氧化物酶時，可使用TMB(3，3』，5，5』四甲基聯苯胺)。
通過觀察已固定捕獲性寡核苷酸的位置的雜交色素沉澱或螢光顯色等雜交信號，判斷被檢試料中含有的細菌種類。即、已檢測出雜交信號時，表示與該信號位置點樣的寡核苷酸所對應的細菌存在於被檢試料中。此外，如果在陽性對照捕獲性寡核苷酸的位置發現信號，可以確認本試驗正常進行；如在陰性對照捕獲性寡核苷酸的位置沒有發現信號，可以確認雜交在合適條件下進行。
(3)本發明的細菌檢測試劑盒本發明的細菌檢測試劑盒，是用於實施上述本發明的細菌檢測方法的試劑盒。因此，只要能夠實施本發明的細菌檢測方法，試劑盒內包含的結構沒有特別限定。
本細菌檢測試劑盒，優選包含本發明的細菌檢測器具，使其成為包含該細菌檢測器具的試劑盒，可以簡便、快速且準確地進行全面的檢測、鑑定。此外，本細菌檢測試劑盒中優選包含上述雜交步驟及信號檢測步驟使用的試劑。作為上述雜交步驟使用的試劑，例如可以為SSC(Standard SalineCitrate)等鹽溶液、十二烷基硫酸鈉(SDS)等表面活性劑、牛血清白蛋白(BSA)等阻斷溶液以及用以促進融合反應的添加劑等。作為信號檢測步驟使用的試劑，例如可以為識別半抗原的蛋白質與酶的結合體(酶結合物)、NBT、BCIP、TMB等顯色基質等，但並不限於這些物質，選擇適合目的的適當試劑構成試劑盒即可。
本細菌檢測試劑盒中，優選包含上述探針製備步驟使用的試劑，並且還優選包含上述核酸製備步驟使用的試劑。作為探針製備步驟使用的試劑，例如可以為PCR用緩衝液、耐熱性DNA合成酶、脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)混合液等。作為核酸製備步驟使用的試劑，可以為溶菌用緩衝液、DNA回收用柱子、DNA提取用緩衝液等。但並不限於這些物質，選擇適合目的的適當試劑構成試劑盒即可。
通過使用本發明的試劑盒(包含本發明的細菌檢測器具及各步驟中使用的試劑)，收到被檢試料後約6小時即可檢測、鑑定被檢試料中含有的細菌。
(4)本發明的用途本發明的細菌檢測器具、細菌檢測方法及細菌檢測試劑盒的用途沒有特別限定，可在所有需要判斷細菌的用途中使用。具體來說，適合應用於如因細菌汙染而對質量造成大的影響的各種工業製品的製造工程，從該工業製品、其製造環境等中分離出的細菌需要快速且準確地檢測、鑑定的情況。
作為判斷對象的被判斷細菌的來源的上述工業製品，代表性物質可以是食品、飲料、醫藥品、試劑、醫藥部外用品、一次性醫療器具等，沒有特別限定。本發明優選應用於上述例舉的工業製品中的食品。作為食品，更加具體地說，可以為麵包、和洋點心(包括冷凍點心)、成品菜食品、乳製品、穀類食品、豆腐、油炸豆腐類、面類、盒飯類、調味料、小麥粉、食肉等農產加工品、營養補助食品(supplement等)、長期保存食品(罐頭、冷凍食品、乾餾食品等)等，沒有特別限定。
本發明特別優選應用於上述例舉的食品中的麥芽酒精飲料。作為麥芽酒精飲料，可以為啤酒、發泡酒等，沒有特別限定。
實施例[寡核苷酸的合成]根據規定方法，使用寡核苷酸合成機(Perkin-elmer Applied biosystems公司制)合成寡核苷酸，經脫保護後進行乾燥。使用10mM Tris-HCl(pH7.5)·1mM EDTA緩衝液溶解該寡核苷酸乾燥體，製成100pmol/μL的寡核苷酸溶液。本實施例中使用的所有寡核苷酸均用該方法合成。合成的寡核苷酸的鹼基序列用序列號1～72表示，其中序列號1～64、71及72是捕獲性寡核苷酸，序列號65是檢測對象細菌的陽性對照捕獲性寡核苷酸，序列號66是陰性對照捕獲性寡核苷酸，序列號67～68是引物，序列號69是對照探針，序列號70是對照探針的陽性對照捕獲性寡核苷酸。對於捕獲性寡核苷酸，使用上述合成機使氨基結合在5』末端，引物則是使生物素結合在5』末端。
對於10μL的5』末端具有氨基的寡核苷酸溶液，混合10μL微點樣溶液(TeleChem International Inc.制)，分注於微孔板(Greiner LaboratoryInc制)上。在規定的點樣位置放置碳化二亞胺樹脂處理的載玻片Carbostation(日清紡織株式會社制)，使點樣機工作。點樣結束後，將載玻片置於熱水的蒸氣中數秒時間，然後照射600mJ紫外線。再次在蒸氣中暴露數秒時間，然後將載玻片置於加熱板上除去水分。將載玻片放入含有3％BSA(牛血清白蛋白)的100mM Tris-HCl(pH7.5)·100mM NaCl·0.1％Triton X-100中室溫下浸漬30分鐘，進行阻斷。然後用緩衝液10mM Tris-HCl(pH7.5)·1mM EDTA清洗。室溫下乾燥載玻片，使用前一直以乾燥狀態保存於冷暗處。圖1(a)表示本實施例中實際使用的細菌檢測器具的基板上固定的寡核苷酸的排列位置。
作為檢體使用的細菌是14種乳酸桿菌屬、5種片球菌屬、1種鏈球菌屬、1種明串珠菌屬、3種巨球形菌屬、2種梳狀菌屬、2種發酵單胞菌屬、1種腸球菌屬、1種乳球菌屬的共計30種細菌。表5表示作為檢體使用的細菌。


使用Genomic DNA Purif.Kit(EdgeBioSystems制、Cat.No.#85171)，從在最適合所述各細菌的培養條件下培養的各菌液中分別製備各細菌的基因組DNA。
以得到的各細菌的DNA為模板通過PCR製備核酸探針。PCR反應液的組成為，Taq聚合酶1unit、生物素化引物(序列號68和69)各10pmol、反應用緩衝液(10×)5μL、dNTP各10nmol、模板DNA在100ng中加入滅菌蒸餾水使總量為50μL。使用熱循環器，95℃保持3分鐘後，95℃30秒、55℃15秒、72℃1分鐘的反應循環30次，72℃保持5分鐘結束反應。
此外，設計引物序列相同而與對象細菌的序列不同的人工序列，以此作為對照探針。將其作為模板進行PCR反應，製備生物素化對照探針。PCR反應液的組成除使模板DNA為1ng外其他與上述相同。此外，反應溫度和循環數與上述相同。不精製探針，直接將PCR反應液作探針溶液在下述雜交步驟中使用。
將3μL上述核酸探針溶液、1μL生物素化對照探針溶液、16μL ArrayItUnihyb Hybridization Solution(TeleChem International Inc.制)加在一起並混合，100℃加熱處理1分鐘後在冰中浸漬5分鐘。取全量該核酸探針溶液，加在固定有捕獲性寡核苷酸的基板上，在其上面放置蓋玻片。將其放入保溼箱，在設定37℃的恆溫器中靜置120分鐘。取出基板，快速浸入室溫下的2×SSC溶液(2×SSC0.033M NaCl、0.033M枸櫞酸鈉)中並除去蓋玻片，在保持溫度為37℃的2×SSC中浸漬5分鐘。
從2×SSC中取出基板，放入離心機(Beckman公司制)內，以2000rpm離心1分鐘，接著使用VECTASTAIN Elite ABC kit(VECTOR公司制)，製作卵白素-生物素化過氧化物酶複合體，在基板上滴1.4mL，室溫靜置30分鐘。然後在PBS(10mM磷酸鈉(pH7.5)、0.9％氯化鈉)中清洗。使用TMB substratekit for peroxidase(VECTOR公司)製備顯色溶液，在基板上滴1.4mL室溫靜置30分鐘。用蒸餾水清洗基盤停止顯色反應。
使用愛普生公司製造的掃描儀GT-8700F及其透光單元，用600dpi掃描已進行雜交的區域，用目視來確認掃描圖像有無顯色。圖1(b)表示作為掃描圖像的一例的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的掃描圖像。此外，圖1(a)表示基板上的寡核苷酸的排列位置。
作為檢體使用的30種細菌的結果如表6～35所示。各表中「○」表示確認的顯色點，「-」表示沒有確認的顯色點。表6～35所示的全部結果顯示，對照探針在與其相對應的陽性對照捕獲性寡核苷酸(序列號70)處顯色，此外，在陰性對照捕獲性寡核苷酸處沒有顯色，可以確認擴增及雜交步驟均正常進行。此外確認所有細菌的陽性對照捕獲性寡核苷酸(序列號65)處均顯色，因此可以確認從細菌中製備的核酸得到了擴增。此外，在下述結果的說明中不包括陽性對照捕獲性寡核苷酸(序列號65和70)的顯色。
表6表示Lactobacillus brevis的結果，確認Lactobacillus brevis在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號1)的1處和在Lactobacillus brevis檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號7、8、9、71)的4處，合計僅5處顯色(參照圖1)。確認Lactobacillus curvatus(表8)在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號5)的1處和Lactobacilluscurvatus檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號13、14)的2處，合計僅3處顯色。確認Lactobacillus coryniformis(表7)、Lactobacillusdelbrueckii(表9)、Lactobacillus lindneri(表11)及Lactobacillusmalefermentans(表12)，在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號1～6)的6處中的任何1處和各細菌對應的種特異性捕獲性寡核苷酸的3處，合計僅4處顯色。
確認Lactobacillus fermentum(表10)在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號6)的1處、部分Leuconostoc屬及部分Lactobacillus屬的檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號72)的1處、Lactobacillus fermentum檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號19～21)的3處，合計僅5處顯色。確認Lactobacillus casei(表13)在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號3、4)的2處、Lactobacillus casei檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號28、29)的2處，合計僅4處顯色。確認Lactobacillusrhamnosus(表14)在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號3、4)的2處、Lactobacillus rhamnosus檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號32、33)的2處，合計僅4處顯色。確認Lactobacillus buchneri(表15)在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號1)的1處、Lactobacillus buchneri檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號34、35)的2處，合計僅3處顯色。確認Lactobacillus zeae(表19)在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號3、4)的2處、Lactobacillus zeae檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號30、31)的2處，合計僅4處顯色。
此外，確認沒有設計種特異性捕獲性寡核苷酸的Lactobacillusplantarum(表16)及Lactobacillus sakei(表18)，僅在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號1～6)的6處中任何1處顯色。確認Lactobacillus psittaci(表17)在Lactobacillus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號6)的1處和部分Leuconostoc屬及部分Lactobacillus屬的檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號72)的1處，合計僅2處顯色。
確認Pediococcus damnosus(表20)、Pediococcus acidilactici(表21)、Pediococcus claussenii(表22)、Pediococcus dextrinicus(表23)及Pediococcus urinaeequi(表24)僅在Pediococcus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號36～45)的10處中的任何2處顯色。
確認Streptococcus alactolyticus(表25)僅在Streptococcus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號46、47)的2處顯色。
確認Leuconostoc mesenteroides(表26)在Leuconostoc屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號48、49)的2處、部分Leuconostoc屬及部分Lactobacillus屬的檢測用捕獲性寡核苷酸(配列番號72)的1處，合計僅3處顯色。
確認Megasphaera cerecisiae(表27)、Megasphaera elsdenii(表28)及Megasphaera micronuciformis(表29)在Megasphaera屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號50～55)的6處中的任何2處顯色。
確認Pectinatus cerevisiiphils(表30)及Pectinatus frisingensis(表31)在Pectinatus屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號56～58)的3處中的任何2處顯色。
確認Zymomonas mobilis(表32)及Zymomonas pomaceae(表33)，僅在Zymomonas屬檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號59、60)的2處顯色。
確認Enterococcus durans(表34)僅在Enterococcus durans檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號61、62)的2處顯色。
確認Lactococcus lactis(表35)僅在Lactococcus lactis檢測用捕獲性寡核苷酸(序列號63、64)的2處顯色。
上述結果顯示，對於作為檢體使用的各細菌，僅在固定有各細菌的特異性捕獲性寡核苷酸的位置顯色，均沒有非特異性顯色。因此可以確認本實施例製作的細菌檢測器具能夠特異性地檢測Lactobacillus屬、Pediococcus屬、Streptococcus屬、Leuconostoc屬、Megasphaera屬、Pectinatus屬、Zymomonas屬，並且確認其為能夠種特異性地檢測Lactobacillus brevis、Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus curvatus、Lactobacillusdelbrueckii、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus malefermentans、Lactobacillus casei(包括Lactobacillusparacasei)、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus zeae(包括Lactobacillus casei的標準株)、Enterococcusdurans及Lactococcus lactis的細菌檢測器具。
被檢細菌Lactobacillus brevis
被檢細菌Lactobacillus coryniformis
被檢細菌Lactobacillus curvatus

被檢細菌Lactobacillus delbrueckii

被檢細菌Lactobacillus fermentum
被檢細菌Lactobacillus lindneri
被檢細菌Lactobacillus malefermentans
被檢細菌Lactobacillus casei
被檢細菌Lactobacillus rhamnosus
被檢細菌Lactobacillus buchneri
被檢細菌Lactobacillus plantarum
被檢細菌Lactobacillus psittaci
被檢細菌Lactobacillus sakei
被檢細菌Lactobacillus zeae
被檢細菌Pediococcus damnosus
被檢細菌Pediococcus acidilactici
被檢細菌Pediococcus claussenii
被檢細菌Pediococcus dextrinicus
被檢細菌Pediococcus urinaeequi
被檢細菌Streptococcus alactolyticus
被檢細菌Leuconostoc mesenteroides
被檢細菌Megasphaera cerevisisae
被檢細菌Megasphaera elsdenii
被檢細菌Megasphaera micronuciformis
被檢細菌Pectinatus cerevisiiphilus
被檢細菌Pectinatus frisingensis
被檢細菌Zymomonas mobilis
被檢細菌Zymomonas pomaceae
被檢細菌Enterococcus durans
被檢細菌Lactococcus lactis

此外，在用於實施本發明的優選方式項中的具體實施方式
或實施例，只不過是使本發明的技術內容更明確的部分，而不應該狹義地理解為僅限於這些具體例，只要是在本發明的精神和所述的權利要求書的範圍內，可以實施各種變更。
本發明的細菌檢測器具，根據對象細菌所屬的種或屬特異性鹼基序列設計的寡核苷酸固定在基板表面，通過該寡核苷酸和來源於被檢試料的核酸進行雜交，可以檢測、鑑定被檢試料中的細菌。因此，根據本發明產生的效果是能夠準確且簡便地檢測、鑑定細菌。
此外，如果在基板表面固定多數根據細菌種或屬特異性鹼基序列設計的寡核苷酸，則可產生能夠進行全面檢查的效果。
本發明的細菌檢測試劑盒，因為含有上述細菌檢測器具及必要的試劑，所以可產生提高操作性、更加簡便地檢測、鑑定細菌的效果。
本發明可以在食品製造業、飲食產業、藥品產業等的衛生管理、過程管理、質量管理方面利用。
序列表110三得利株式會社(Suntory Limited)日清紡織株式會社(Nisshinbo Industries Inc.)120細菌檢測器具、細菌檢測方法及細菌檢測試劑盒(Bacteria detectinginstrument，bacteria detecting method，and bacteria detecting kit)130SU0501150JP 2004-0505231512004-02-2516072170PatentIn Ver.2.1210121113212DNA213乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)4001gcgaactggt gag 13210221116212DNA213乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)4002aaggcaatga tgcgta 16210321116212DNA
213乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)4003aactgagagg ttgatc 16210421117212DNA213乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)4004ccttaagtgg gggataa 17210521116212DNA213乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)4005atagtaactg atcagg 16210621114212DNA213乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)4006aggcgatgat gcat142107
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212DNA213Lactobacillus lindneri40022agagcaactg ctcacgg 172102321117212DNA213Lactobacillus lindneri40023gcttgacgat agatctg 172102421117212DNA213Lactobacillus lindneri40024gcttttatgc tatcgct 172102521119212DNA213Lactobacillus malefermentans40025catcccgttg atttgaagt 1921026
21120212DNA213Lactobacillus malefermentans40026actgataatt aacatcggat 202102721114212DNA213Lactobacillus malefermentans40027ttggatagac ccgc142102821117212DNA213乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)40028cgagattcaa catggaa 172102921121212DNA213乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)40029agttctcgtt gatgatcggt g21
2103021116212DNA213乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)40030gagattcgac ttaaaa 162103121117212DNA213乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)40031ttttggtcga tgaacgg 172103221119212DNA213鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)40032gttctgatta ttgaaaggt 192103321120212DNA213鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)40033
atcttgattt aattttgaac 202103421117212DNA213布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)40034cgcgtctccg ttaatga 172103521120212DNA213布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)40035aaagatttaa cattgagacg 202103621116212DNA213片球菌屬(Pediococcus sp.)40036tttagggtcg taaaac 162103721121212DNA213片球菌屬(Pediococcus sp.)
40037accgtataac agagaaaacc g212103821118212DNA213片球菌屬(Pediococcus sp.)40038tatttggtag taactggc182103921121212DNA213片球菌屬(Pediococcus sp.)40039gcatggaagg agattgaaag a212104021120212DNA213片球菌屬(Pediococcus sp.)40040ttccgttaaa agaatcagaa 202104121116212DNA
213片球菌屬(Pediococcus sp.)40041ctgctcatgc agtgac 162104221117212DNA213片球菌屬(Pediococcus sp.)40042gagattttaa cacgaag 172104321115212DNA213片球菌屬(Pediococcus sp.)40043ttgcacggaa gatga 152104421117212DNA213片球菌屬(Pediococcus sp.)40044agtcttgacg gtatctt 172104521117212DNA
213片球菌屬(Pediococcus sp.)40045gtgcttgcac caactga 172104621116212DNA213鏈球菌屬(Streptococcus sp.)40046atggacctgc gttgta 162104721115212DNA213鏈球菌屬(Streptococcus sp.)40047acgcgtaggt aacct 152104821113212DNA213明串珠菌屬(Leuconostoc sp.)40048gtgtgatgaa ggc 132104921116
212DNA213明串珠菌屬(Leuconostoc sp.)40049cggtaccata ccagaa 162105021118212DNA213巨球形菌屬(Megasphaera sp.)40050aaaagatggc cactgaat182105121118212DNA213巨球形菌屬(Megasphaera sp.)40051ggaggctctt cggagctt182105221119212DNA213巨球形菌屬(Megasphaera sp.)40052ccgaaagtcg catgactgg 1921053
21117212DNA213巨球形菌屬(Megasphaera sp.)40053tggtcaatac ccatacg 172105421119212DNA213巨球形菌屬(Megasphaera sp.)40054tacccataag aagtgacgg 192105521116212DNA213巨球形菌屬(Megasphaera sp.)40055cctgcccttc agatgg 162105621116212DNA213梳狀菌屬(Pectinatus sp.)40056tgacggtacc ctgtta 1621057
21120212DNA213梳狀菌屬(Pectinatus sp.)40057gtagtgttaa taccactatt 202105821120212DNA213梳狀菌屬(Pectinatus sp.)40058ctatagccaa taagtatagt 202105921117212DNA213發酵單胞菌屬(Zymomonas sp.)40059gaataactag gggaaac 172106021117212DNA213發酵單胞菌屬(Zymomonas sp.)40060gagctaatac cgtatga 1721061
21118212DNA213耐久腸球菌(Enterococcus durans)40061aaagaaaagg agtggcga 182106221119212DNA213耐久腸球菌(Enterococcus durans)40062acgctttttc tttcaccgg 192106321118212DNA213乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)40063aaggttggta cttgtacc 182106421118212DNA213乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)40064actggatgag cagcgaac 1821065
21115212DNA213人工序列(Artificial Sequence)220
223人工序列的描述人工合成的陽性對照捕獲性寡核苷酸(Descriptionof Artificial SequenceArtificially Synthesized Positive ControlCaptuer Oligonucleotide)40065actcctacgg gaggc 152106621118212DNA213人工序列(Artificial Sequence)220
223人工序列的描述人工合成的陰性對照捕獲性寡核苷酸(Descriptionof Artificial SequenceArtificially Synthesized Negative ControlCaptuer Oligonucleotide)40066ctaatcggct tagcgtag 182106721119212DNA213人工序列(Artificial Sequence)220
223人工序列的描述人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence)40067gagtttgatc ctggctcag 192106821118212DNA213人工序列(Artificial Sequence)220
223人工序列的描述人工合成的引物序列(Description of ArtificialSequenceArtificially Synthesized Primer Sequence)40068gtattaccgc ggctgctg 1821069211100212DNA213人工序列(Artificial Sequence)220
223人工序列的描述人工合成的對照探針序列(Description ofArtificial SequenceArtificially Synthesized Control Probe Sequence)40069gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcatgcc tacctaatcg cgatagcgta 60ggagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 100
2107021120212DNA213人工序列(Artificial Sequence)220
223人工序列的描述人工合成的陽性對照捕獲性寡核苷酸(Descriptionof Artificial SequenceArtificially Synthesized Positive ControlCaptuer Oligonucleotide)40070cctaatcgcg atagcgtagg202107121116212DNA213短乳桿菌(Lactobacillus brevis)40071gggttgacgg tattta162107221115212DNA213明串珠菌屬(Leuconostoc sp.)40072tgcatagccg agttg 1權利要求
1.細菌檢測器具，用於檢測、鑑定被檢試料中的細菌，其特徵在於，對象細菌是從下述(1)～(5)中所述的細菌中選擇的至少2種或2種以上的細菌，根據對象細菌所屬的種或屬特異性鹼基序列設計的寡核苷酸固定在基板表面，通過該寡核苷酸和來源於被檢試料的核酸進行雜交，來檢測、鑑定被檢試料中的細菌。(1)屬於短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的細菌(2)屬於Lactobacillus lindneri的細菌(3)屬於片球菌屬(Pediococcus)的細菌(4)屬於巨球形菌屬(Megasphaera)的細菌(5)屬於梳狀菌屬(Pectinatus)的細菌
2.如權利要求1所述的細菌檢測器具，其特徵在於，所述對象細菌還包括下述(6)～(19)中所述的細菌。(6)屬於乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的細菌(7)屬於鏈球菌屬(Streptococcus)的細菌(8)屬於明串珠菌屬(Leuconostoc)的細菌(9)屬於發酵單胞菌屬(Zymomonas)的細菌(10)屬於Lactobacillus coryniformis的細菌(11)屬於彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)的細菌(12)屬於德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)的細菌(13)屬於發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)的細菌(14)屬於Lactobacillus malefermentans的細菌(15)屬於乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)群的細菌(16)屬於鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)的細菌(17)屬於布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)的細菌(18)屬於耐久腸球菌(Enterococcus durans)的細菌(19)屬於乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的細菌
3.如權利要求2所述的細菌檢測器具，其為根據屬於乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同屬的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號1所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號2所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號3所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號4所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號5所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號6所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
4.如權利要求1或2所述的細菌檢測器具，其為根據短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號7所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號8所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號9所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號71所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
5.如權利要求2所述的細菌檢測器具，其為根據Lactobacilluscoryniformis的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號10所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號11所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號12所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
6.如權利要求2所述的細菌檢測器具，其為根據彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號13所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號14所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
7.如權利要求2所述的細菌檢測器具，其為根據德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號16所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號17所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號18所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
8.如權利要求2所述的細菌檢測器具，其為根據發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號19所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號20所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號21所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
9.如權利要求1或2所述的細菌檢測器具，其為根據Lactobacilluslindneri的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號22所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號23所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號24所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
10.如權利要求2所述的細菌檢測器具，其為根據Lactobacillusmalefermentans的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號25所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號26所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號27所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
11.如權利要求2所述的細菌檢測器具，其為根據乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)群的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號28所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號29所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號30所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號31所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
12.如權利要求2所述的細菌檢測器具，其為根據鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號32所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號33所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
13.如權利要求2所述的細菌檢測器具，其為根據布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號34所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號35所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
14.如權利要求1或2所述的細菌檢測器具，其為根據屬於片球菌屬(Pediococcus)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同屬的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號36所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號37所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號38所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號39所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號40所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號41所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號42所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號43所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號44所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號45所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
15.如權利要求2所述的細菌檢測器具，其為根據屬於鏈球菌屬(Streptococcus)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同屬的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號46所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號47所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
16.如權利要求2所述的細菌檢測器具，其為根據屬於明串珠菌屬(Leuconostoc)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同屬的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號48所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號49所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
17.如權利要求1或2所述的細菌檢測器具，其為根據屬於巨球形菌屬(Megasphaera)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同屬的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號50所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號51所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號52所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號53所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號54所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號55所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
18.如權利要求1或2所述的細菌檢測器具，其為根據屬於梳狀菌屬(Pectinatus)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同屬的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號56所示的鹼基序列的寡核苷酸、含有序列號57所示的鹼基序列的寡核苷酸以及含有序列號58所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
19.如權利要求2所述的細菌檢測器具，其為根據屬於發酵單胞菌屬(Zymomonas)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同屬的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號59所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號60所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
20.如權利要求2所述的細菌檢測器具，其為根據耐久腸球菌(Enterococcus durans)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號61所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號62所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
21.如權利要求2所述的細菌檢測器具，其為根據乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的16S核糖體RNA基因所對應的鹼基序列中的同種的特異性序列設計的寡核苷酸固定在基板表面的細菌檢測器具，其特徵在於，該寡核苷酸是從所述寡核苷酸組中選擇的至少1種或1種以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸組由含有序列號63所示的鹼基序列的寡核苷酸及含有序列號64所示的鹼基序列的寡核苷酸組成。
22.如權利要求1～21中任一項所述的細菌檢測器具，其特徵在於，所述基板表面具有碳化二亞胺基或異氰酸酯基，並且該碳化二亞胺基或異氰酸酯基與所述寡核苷酸或寡核苷酸末端附加的連接子進行反應形成共價鍵。
23.細菌檢測器具，用於檢測、鑑定被檢試料中的細菌，其特徵在於，含有屬於明串珠菌屬(Leuconostoc)的細菌及/或屬於乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的細菌的16S核糖體RNA基因所對應的序列中的序列號72所示的鹼基序列的寡核苷酸固定在基板表面，通過該寡核苷酸和來源於被檢試料的核酸進行雜交，來檢測、鑑定被檢試料中的細菌。
24.細菌檢測方法，其為檢測、鑑定被檢試料中的細菌的方法，其特徵在於，包括製備被檢試料中細菌的核酸的核酸製備步驟、以該核酸為模板製備標記探針的探針製備步驟、使所述探針和權利要求1～23中任一項所述的在細菌檢測器具的基板表面固定的寡核苷酸進行雜交的雜交步驟、檢測雜交信號的信號檢測步驟。
25.如權利要求24所述的細菌檢測方法，其特徵在於，所述被檢試料是食品。
26.如權利要求25所述的細菌檢測方法，其特徵在於，所述食品是麥芽酒精飲料。
27.細菌檢測試劑盒，其用於實施權利要求24～26中任一項所述的細菌檢測方法。
28.細菌檢測試劑盒，其為用於實施權利要求24～26中任一項所述的細菌檢測方法的試劑盒，其特徵在於，包含所述雜交步驟及/或信號檢測步驟使用的試劑。
29.如權利要求28所述的細菌檢測試劑盒，其還包含所述探針製備步驟及/或所述核酸製備步驟使用的試劑。
全文摘要
本發明提供用簡便操作可快速準確地判斷混入被檢試料中的細菌的細菌檢測器具、細菌檢測方法及細菌檢測試劑盒。本發明的細菌檢測器具是微陣列型器具，其中根據對象細菌所屬的種或屬特異性鹼基序列設計的寡核苷酸固定在基板表面。根據從被檢試料中製備的探針和固定在上述基板表面的寡核苷酸是否發生雜交，可簡便、快速且準確地檢測、鑑定被檢試料中的細菌。
文檔編號C12M1/34GK1926245SQ20058000611
公開日2007年3月7日 申請日期2005年2月25日 優先權日2004年2月25日
發明者兒玉由紀子, 畑中一成, 田中幸一, 中川浩子, 守屋彰悟, 小佐野薰 申請人:三得利株式會社, 日清紡織株式會社