一種基因晶片及其檢測方法
2023-05-26 16:32:51 2
專利名稱：一種基因晶片及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及檢測技術領域，尤其涉及的是一種可以快速檢測六種動物源性人獸共患病的基因晶片。
背景技術：
禽流感(Avianinfluenza, Al)、狂犬病(Rabies)、豬鏈球菌 2 型(Streptococcus
suis H , SS2)、炭疽(Anthrax)、沙門氏菌(Salmonella)、大腸桿菌 0157 (Escherichia
coli 0157)是近年來發生較為普遍、與人們生活息息相關的六種動物源性人獸共患病傳染 病，一度給人們的健康和生活帶來了很大的危害。其中江蘇和四川分別於1998年、2005年發生了 SS2大規模流行的公共衛生事件，並造成人員傷亡，近年來在南方各省每年都有散發的病例；香港和臺灣分別於1997年、2004年曾發生高致病性禽流感(HPAI)流行事件，造成數以百萬的禽類遭捕殺且有人感染H5N1死亡的報導；狂犬病作為一種古老的疾病，自報導後每年都有散在病例發生，據報導我國是僅次於印度屬於世界上第二大狂犬病發病國家；沙門氏菌和大腸桿菌主要通過汙染飲水和食物的方式造成群體發病；炭疽芽孢桿菌是食草類動物的一種重要疾病，而人類則可以通過接觸感染動物以及感染動物的肉類、毛革製品感染髮病。
目前針對以上人獸共患病的傳統診斷方法多為病原體的分離培養、生化鑑定、PCR技術、以及相關的血清學實驗，以上診斷方法過程繁瑣，需時較長且準確性不高，對於多血清型、多亞型的細菌和病毒更不能準確的判定出其類別，PCR技術準確性相對較高但是易出現假陽性以及一次只能鑑別少數幾種病原。因此，現有技術還有待於改進和發展。
發明內容
本發明的目的在於提供一種基因晶片及其檢測方法，旨在解決現有的診斷病原的方法過程繁瑣、需時長且準確性不高的問題。本發明的技術方案如下
一種基因晶片，其中，所述基因晶片的基質膜上固定有6種特異性探針；所述特異性探針分別為禽流感病毒探針、狂犬病病毒探針、豬鏈球菌2型探針、炭疽菌探針、沙門氏菌探針、大腸桿菌0157探針。所述的基因晶片，其中，所述禽流感病毒探針序列如SEQ NO. I所示；所述狂犬病病毒探針序列如SEQ NO. 2所示；豬鏈球菌2型探針序列如SEQ NO. 3所示；沙門氏菌探針序列包括3條，分別如SEQ NO. 4 6所示；炭疽芽胞桿菌探針如SEQ NO. 7所示；大腸桿菌0157探針序列包括3條,分別如SEQ NO. 8 10所示。所述的基因晶片，其中，所述特異性探針的5』端標記15-30 Poly T。所述的基因晶片，其中，所述基質膜為矽晶片、玻璃或高分子材料。
上述的基因晶片的製備方法，其中，包括以下步驟
51、在GenBank上分別選取禽流感病毒的Ml基因、狂犬病病毒的NS基因、豬鏈球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞桿菌的CapB基因、沙門氏菌的invA基因和大腸桿菌0157的rfbE基因序列，利用生物信息學軟體Primer Express 2. O設計特異性探針；
52、合成特異性探針；
53、使用DR.Fast Spot晶片點樣儀系統將特異性探針按照預先設計的矩陣點樣，室溫乾燥IOmin ;每份基因晶片均至少包含一個陽性對照和一個陰性對照；
54、用紫外交聯儀照射基因晶片7 10分鐘，照射能量為I.2J，以固定特異性探針，最後依次用Milli-Q水和95%乙醇洗滌，乾燥。所述的基因晶片的製備方法，其中，所述S2步驟還包括在特異性探針的5』端標記15-30 Poly T，以使特異性探針很好固定在基質膜上。 所述的基因晶片的製備方法，其中，所述陽性對照為多聚PolyT，陰性對照為ddH20。使用上述基因晶片的檢測方法，其中，包括以下步驟
51、檢測病原特異性引物設計在GenBank上分別選取禽流感病毒的Ml基因、狂犬病病毒的NS基因、豬鏈球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞桿菌的CapB基因、沙門氏菌的invA基因和大腸桿菌0157的rfbE基因序列，利用生物信息學軟體Primer Express 2. O設計病原特異性引物；並在病原特異性引物對的上遊引物標記生物素biotin ；
52、核酸提取使用DNA/RNA磁珠提取試劑盒提取待測樣品的核酸，獲取下一步核酸擴增用的模板；
53、進行PCR或RT-PCR擴增根據待測樣品的個體和疾病類型，進行不同的檢測項目，並選擇擴增方法和試劑盒；
54、雜交取S3步驟的PCR或RT-PCR擴增的產物各10 20μ L與200 μ L的DR.雜交緩衝液充分混合，沸水變性6min，迅速轉移至冰上IOmin ;將上述混合物轉移至基因晶片室內，平鋪均勻，避免在底部產生氣泡，振動溫箱中雜交45-60 min，雜交溫度為47°C ;棄去雜交液，用DR.洗滌液洗滌三次；於雜交室中加O. 2 μ L Strep-AP和200 μ L封閉液的混合液，室溫反應30min，棄去封閉液，以DR.洗滌液重複洗滌三次，吸除晶片上殘留的水分；
55、顯色每個基因晶片室加4μL他17^(1 和196 4 1^ DR.檢測液的混合液，將晶片置於暗室中反應5-10min，棄去檢測液，用水衝洗至雜交點清晰為止；
56、讀取結果利用晶片反應儀掃描讀取結果。所述的基因晶片的檢測方法，其中，所述S3步驟中，豬鏈球菌2型、炭疽菌、大腸桿菌0157、沙門氏菌，使用TaKaRa PCR Amplification試劑盒，按照試劑盒上的步驟進行 PCR 擴增，反應條件為 94°C 3min,94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s, 72°C 10min，35 個循環；禽流感病毒、狂犬病毒，使用TaKaRa One Step RT-PCR試劑盒，按照試劑盒上的步驟進行 RT-PCR 擴增，反應條件分別為 50°C 30min,94°C 3min,94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s,72°C 10min，35 個循環。本發明的有益效果本發明基因晶片可以特異性檢測禽流感病毒、狂犬病毒、豬鏈球菌2型、炭疽芽胞桿菌、沙門氏菌和大腸桿菌0157六種病原。通過應用於實踐口岸檢疫，本發明所建立的基因晶片方法可以快速、精確、特異性的檢測上述六種動物源性人獸共患病，尤其對於大批量檢疫的出入境檢驗檢疫部門意義顯得尤為突出。
圖I是本發明實施例I中使用本發明基因晶片的檢測結果圖。圖2是本發明實施例2中使用本發明基因晶片的檢測結果圖。圖3是實施例2中使用電泳檢測PCR產物的結果圖。圖4是本發明實施例3中使用本發明基因晶片的檢測結果圖。
具體實施方式
為使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚、明確，以下參照附圖並舉實施例對本發明進一步詳細說明。基因晶片技術是九十年代建立的一種全新的分析檢測技術，是隨著人類基因組計劃的開展而逐步發展起來的。該技術綜合運用了分子生物學技術、集成電路製造技術、計算機技術、半導體技術、共聚焦雷射掃描技術、螢光標記技術，使樣品的檢測具有敏感性高、特異性強、大規模集成化、自動化、操作簡便、快速，高效率等優點。目前已廣泛應用於基因表達譜分析、新基因發現、基因突變及多態性分析、疾病診斷和預測、藥物篩選、基因測序等領域。本發明的目的是提供一種用於檢測包括禽流感、狂犬病、豬鏈球菌2型、炭疽、沙門氏菌、大腸桿菌0157等六種動物源性人獸共患病的基因晶片及其製造方法和使用方法。本發明中所提供的基因晶片及檢測方法經初步應用於口岸檢疫，發現可以快速、精確、特異性的檢測上述六種病原體。本發明中基因晶片分別選取禽流感病毒的Ml基因、狂犬病病毒的NS基因、豬鏈球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞桿菌的CapB基因、沙門氏菌的invA基因和大腸桿菌0157的rfbE基因序列,利用生物信息學軟體Primer Express 2. O設計特異性探針,探針序列如SEQ NO. Γ10 所示。禽流感病毒探針AIV P 序列為 27T-TCAAAGCCGAGATCGCGCA GAGA。狂犬病病毒探針RV P 序列為 25T-TCAGCAATCAGAGTGGGCA CAGTTG。豬鏈球菌2 型探針 SS2 P 序列為 26T-CAATGTTGCCGTCAACAATAT CATCAGA。沙門氏菌探針序列包括3條Sa Pl序列為15T-CTGTTTACCG GGCATACCAT ；Sa P2序列為 15 T-AATACCGGCCTTCAAATCGG ；Sa P3 序列為 15 T-TTCCCTTTCCAGTACGCTTC。炭疽芽胞桿菌探針An P 序列為 28T-TCGGTGAGCAACGCAGGGT AGTTAA。大腸桿菌0157探針序列包括3條015 Pl序列為15T-CAACCATTCC ACCTTCACCT ；0157 P2 序列為 15T-GTGACMCCATTCCACCTTC ；0157 P3序列為 15T-TGTACAGCTAATCCTTGGCC。本發明基因晶片的製備方法的具體步驟如下
SI、設計檢測病原的特異性探針在GenBank上分別選取禽流感病毒的Ml基因、狂犬病病毒的NS基因、豬鏈球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞桿菌的CapB基因、沙門氏菌的invA基因和大腸桿菌0157的rfbE基因序列，利用生物信息學軟體Primer Express 2. O設計特異性探針；52、特異性探針合成由上海超世生物科技公司合成；
53、特異性探針處理在特異性探針的5』端標記15-30Poly T，以使特異性探針很好固定在基質I旲上；基質I旲的材料可以為娃晶片，玻璃或聞分子；
54、點樣將所得特異性探針分別溶於2x探針稀釋液中，混勻後，使用DR.Fast Spot晶片點樣儀系統將特異性探針按照預先設計的矩陣點樣，室溫乾燥IOmin ;每份基因晶片均至少包含一個陽性對照和一個陰性對照；其中，陽性對照為多聚PolyT，陰性對照為ddH20 ；
55、固定紫外交聯儀固定(254nm，I.2J) 7 10分鐘，依次用Milli-Q水(由Milli-Q超純水系統處理得到的超純水)和95%乙醇洗滌，乾燥。
本發明基因晶片的檢測方法的具體步驟如下
SI、PCR 擴增
(1)檢測病原特異性引物設計在GenBank上分別選取禽流感病毒的Ml基因、狂犬病病毒的NS基因、豬鏈球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞桿菌的CapB基因、沙門氏菌的invA基因和大腸桿菌0157的rfbE基因序列，利用生物信息學軟體Primer Express 2. O設計特異性引物；其中每種病原對應引物對的上遊引物標記生物素biotin ；
(2)核酸提取採取DNA/RNA磁珠提取試劑盒對採取的樣品提取核酸，獲取下一步核酸擴增用模板；
(3)PCR和RT-PCR擴增根據待測樣品的個體和疾病類型，進行不同的檢測項目，並選擇擴增方法和試劑盒。豬鏈球菌2型、炭疽菌、大腸桿菌0157、沙門氏菌，使用TaKaRa PCRAmplification試劑盒,按照試劑盒上的步驟進行PCR擴增，反應條件為94°C 3min,94°C30s, 55°C 30s，72°C 40s, 72°C lOmin，35 個循環；禽流感病毒、狂犬病毒，使用 TaKaRa OneStep RT-PCR試劑盒，按照試劑盒上的步驟進行RT-PCR擴增，反應條件分別為50°C 30min,94°C 3min,94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s, 72°C 10min，35 個循環。S2、雜交待測樣品核酸的PCR產物各10 20 μ L與200 μ L的DR.雜交緩衝液(DR.為臺灣晶宇公司所開發的診斷性生物晶片一種產品系列簡稱)充分混合，沸水變性6min，迅速轉移至冰上IOmin ;將上述混合物轉移至晶片室內，平鋪均勻，避免在底部產生氣泡，振動溫箱中雜交45-60 min，雜交溫度為47°C;棄去雜交液，用DR.洗滌液洗滌三次；於雜交室中加0. 2 μ L Strep-AP和200 μ L封閉液的混合液，室溫反應30min，棄去封閉液，以DR.洗滌液重複洗滌三次，吸除晶片上殘留的水分；
53、顯色每個晶片室加4μ L他17^(1 和196 4 1^ DR.檢測液的混合液，將晶片置於暗室中反應5-10min，棄去檢測液，用水衝洗至雜交點清晰為止；
54、讀取結果利用晶片反應儀掃描讀取結果。在以下實施例中，本發明基因晶片中的探針的點樣矩陣如表I所示。其中，點A為陽性對照，點B為陰性對照。
權利要求
1.一種基因晶片，其特徵在於，所述基因晶片的基質膜上固定有6種特異性探針；所述特異性探針分別為禽流感病毒探針、狂犬病病毒探針、豬鏈球菌2型探針、炭疽菌探針、沙門氏菌探針、大腸桿菌0157探針。
2.根據權利要求I所述的基因晶片，其特徵在於，所述禽流感病毒探針序列如SEQNO. I所示；所述狂犬病病毒探針序列如SEQ NO. 2所示；豬鏈球菌2型探針序列如AEQ NO. 3所示；沙門氏菌探針序列包括3條,分別如SEQ NO. 4 6所示；炭疽芽胞桿菌探針如SEQ NO. 7所示；大腸桿菌0157探針序列包括3條,分別如SEQ NO. 8 10所示。
3.根據權利要求I所述的基因晶片，其特徵在於，所述特異性探針的5』端標記15-30Poly T0
4.根據權利要求I所示的基因晶片，其特徵在於，所述基質膜為矽晶片、玻璃或高分子。
5.一種如權利要求I所述的基因晶片的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟 S1、在GenBank上分別選取禽流感病毒的Ml基因、狂犬病病毒的NS基因、豬鏈球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞桿菌的CapB基因、沙門氏菌的invA基因和大腸桿菌0157的rfbE基因序列，利用生物信息學軟體Primer Express 2. O設計特異性探針； S2、合成特異性探針； S3、使用DR.Fast Spot晶片點樣儀系統將特異性探針按照預先設計的矩陣點樣，室溫乾燥IOmin ;每份基因晶片均至少包含一個陽性對照和一個陰性對照； S4、用紫外交聯儀照射基因晶片7 10分鐘，照射能量為I.2J，以固定特異性探針，最後依次用Milli-Q水和95%乙醇洗滌，乾燥。
6.根據權利要求5所述的基因晶片的製備方法，其特徵在於，所述S2步驟還包括在特異性探針的5』端標記15-30 Poly T，以使特異性探針很好固定在基質膜上。
7.根據權利要求5所述的基因晶片的製備方法，其特徵在於，所述陽性對照為多聚PolyT,陰性對照為ddH20。
8.一種使用如權利要求I所述的基因晶片的檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟 S1、檢測病原特異性引物設計在GenBank上分別選取禽流感病毒的Ml基因、狂犬病病毒的NS基因、豬鏈球菌2型的CPS基因、炭疽芽胞桿菌的CapB基因、沙門氏菌的invA基因和大腸桿菌0157的rfbE基因序列，利用生物信息學軟體Primer Express 2. O設計病原特異性引物；並在病原特異性引物對的上遊引物標記生物素biotin ； S2、核酸提取使用DNA/RNA磁珠提取試劑盒提取待測樣品的核酸，獲取下一步核酸擴增用的模板； S3、進行PCR或RT-PCR擴增根據待測樣品的個體和疾病類型，進行不同的檢測項目，並選擇擴增方法和試劑盒； S4、雜交取S3步驟的PCR或RT-PCR擴增的產物各10 20μ L與200 μ L的DR.雜交緩衝液充分混合，沸水變性6min，迅速轉移至冰上IOmin ;將上述混合物轉移至基因晶片室內，平鋪均勻，避免在底部產生氣泡，振動溫箱中雜交45-60 min，雜交溫度為47°C ;棄去雜交液，用DR.洗滌液洗滌三次；於雜交室中加O. 2 μ L Strep-AP和200 μ L封閉液的混合液，室溫反應30min，棄去封閉液，以DR.洗滌液重複洗滌三次，吸除晶片上殘留的水分； S5、顯色每個基因晶片室加4μ L他17^(1 和196 4 1^ DR.檢測液的混合液，將晶片置於暗室中反應5-10min，棄去檢測液，用水衝洗至雜交點清晰為止； S6、讀取結果利用晶片反應儀掃描讀取結果。
9.根據權利要求8所述的基因晶片的檢測方法，其特徵在於，所述S3步驟中，豬鏈球菌2型、炭疽菌、大腸桿菌0157、沙門氏菌，使用TaKaRa PCR Amplification試劑盒，按照試劑盒上的步驟進行PCR擴增，反應條件為94°C 3min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s, 72°ClOmin，35個循環；禽流感病毒、狂犬病毒，使用TaKaRa One Step RT-PCR試劑盒，按照試劑盒上的步驟進行RT-PCR擴增，反應條件分別為50°C 30min,94°C 3min，94°C 30s, 55°C30s, 72°C 40s, 72°C 10min，35 個循環。
全文摘要
本發明公開了一種基因晶片及其檢測方法，本發明利用分子生物學技術建立了一種可以快速檢測六種動物源性人獸共患病的基因晶片方法，它是在晶片固相載體基質膜上固定特異性的探針，這些探針可以特異性檢測禽流感病毒、狂犬病毒、豬鏈球菌2型、炭疽芽胞桿菌、沙門氏菌和大腸桿菌O157六種病原。通過應用於實踐口岸檢疫，本發明所建立的基因晶片方法可以快速、精確、特異性的檢測上述六種動物源性人獸共患病，尤其對於大批量檢疫的出入境檢驗檢疫部門意義顯得尤為突出。
文檔編號C12Q1/68GK102703577SQ201110030868
公開日2012年10月3日 申請日期2011年1月28日 優先權日2011年1月28日
發明者徐海聶, 王振全, 羅寶正, 薄清如 申請人:珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心