胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物及其製備方法和用途的製作方法

2023-06-13 09:41:31

專利名稱：胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉胰高血糖素樣肽-2領域，特別涉及一種胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物及其製備方法和用途。
背景技術：
胰高血糖素樣肽-2(glucagon_like peptide 2，GLP-2)屬於胰高血糖素原衍生肽類(proglucagon-derived peptide, PGDP)，是胰高血糖素原(proglucagon，PG)被激素原轉化酶(prohormone convertase, PC)降解的產物之一，是由33個胺基酸殘基組成的單鏈多肽，分子量3900道爾頓，胺基酸序列在哺乳動物具有高度保守性(Drucker，J. Clin. Endocrinol. Metab. ,2001,86 :1758-1774)。GLP-2由腸道L內分泌細胞合成和釋放，並受攝食、神經和內分泌等因素調節，以進食含碳水化合物和脂肪食物等活動的影響尤為明顯 (Rocca等，Endocrinology，2001，142 :1148-55)。正常成人餐後15分鐘內和1小時後兩個時期，血循環中GLP-2的濃度升高最顯著。GLP-2在腸黏膜組織及血液循環中存在的主要形式是完整的GLP-2，即GLP-2(l-3;3)。GLP-2在人體血循環中的生物半衰期約7分鐘，代謝主要是通過腎臟排洩和腸道刷狀緣上的二醯肽肽酶4 (dip印tidyl ρ印tidaSe-4，DPP-4)水解氨基末端前兩個殘基形成無活性的GLP-2 (2-33)。飼餵缺少DPP-4作用位點的GLP-2類似物的大鼠的腸上皮生長情況明顯好於飼餵天然GLP-2的大鼠，雙側腎臟切除的大鼠血中 GLP-2的清除率明顯低於未切除腎臟大鼠，而GLP-2 0-33)被證實是GLP-2受體(GLP-2R) 的競爭性拮抗劑，能抑制GLP-2和營養誘導的腸黏膜生長Ghin等.Gastroenterology, 2005，128 :1340-53)，說明GLP-2的生物學活性受DDP-4水解、其降解產物拮抗和腎臟清除三者的調節。GLP-2能促進腸黏膜生長，也能加速腸黏膜損傷後的再生修復，其作為腸道保護性藥物的研究與開發具有廣闊的前景，但其半衰期短，在人體血循環中的生物半衰期約7分鐘。替度魯肽(Teduglutide)為DPP-IV抗性的GLP-2肽(其中丙氨酸_2被甘氨酸取代(A2G))，正被NPS !Pharmaceuticals開發用於胃腸疾病(包括短腸症候群、克羅恩氏病和兒科胃腸疾病)的潛在治療。替度魯肽還具有治療與癌症化療相關的黏膜炎和潰瘍性結腸炎的炎性腸病的潛力。然而，由於替度魯肽的分子量低，該肽半衰期不足30分鐘而被快速 清除，需要每日給藥。經聚乙二醇(polyethylene，PEG)共價修飾的蛋白質為PEG化(PEGylation)蛋白質。PEG化蛋白藥物通過增加蛋白質的分子量，可以減少藥物排洩，PEG作為屏障擋住蛋白質分子表面的抗原決定簇[Lee等，Biotechnol Bioeng, 2005,92 (1) :24 ;34]，可減少免疫原性，降低蛋白的體內清除率，PEG作為屏障還可以保護蛋白質不易被蛋白酶水解 [Veronese 等，Drug Discov Today, 2005,10(21) 1451 145]，這些特點均有利於延長蛋白藥物的半衰期。PEG化蛋白質的藥理學性質因它們所修飾的蛋白質的性質、修飾產物的相對分子量不同而不同，且由於蛋白質結構的複雜性，若對蛋白質進行隨機修飾，會出現產物不均一、修飾後蛋白質生物活性減低等缺陷，若要達到生物活性較高，半衰期也很長的效果，需對PEG化反應的條件進行特意篩選和組合。目前，沒有通過PEG化延長胰高血糖素樣肽-2半衰期的報導。另一方面，現有的GLP-2大多為合成的，需要相應的設備與技術，價格昂貴。申請號200610066176. 2，發明名稱重組生產胰高血糖素樣肽_2的方法的發明專利申請提供了一種改進的重組生產胰高血糖素樣肽-2的方法，該申請文件記載了「對GLP-2來說，其分子量較小，僅為3. 9KD，用普通的基因重組表達較困難」，該申請通過設計串聯的3個GLP-2 拷貝克服該問題，實現了基因重組表達GLP-2。然而，該方法表達的融合蛋白通常以包涵體形式存在，需要在變性條件下純化，對GLP-2活性有較大影響；且該方案需要用到溴化氰， 來裂解融合蛋白釋放多肽，溴化氰為劇毒揮發性物質，對研發人員的安全構成威脅，在工業化密閉的GMP車間中，影響尤其大。因此，亟需尋找一種更加簡單、安全的重組生產GLP-2的方法。

發明內容
為了克服上述問題，本發明提供了一種新的胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物。本發明首先提供了一種胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物，所述的胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物是聚乙二醇修飾胰高血糖素樣肽-2得到的，其中每個胰高血糖素樣肽-2上共價結合1個聚乙二醇分子。其中，所述的聚乙二醇為mPEG2-丙醛。其中，所述胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物由下述方法製備1)將胰高血糖素樣肽-2製備成pH為4. 0 6. 0的溶液；2)將步驟(1)製備的胰高血糖素樣肽-2溶液與聚乙二醇反應，所述胰高血糖素樣肽-2與聚乙二醇的摩爾濃度比為1 1 1 10，反應溫度為4 37°C，反應時間為1 20小時；3)分離純化，得到胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物純品。所述步驟(1)中pH為5.0;所述步驟⑵中，胰高血糖素樣肽-2與聚乙二醇的摩爾濃度比為1 2，反應溫度為25°C，反應時間為5小時，還加入終濃度為20mM硼氫化鈉作為催化劑。其中，所述胰高血糖素樣肽-2可使用天然的人高血糖素樣肽_2，也可使用胺基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的胰高血糖素樣肽_2，該胰高血糖素樣肽_2的丙氨酸_2被甘氨酸取代。其中，所述的胰高血糖素樣肽-2可以是市售的，也可是由下述方法製備的a、構建包含編碼硫氧還蛋白、編碼蛋白水解酶識別位點以及編碼胰高血糖素樣肽-2的基因片段表達質粒；b，將步驟a製備的表達質粒導入宿主細胞，並進行誘導表達，得到表達產物，分離純化表達產物，得到硫氧還蛋白-胰高血糖素樣肽-2融合蛋白；C，用蛋白水解酶水解步驟b得到的融合蛋白，純化，即得胰高血糖素樣肽_2。Trx，硫氧還蛋白，是普遍存在於酵母、細菌、動物、植物體內的蛋白質，該蛋白質也是目前常用的G2GLP-2表達宿主例如酵母或大腸桿菌的內源蛋白。該蛋白可在細胞內
5調節蛋白質的摺疊和聚集過程的平衡，Trx能與許多蛋白發生相互作用，增強融合蛋白的溶解性，從而減少了包涵體的形成(Thomas, J.G.等，Appl Biochem Biotechnol. 66 (3) 197-238)。其中，所述的步驟a中，表達質粒是pET3h，編碼蛋白水解酶識別位點以及編碼胰高血糖素樣肽-2基因片段如SEQ ID NO. 2所示，其中蛋白水解酶識別位點為腸激酶識別位點；所述步驟b中，宿主細胞是大腸桿菌；所述步驟c中，蛋白水解酶為腸激酶。pET3h質粒中包含了編碼硫氧還蛋白的基因片段，因此只需將編碼蛋白水解酶識別位點以及編碼胰高血糖素樣肽-2基因片段插入pET3h質粒即可構建得到本發明表達質粒，該基因的上遊還具有His-Tag，便於後續分離純化。本發明還提供了一種製備胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物的方法，它包括如下步驟1)將胰高血糖素樣肽-2製備成pH為4. O 6. O的溶液；2)將步驟(1)製備的胰高血糖素樣肽-2溶液與聚乙二醇反應，所述胰高血糖素樣肽-2與聚乙二醇的摩爾濃度比為1 1 1 10，反應溫度為4 37°C，反應時間為1 20小時；3)分離純化，得到胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物純品。其中，所述步驟⑴中pH為5.0;所述步驟⑵中，胰高血糖素樣肽-2與聚乙二醇的摩爾濃度比為1 2，反應溫度為25°C，反應時間為5小時，還加入終濃度為20mM硼氫化鈉作為催化劑。本發明還提供了一種製備胰高血糖素樣肽-2的方法，它包括如下步驟a、構建包含編碼硫氧還蛋白、編碼蛋白水解酶識別位點以及編碼胰高血糖素樣肽-2基因片段的表達質粒；b，將步驟a製備的表達質粒導入宿主細胞，並進行誘導表達，得到表達產物，分離純化表達產物，得到硫氧還蛋白-胰高血糖素樣肽-2融合蛋白；C，用蛋白水解酶水解步驟b得到的融合蛋白，純化，即得胰高血糖素樣肽_2。其中，所述的步驟a中，表達質粒是pET3h，編碼蛋白水解酶識別位點以及編碼胰高血糖素樣肽-2基因片段如SEQ ID NO. 2所示，其中蛋白水解酶識別位點為腸激酶識別位點；所述步驟b中，宿主細胞是大腸桿菌；所述步驟c中，蛋白水解酶為腸激酶。本發明最後提供了上述胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物在製備胃腸疾病治療藥物中的用途。其中，所述疾病是短腸綜合症、克羅恩氏病、與癌症化療相關的黏膜炎和潰瘍性結腸炎的炎性腸病。本發明通過對PEG化反應條件的優選，得到一種藥效好、半衰期長的胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物，若用於臨床，預計只需每周用藥1-2次，大大減輕了病人的痛苦。 同時，本發明提供的重組生產GLP-2的方法簡單、安全，大大降低製備胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物的成本，應用前景良好。


圖lpET32a(+)質粒圖譜及其多克隆位點序列。
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圖2重組質粒pET-GLP-2中目的基因及其插入位點兩端的序列。1 :Trx序列；2 Kpn I ；3 =EK酶切位點；4 =GLP基因序列；5 終止密碼；6 =HindIII ；7 終止子序列。圖3重組表達GLP-2各步純化樣品的SDS-PAGE電泳分析。圖3中，1 發酵菌體； 2 鎳離子螯合親和層析樣品得到的融合蛋白；3 融合蛋白的腸激酶酶切樣品；4 反相柱層析樣品；5 :Q Sepharose Fast Flow柱層析樣品；M 蛋白質分子量標準，各條帶分子量大小 (單位kDa)標於圖右。 圖4GLP-2與mPEG_ALD20000摩爾比及反應時間對單位點PEG-GLP-2得率的影響圖5反應溫度對單位點PEG-GLP-2得率的影響圖6反應pH對單位點PEG-GLP-2得率的影響圖7PEG-GLP-2 製備的 SDS-PAGE 電泳分析。1 :GLP_2 樣品；2 :GLP_2 的 PEG 化反應樣品；3 純化的PEG-GLP-2樣品；M 為蛋白質分子量標準，各條帶分子量大小分別為 116. 0,66. 2,45. 0,35. 0,25. 0,18. 4,14. 4kDa。圖 8PEG-GLP-2 和 GLP-2 的藥-時曲線圖，1 表示 GLP-2，2 表示 PEG-GLP-2。
具體實施例方式以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實施例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。實施例1GLP-2的重組生產(1)工程菌種的構建丙氨酸-2被甘氨酸取代的GLP-2含有33個胺基酸，胺基酸序列如SEQ IDN0. 1所示，為His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu MET Asn Thr lie Leu AspAsn Leu Ala Ala Arg Asp Phe lie Asn Trp Leu lie Gln Thr Lys lie Thr Asp。依據大腸桿菌密碼子偏愛性，人工合成優化的適合大腸桿菌表達的、5』端有腸激酶識別位點DNA序列(如SEQ ID NO. 2所示)，委託上海生工生物工程技術服務有限公司合成該DNA序列，並將其克隆到表達質粒pET3h (Novagen公司，如圖1所示)中，構建得到重組質粒為pET_GLP_2，其插入序列及其兩端序列如圖2所示。測序結果表明GLP-2基因已正確插入到pET3h中。將鑑定合格的陽性克隆pET-GLP-2質粒轉化入大腸桿菌BL21 (DE3)後，挑取轉化子在5ml含100 μ g/ml Amp的LB培養基(1 %蛋白腖，0. 5%酵母膏，1 % NaCl)中37°C培養過夜，以1/100的體積轉接於50ml含100 μ g/ml Amp的LB培養基中37°C培養。0D600達到0. 5時，加入IPTG到終濃度0. 5mM進行誘導表達，4小時後取樣進行SDS-PAGE電泳。與未誘導的對照相比，誘導後的重組子均有預期分子量20kDa(TrX-GLP-2融合蛋白分子量約為20kDa)左右的表達帶，表達量約為全菌蛋白的25%。選取表達量高且穩定的轉化子作為工程菌，命名為BL21 (DE3) -GLP-2，置甘油中保存。(2)工程菌 BL21 (DE3) -GLP-2 的發酵取表達Trx-GLP-2融合蛋白的工程菌BL21 (DE3) -GLP-2甘油菌種1支(ImL)， 接種到400mL LB培養基(1 %蛋白腖，0. 5 %酵母膏，1 % NaCl)中，37°C，200rpm搖瓶培養 14-16h，得活化種子。取活化種子按10%接種量接於3. 5L TB培養基中(1.2%蛋白腖， 2. 4% 酵母膏，0. 4% 甘油，17mMKH2P04，72mM K2HP04) (5L B. Braun 發酵罐)，37°C 培養 4h。
7然後將此培養液按5%接種量接於70L TB培養基中(100L B. Braim發酵罐)進行發酵，溫度為37°C、pH7. 0、D0彡30%，培養至0D600 = 4.0時開始誘導表達，誘導用的IPTG終濃度為0. 5mM，誘導時間為4h。離心收集菌體。(3)GLP_2 的純化採用連速流離心機(CEPAZ41，B. Braun公司，德國)收集步驟O)中的發酵菌體， 用緩衝液A(10mM PB,500mM NaCl，30mM咪唑，pH8. 0)懸浮，然後用APV-1000高壓勻漿機 (APV Co.丹麥)破菌，將胞內分泌的融合蛋白溶於緩衝液A中，9000rpm離心30min。取上清液依次採用以下方法對GLP-2進行純化1)鎳離子螯合親和層析將高壓勻漿破菌上清液上樣與用緩衝液A平衡的鎳離子螯合親和層析 (Chelating Sepharose Fast Flow, GE Healthcare)柱，緩衝液 A 充分洗滌後，用緩衝液 BdOmM PB,500mM NaCl，200mM咪唑，pH8. 0)洗脫，收集洗脫峰，得到融合蛋白樣品。2)融合蛋白的酶切上述融合蛋白經超濾脫鹽後，配製酶切反應液，其組成如下lmg/mL融合蛋白， 50mM Tris-HCl (pH8. 0)，ImM CaC12，腸激酶(按IU腸激酶切割5mg融合蛋白的比例加入腸激酶)。25°C酶切20小時。3)鎳離子螯合親和層析將酶切後蛋白溶液上樣於用緩衝液C (50mM Tris-HCl, pH8. 0)平衡的鎳離子螯合親和層析柱，收集穿透液。4)反相柱層析選用反相柱Source 15RPC(GE Healthcare)對步驟3得到的穿透液進行精細純化，用對-64%乙腈作梯度洗脫，收集含GLP-2的洗脫峰，純度達到98%以上。5)陰離子交換柱層析將反相柱洗脫的樣品用緩衝液D(10mM PB，pH7. 0)稀釋後，上於經緩衝液D平衡的 Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare)層析柱，緩衝液 D 充分洗滌後，用含 400mM NaCl 的緩衝液D洗脫，得到純度大於99%的GLP-2蛋白。用SDS-PAGE電泳分析各步純化效果見圖3，由該圖可知，表達的Trx_GLP_2融合蛋白經過鎳離子螯合親和層析、腸激酶酶切、鎳離子螯合親和層析、反相層析及離子交換層析步驟的分離純化後，得到了 GLP-2純品。本發明將重組表達得到GLP-2與親水性的Trx連接的融合蛋白，該融合蛋白在胞內以可溶形式表達，避免了工藝複雜且收率較低的包涵體復性步驟。同時，融合蛋白N 端含His-Tag，可以通過Ni2+鰲和的親和層析快速、簡便、高效地純化，大大提高了回收率。Trx與GLP-2間存在腸激酶切割位點，保證純化的融合蛋白經腸激酶切割可以釋放完整的G2GLP-2。採用腸激酶將表達出的融合蛋白酶解，並利用一系列的柱層析將目的蛋白 G2GLP-2純化出來，純度可達到99%以上。實驗證明，本發明生產GLP-2的方法簡單、安全，大大降低了製備胰高血糖素樣肽-2的生產成本。實施例2GLP-2的PEG化參數優選實驗根據有關文獻(如Kinstler 等 J. Pharm. Res. 1996，13 :996)，影響 PEG 試劑對蛋白的專一性反應的因素包括PEG試劑與蛋白質的摩爾比、反應時間、反應溫度、pH值、蛋白質的摩爾濃度等。以文獻為依據，對有關參數進行了優化l)GLP-2與mPEG-ALD20000摩爾比及反應時間的影響反應混合液組成0. IM醋酸鈉緩衝液(pH5. 0)，GLP-2濃度2mg/ml， 20mM催化劑硼氫化鈉(NaBH3CN，Sigma)，分別按摩爾濃度比1 10、1 5、1 2、 1 1 (GLP-2 mPEG-ALD20000)加入修飾劑，mPEG2-ALD(mPEG2-丙醛)試劑購自北京鍵凱
科技有限公司。25°C下輕輕震蕩反應，第1、2、5、10、15、20小時取樣。用2M HCl調pH至2. 0終止反應。採用SDS-PAGE電泳，用Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像系統掃描分析單位點PEG 的量，即結合了一個PEG分子的PEG-GLP-2的量，結果如圖4所示。由圖4可知，反應時間為 5小時時，單位點PEG-GLP-2得率最高，在GLP-2與mPEG-ALD20000摩爾比1 2和1 10 時，單位點PEG-GLP-2得率均較高，但是GLP-2與mPEG-ALD20000摩爾比為1 10時，PEG 化產品中含有多位點的PEG-GLP-2 (即結合了多個PEG分子的PEG-GLP-2)，不利於分離純化得到均一的PEG-GLP-2純品。2)反應溫度試驗反應混合液組成0. IM醋酸鈉緩衝液pH為5. 0，GLP-2濃度ang/ml，20mM催化劑硼氫化鈉，GLP-2 mPEG-ALD20000 = 1 2。置於4°C、25°C、37°C輕輕震蕩反應，分別在3、5、10小時取樣。用2MHC1調pH至
2. 0終止反應。採用SDS-PAGE電泳，用Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像系統掃描分析單位點PEG 的量，結果如圖5所示。由圖5可知，25 °C反應5小時，或37 °C反應3小時，單位點PEG-GLP-2 得率均較高，但是考慮到PEG-GLP-2的穩定性，反應條件優選25V反應5小時。3)pH影響試驗反應混合液組成0. IM醋酸鈉緩衝液，GLP-2濃度ang/ml，20mM催化劑硼氫化鈉， GLP-2 mPEG-ALD20000 =1:2。其中，醋酸鈉緩衝液調pH分別為4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0。25°C反應5小時，用2M HCl調pH至2.0終止反應。 採用SDS-PAGE電泳，用Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像系統掃描分析單位點PEG 的量，結果見圖6。由圖6可知，pH5. 0時，單位點PEG-GLP-2得率最高。實驗證明在pH為5. 0，反應溫度為25°C，反應時間為^i，GLP_2與mPEG_ALD20000 摩爾比為1 2是生產得PEG-GLP-2的最佳反應條件，產品得率高，均一程度高、活性高。實施例3GLP-2的PEG化及其產物的純化本發明GLP-2可以是未經修飾的人胰高血糖素樣肽_2，也可是胺基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的胰高血糖素樣肽-2，該胰高血糖素樣肽-2的丙氨酸-2被甘氨酸取代。同時，該GLP-2可以是市售的，也可由實施例1的方法製備得到。用0. 2M pH5. 0的醋酸鈉緩衝液溶解實施例1製備的GLP-2凍幹樣品，至終濃度 2mg/ml。按摩爾濃度比 1 2 (GLP-2 mPEG_ALD20000)加入修飾劑，mPEG2_ALD (mPEG2_ 丙醛)試劑購自北京鍵凱科技有限公司。加入催化劑硼氫化鈉(NaBH3CN，Sigma)至終濃度
920mM，攪拌溶解，25°C下反應5小時。用2M HCl調pH至2. 0終止反應。硼氫化鈉存在時， 帶醛基的PEG會和伯胺發生還原氨化反應。將反應混合物上樣於經IOmM pH6. 5的PB平衡過的Resourcel5反相柱，用42%的乙腈洗脫2-3CV(柱體積)，再用42-55%乙腈洗脫15CV，最後用100%乙腈洗滌。收集55% 乙腈洗脫峰。最後用Superdex G-25分子篩柱除去乙腈，得到PEG-GLP-2純品。用SDS-PAGE電泳分析各步純化效果見圖7。由圖7可知，使用上述方法製備得到的PEG-GLP-2產品僅結合 1個mPEG2-ALD分子，均一程度高。實驗證明本發明製備得到了均一程度高的PEG-GLP-2純品。實施例4藥效學試驗取6周大的同齡雌性昆明種小鼠(n = 3-4/組)。對照是同齡、同性別(n = 3_4/ 組)動物。GLP-2及實施例3植被得到的PEG-GLP-2分別溶於PBS溶液中。GLP-2每天1次皮下注射，劑量為0. lmg/kg ；PEG-GLP-2每周2次皮下注射，劑量為0. 5mg/kg ；對照為0. 5ml PBS溶液，並在實驗條件下每日1次進行監測。持續用藥1周，注射後14天處死動物，小鼠在處死前禁食1天。將從幽門到盲腸的小腸從腹腔中取出，洗淨稱重。小腸重量變化百分比的計算方法是將以樣品處理的小鼠相對於僅用PBS處理的小鼠的平均腸重量變化除以僅以PBS處理的小鼠的平均腸重量，再將此值乘以100。結果表明，PEG-GLP-2組小腸重量增加68%，GLP-2組小腸重量增加70%，說明 PEG-GLP-2與GLP-2 —樣具有大大增強腸營養活性的作用。實驗證明，上述方法製備得到的胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物的生物活性較高，藥效好，也證明了上述PEG化方法未影響胰高血糖素樣肽-2的活性基團。本發明製備得到的PEG-GLP-2與GLP-2的生物活性和藥效類似，可用於製備治療胃腸疾病的藥物，特別是製備短腸綜合症、克羅恩氏病、兒科胃腸疾病與癌症化療相關的黏膜炎和潰瘍性結腸炎的炎性腸病的藥物。實施例5藥代動力學實驗大鼠靜脈注射125I-標記實施例2製備得到的PEG-GLP-2，劑量為0. 5mg/kg ；靜脈注射125I-標記GLP-2，劑量為0. lmg/kg。不同時間採取血樣，同位素放射性分析。結果見圖 8，PEG-GLP-2終末血漿清除半衰期T1/2為7. 5小時，而GLP-2終末血漿清除半衰期Τ1/2約為 0. 5小時。因此，與GLP-2相比，PEG-GLP-2的半衰期大大延長，若用於臨床，每周只需用藥 1-2次，大大減輕了病人的痛苦。綜上，本發明製備得到了一種藥效好、半衰期長的胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物，若用於臨床，預計只需每周用藥1-2次，大大減輕了病人的痛苦。同時，本發明提供的重組生產GLP-2的方法簡單、安全，大大降低製備胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物的成本，應用前景良好。
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權利要求
1.一種胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物，其特徵在於所述的胰高血糖素樣肽-2 聚乙二醇結合物是聚乙二醇修飾胰高血糖素樣肽-2得到的，其中每個胰高血糖素樣肽-2 上共價結合1個聚乙二醇分子。
2.根據權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物，其特徵在於所述的聚乙二醇為mPEG2-丙醛。
3.根據權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物，其特徵在於由下述方法製備1)將胰高血糖素樣肽-2製備成pH為4.0 6. 0的溶液；2)將步驟(1)製備的胰高血糖素樣肽-2溶液與聚乙二醇反應，所述胰高血糖素樣肽-2與聚乙二醇的摩爾濃度比為1 1 1 10，反應溫度為4 37°C，反應時間為1 20小時；3)分離純化，得到胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物純品。
4.根據權利要求2所述的胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物，其特徵在於所述步驟 (1)中 pH 為 5.0 ；所述步驟O)中，胰高血糖素樣肽-2與聚乙二醇的摩爾濃度比為1 2，反應溫度為 25°C，反應時間為5小時，還加入終濃度為20mM硼氫化鈉作為催化劑。
5.根據權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物，其特徵在於所述胰高血糖素樣肽-2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
6.根據權利要求1所述的胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物，其特徵在於所述的胰高血糖素樣肽-2由下述方法製備a、構建包含編碼硫氧還蛋白、編碼蛋白水解酶識別位點以及編碼胰高血糖素樣肽-2 基因片段的表達質粒；b，將步驟a製備的表達質粒導入宿主細胞，並進行誘導表達，得到表達產物，分離純化表達產物，得到硫氧還蛋白-胰高血糖素樣肽-2融合蛋白；c，用蛋白水解酶水解步驟b得到的融合蛋白，純化，即得胰高血糖素樣肽_2。
7.根據權利要求6所述的胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物，其特徵在於所述的步驟a中，表達質粒是pET3h，編碼蛋白水解酶識別位點以及編碼胰高血糖素樣肽-2基因片段如SEQ ID NO. 2所示，其中蛋白水解酶識別位點為腸激酶識別位點； 所述步驟b中，宿主細胞是大腸桿菌； 所述步驟c中，蛋白水解酶為腸激酶。
8.一種製備胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物的方法，其特徵在於它包括如下步驟1)將胰高血糖素樣肽-2製備成pH為4.0 6. 0的溶液；2)將步驟(1)製備的胰高血糖素樣肽-2溶液與聚乙二醇反應，所述胰高血糖素樣肽-2與聚乙二醇的摩爾濃度比為1 1 1 10，反應溫度為4 37°C，反應時間為1 20小時；3)分離純化，得到胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物純品。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於 所述步驟⑴中pH為5.0;所述步驟O)中，胰高血糖素樣肽-2與聚乙二醇摩爾濃度比為1 2，反應溫度為 25°C，反應時間為5小時，還加入終濃度為20mM硼氫化鈉作為催化劑。
10.一種製備胰高血糖素樣肽-2的方法，其特徵在於它包括如下步驟a、構建包含編碼硫氧還蛋白、編碼蛋白水解酶識別位點以及編碼胰高血糖素樣肽-2 基因片段的表達質粒；b，將步驟a製備的表達質粒導入宿主細胞，並進行誘導表達，得到表達產物，分離純化表達產物，得到硫氧還蛋白-胰高血糖素樣肽-2融合蛋白；c，用蛋白水解酶水解步驟b得到的融合蛋白，純化，即得胰高血糖素樣肽_2。
11.根據權利要求10所述的方法，其特徵在於所述的步驟a中，表達質粒是pET3h，編碼蛋白水解酶識別位點以及編碼胰高血糖素樣肽-2基因片段如SEQ ID NO. 2所示，其中蛋白水解酶識別位點為腸激酶識別位點； 所述步驟b中，宿主細胞是大腸桿菌； 所述步驟c中，蛋白水解酶為腸激酶。
12.權利要求1 7任意一項所述的胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物在製備治療胃腸疾病的藥物中的用途。
13.根據權利要求12所述的用途，其特徵在於所述疾病是短腸綜合症、克羅恩氏病、 與癌症化療相關的黏膜炎和潰瘍性結腸炎的炎性腸病。
全文摘要
本發明提供了一種胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物，所述的胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物是聚乙二醇修飾胰高血糖素樣肽-2得到的，其中每個胰高血糖素樣肽-2上共價結合1個聚乙二醇分子。本發明還提供了上述胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物的製備方法和用途。本發明通過對PEG化反應條件的優選，得到一種藥效好、半衰期長的胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物，若用於臨床，每周只需用藥1-2次，可大大減輕病人的痛苦。同時，本發明提供的重組生產GLP-2的方法簡單、安全，大大降低製備胰高血糖素樣肽-2聚乙二醇結合物的成本，應用前景良好。
文檔編號C07K14/605GK102212127SQ20111012743
公開日2011年10月12日 申請日期2011年5月17日 優先權日2011年5月17日
發明者張文秋, 彭丹妮, 林雯, 肖冬梅 申請人:成都因爾美科技有限公司