四氫異喹啉類生物鹼的新用途的製作方法

2023-10-18 06:33:44 3

本發明涉及四氫異喹啉類生物鹼在製備α-澱粉酶等體外消化酶抑制劑和3T3-L1前脂肪細胞增殖、分化抑制劑方面的用途。

背景技術：

世界衛生組織已宣布肥胖是最大的全球成年人慢性疾病。肥胖的病因極為複雜，包括各種行為，環境因素，代謝和遺傳因素等相互作用，普遍是由於能量攝入和消耗之間的長期失衡所導致。肥胖不僅影響美觀，而且極易誘發心腦血管及其他代謝疾病並增大其風險，包括高血壓，高血脂，冠狀動脈疾病和2型糖尿病等，已逐漸成為世界性健康問題之一。

α-澱粉酶是一種內切葡糖苷酶，作用於α-1，4-葡萄糖糖苷鍵。唾液、胰液中的α-澱粉酶可作用於食物中碳水化合物，將其分解為麥芽糖，糊精，低聚糖和葡萄糖等寡糖。寡糖經進一步分解為單糖後，被小腸上皮細胞吸收入血。α-澱粉酶抑制劑(α-Amylase Inhibitor，α-AI)調節血脂的機制可能與其抑制酶活性有關。α-AI能有效地抑制腸道唾液和胰液中α-澱粉酶的活性，阻礙碳水化合物的分解，減少葡萄糖過度產生和攝取，減少糖向脂肪轉化，降低血脂含量，並可以使一部分脂類轉化成糖以供機體生理的需要，使脂肪的合成減少。

天然存在的α-澱粉酶抑制劑有3種類型，分別為：(1)微生物產帶一個寡生物胺單位的含氮碳水化合物；(2)微生物產多肽，如：Paim(來自微生物的豬胰腺a-澱粉酶抑制劑)和Haim(微生物起源人α-澱粉酶抑制劑)；(3)在穀類、豆類以及其它較高等植物中發現的大分子蛋白質抑制劑(呂鳳霞等，α-澱粉酶抑制劑的研究進展，食品科學，2002年第23卷第3期，第152-155頁)。臨床上將α-澱粉酶抑制劑用於防治高血糖。人工合成小分子α-澱粉酶抑制劑目前尚為空白。

胰脂肪酶(pancreaticlipase，PL)是脂肪水解過程中的關鍵酶，由胰腺分泌到十二指腸，可水解50％～70％的食物脂肪成甘油一酯和脂肪酸。通過抑制PL的活性可阻止脂肪分解，進而使其直接通過消化道排出體外，從而達到減肥目的。同時，該酶抑制劑可直接在腸道內起作用，不需腸吸收，副作用較小，所以PL抑制類藥物研發成為一種重要研究方向。

3T3-L1前脂肪細胞在諸多文獻中已有報導，其與高脂肥胖症狀有著密切的聯繫。3T3-L1前脂肪細胞可分化為成熟的脂肪細胞，成熟脂肪細胞可大容量的儲存脂滴，而脂肪細胞的數目多少正是肥胖疾病形成的關鍵因素之一，故抑制3T3-L1前脂肪細胞的增殖和分化，幹預成熟脂肪細胞的形成及數量，可對脂滴的儲存量進行調控，從而達到減少脂肪儲存、控制和治療肥胖的目的。

四氫異喹啉生物鹼在自然界中數量多，分布廣泛。特別的，苄基異喹啉類生物鹼和苯乙基四氫異喹啉類生物鹼在生源上來自於苯丙氨酸/酪氨酸衍生途徑，結構特徵鮮明，合成途徑簡捷。藥理學研究已經證實該類化合物在降膽固醇、抗心律失常、抗高血壓的心腦血管疾病，自身免疫調節，中樞神經系統等多方面具有較好的藥理活性。本發明通過在C環上添加取代基的方法，獲得一系列取代四氫異喹啉類生物鹼，並將其研究開發為3T3-L1前脂肪細胞增殖、分化抑制劑及α-澱粉酶抑制劑和胰脂肪酶抑制劑，在製備糖尿病，高脂血症，肥胖或代謝症候群藥物的臨床研究方面具有良好的應用前景。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供四氫異喹啉類生物鹼及其衍生物的新用途。

本發明提供了一種式(I)或式(II)所示四氫異喹啉類生物鹼在製備α-澱粉酶抑制劑及3T3-L1前脂肪細胞增殖、分化抑制劑的應用。本發明製備的四氫異喹啉類生物鹼及其衍生物，經α-澱粉酶、胰脂肪酶和3T3-L1前脂肪細胞增殖、分化抑制活性的篩選，發現大多數化合物具有良好的體外活性，可作為進一步開發為3T3-L1前脂肪細胞增殖、分化抑制劑及α-澱粉酶抑制劑的前體物質。

本發明的四氫異喹啉類生物鹼及衍生物結構通式(I)或(II)表示：

結構通式(I)或(II)中R1、R2、R3、R4、R5分別選自氫，滷，-R0，-OR0，-R0CO，-R0COO；所述R0為芳香烴或C1～C12的烷烴；R6選自氫，羥基；R7選自氨基，叔丁氧羰基氨基，9-芴甲氧羰基氨基，苄氧羰基氨基。

特別的，結構通式(II)所涉及的化合物，其C環原料為含苯環胺基酸，符合苄基異喹啉類生物鹼和苯乙基四氫異喹啉類生物鹼生源合成的途徑。

根據本發明中所有四氫異喹啉類生物鹼衍生物，其藥學上可接受的鹽包括通式(I)或(II)化合物與下列酸形成的酸加成鹽：鹽酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、馬來酸等。

本發明中取代四氫異喹啉類生物鹼的製備方法包括：醚化反應，鹼水解反應，醯氯化反應，N-醯化反應，Bischler-Napieralski反應，亞胺還原反應等。

本發明所製備的四氫異喹啉類生物鹼在預防或治療糖尿病，高脂血症，肥胖或代謝症候群方面疾病的用途，是以α-澱粉酶、胰脂肪酶抑制活性及3T3-L1前脂肪細胞的增值和分化抑制活性的篩選為載體，本發明首次建立了以腸道中α-澱粉酶和胰脂肪酶兩種體外消化酶抑制活性的篩選，來評價化合物降糖降脂活性的方法。

其中，α-澱粉酶抑制活性的篩選採用3，5-二硝基水楊酸法，胰脂肪酶採用PNPP顯色法，對3T3-L1前脂肪細胞的增殖活性的影響是採用MTT法檢測，對細胞分化的影響是通過油紅O脂肪染色法檢測。

MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞碸(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數範圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。

油紅O脂肪染色法，是一種檢測組織或細胞內脂肪的方法。其檢測原理是油紅O可特異性的對脂肪進行染色，從而可在顯微鏡下進行直觀觀察。而染色後的油紅O還可通過異丙醇等有機溶劑萃取出來，在520nm波長下進行吸光度值量化測定。3T3-L1前脂肪細胞分化為成熟的脂肪細胞的過程中，一個很明顯的標誌就是細胞內有明顯的脂滴富集，故對分化結束後的脂肪細胞進行油紅O染色，再進行定量，從而可對總生物鹼提取物對3T3-L1前脂肪細胞的分化影響進行檢測。

本發明所製備的四氫異喹啉類生物鹼及其衍生物，經α-澱粉酶活性篩選，在100μmol/L濃度下均表現出明顯的抑制活性，部分化合物在5μmol/L濃度下仍讓表現出較明顯活性。經胰脂肪酶活性篩選，在100μmol/L濃度下均表現出明顯的抑制活性。3T3-L1前脂肪細胞增殖、分化抑制活性篩選了部分化合物，表現出了極明顯的增殖抑制作用及分化抑制作用。

根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明技術思想的前提下，還可以做出其他多種形式的修改，替換和變更。

以下通過實施例形式對上述內容作進一步補充說明，但不應該理解為本發明範圍僅限於以下實例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。

具體實施方式

實施例1

本發明所篩選化合物的合成與鑑定

所有試劑均為市售化學純或分析純。

反應基本過程：四氫異喹啉類的全合成可以以苯乙胺和苯乙酸或胺基酸為中間體原料進行N-醯化縮合，再經Bischler-Napieralski反應得到二氫異喹啉類化合物，再經亞胺還原以及成鹽反應，最終得到四氫異喹啉類生物鹼鹽。中間體原料可通過改變苯乙胺衍生物與苯乙酸衍生物或胺基酸衍生物中苯環上的取代基團，可實現在環上引入各種不同的取代基。

(1)中間體4-烷氧基苯乙酸甲酯(m1）的合成

稱取對羥基苯乙酸甲酯0.009mol，無水碳酸鉀0.009mol，加入至50mL三頸燒瓶中，回流裝置頂端加乾燥管或N2保護裝置，磁力攪拌，65℃加熱30min緩慢滴加溴代烷烴0.01mol，78℃回流反應24h及以上，TLC監測反應完全後，結束反應，減壓蒸去溶劑，加入30mL甲基叔丁基醚，依次用20mL，10mL，10mL 5％NaOH溶液洗滌後，再依次用20mL，10mL，10mL飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉乾燥有機層，過濾回收溶劑，得到油狀物m1。TLC檢測為一點，收率約為95.5％。

(2)4-烷氧基苯乙酸(m2)的合成

取m1於50ml三頸燒瓶中，依次加入10％氫氧化鈉10mL和12mL甲醇(1.2倍)，常溫下攪拌3h，再加入10％以上鹽酸調pH酸性，有白色固體析出，減壓抽乾得白色固體，TLC檢測為一點，收率約為96.8％。

(3)烷氧基苯乙醯氯(m3)的合成

取m2於50mL三頸燒瓶，用二氯甲烷溶清，加入2～3mL SOCl2，再加1滴DMF，N2保護下40℃攪拌3～6小時，旋幹得淡黃色油狀物0.0075mol，收率約90.6％。直接用作下一步原料。

(4)中間體(m4)的合成

稱取3，4-二甲氧基苯乙胺0.85g與12mL乙醚，加入5mL 10％NaOH溶液後攪拌至不分層，緩慢滴加m3(每0.001mol溶於3mL無水乙醚中)。室溫反應1h，反應液加入40mL氯仿稀釋，取氯仿層，依次用20mL水，20mL稀鹽酸(適量以中和NaOH)，20mL水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓蒸去氯仿，得中間體m4：N-6，7-二甲氧基苯乙基-4-烷氧基苯乙醯胺0.0027mol，針狀結晶，收率73％，化合物用乙醚，丙酮濾洗純化，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。

(5)中間體(m5)的合成

稱取m4，用10mL甲苯溶清，加入約1.91g POCl3，95℃下反應1～2h，結束反應，減壓蒸去甲苯，得6，7-二甲氧基-1-(4-烷氧基苄基)-1，2-二氫異喹啉，PH調鹼性，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉乾燥後抽濾，旋幹溶劑，得中間體m5約0.0015mol，收率55％，即可直接進行下一步反應。TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。

(6)化合物(m6)的合成

取m5加入15mL甲醇和少量NaOH固體調pH鹼性，2g硼氫化鉀，冷水浴下磁力攪拌，反應1h後TLC檢測反應完全，結束反應，減壓蒸去甲醇，加入30mL 10％NaOH溶液，若溶液已呈鹼性，則加入30mL水，用3×15mL氯仿萃取，合併萃取液，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓回收氯仿，得淡黃色油狀物m6，滴加氯化氫無水乙醚液，有白色體析出，抽濾，無水乙醚洗，少量丙酮洗，得化合物6，7-二甲氧基-1-(4-烷氧基苄基)-1，2，3，4四氫異喹啉0.00126mol，收率84％，總收率28％。TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。

上述溴代烷烴可替換為溴代芳烴；3，4-二甲氧基苯乙胺可替換為β-苯乙胺或其他取代的苯乙胺；取代苯乙酸可替換為氨基保護的胺基酸，選自苯丙氨酸或酪氨酸時，符合苄基異喹啉類生物鹼和苯乙基四氫異喹啉類生物鹼生源合成的途徑。

特別的，結構通式(II)中原料胺基酸的氨基可選擇用叔丁氧羰基、9-芴甲氧羰基或苄氧羰基保護。取代苯乙胺與胺基酸的羧基的N-醯化，可選擇以溫和條件的醯化催化劑如EDCI等直接縮合。以Boc-L-苯丙氨酸為例，其合成路線如下：

上述路線中，R選自氫，滷，-R0，-OR0，-R0CO，-R0COO；所述R0為芳香烴或C1～C12的烷基。步驟1是以EDCI、HOBt、DMAP為醯化催化劑，直接進行醯胺縮合。步驟2是以脫水劑進行環合，2′、2″都是副反應步驟，d′、d″都是環合反應副產物。

化合物的結構是通過核磁共振(NMR)確定的。NMR的測定是使用Bruker AVANCE-300核磁共振儀，測定溶劑是DMSO-d6，內標為TMS，化學位移是10-6ppm為單位給出。

化合物1：1-(4-乙氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.14(br.s，2H，NH，HCl)，7.15-7.34(m，6H，Ar-H)，6.87(d，2H，Ar-H)，3.95(q，2H，OCH2)，2.87-3.12(m，8H，Ar-CH2，CH2，N-CH2)，1.28(t，3H，OCH3)。

化合物2：1-(4-丙氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.35(br.s.2H)，7.15-7.36(m，6H)，6.87(d，2H)，3.87(t，2H)，2.89-3.10(m，8H)，1.65(m，2H)，0.94(t，3H)。

化合物3：1-(4-丁氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.05(s，2H)，7.39-7.31(m，2H)，7.27(d，J＝5.5Hz，2H)，7.17(d，J＝8.4Hz，2H)，6.90(d，J＝8.3Hz，2H)，3.94(t，J＝6.4Hz，2H)，3.14(s，4H)，3.04-2.83(m，4H)，1.74-1.61(m，2H)，1.51-1.32(m，2H)，0.93(t，J＝7.4Hz，3H)。

化合物4：1-(4-己氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.12(s，2H)，7.40-7.31(m，2H)，7.27(d，J＝5.8Hz，3H)，7.17(d，J＝8.5Hz，2H)，6.89(d，J＝8.6Hz，2H)，3.93(t，J＝6.4Hz，2H)，3.15(d，J＝11.8Hz，5H)，3.04-2.83(m，4H)，1.68(m，2H)，1.40(s，2H)，1.34-1.22(m，4H)，0.88(t，J＝6.8Hz，3H)。

化合物5：1-(4-辛氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.38(s，2H)，7.25(d，J＝8.2Hz，2H)，6.92(d，J＝7.8Hz，2H)，6.79(s，1H)，6.49(s，1H)，4.58(s，1H)，3.94(t，J＝6.4Hz，2H)，3.73(s，2H)，3.55(s，2H)，3.29-2.81(m，4H)，1.77-1.61(m，2H)，1.41(s，2H)，1.28(m，8H)，0.86(d，J＝6.7Hz，3H)。

化合物6：1-(4-十二烷氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.28(br.s，2H)，7.25(d，J＝8.5Hz，2H)，6.92(d，J＝8.5Hz，2H)，6.79(s，1H)，6.48(s，1H)，4.58(s，1H)，3.94(t，1H)，3.83(s，2H)，3.74(s，3H)，3.45-3.32(s，2H)，3.19-3.12(s，2H)，3.12-2.81(m，4H)，1.77-1.61(m，2H)，1.25(s，16H)，0.86(t，3H)。

化合物7：1-(4-氯苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.27(s，2H)，7.41(d，J＝8.4Hz，2H)，7.35-7.25(m，6H)，4.20-4.02(m，1H)，3.35(s，2H)，3.00(d，J＝6.8Hz，4H)。

化合物8：1-(2，6-二氯基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.91(s，2H)，7.54-7.43(m，2H)，7.43-7.32(m，1H)，7.29-7.19(m，2H)，7.07-6.97(m，1H)，6.45(d，J＝7.8Hz，1H)，4.72(t，J＝7.6Hz，1H)，3.70-3.54(m，3H)，3.43(m，1H)，3.20-3.03(m，2H)。

化合物9：6，7-二甲氧基-1-(4-乙氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.21(br.s.2H)，7.23(d，J＝8.55Hz，2H)，6.90(d，J＝8.52Hz，2H)，6.78(s，1H)，6.48(s，1H)，4.29(t，1H)，4.0(q，2H)，3.73(s，3H)，3.54(s，3H)，3.17-3.25(m，6H)，1.32(t，3H)，1.32(t，3H)。

化合物10：6，7-二甲氧基-1-(4-丙氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.27(br.d.2H)，7.23(d，J＝8.49Hz，2H)，6.92(d，J＝8.49Hz，2H)，6.78(s，1H)，6.48(s，1H)，4.29(s，1H)，3.89(t，2H)，3.73(s，3H)，3.54(s，3H)，2.9-3.30(m，6H)，2.08(s，1H)，1.68(m，2H)，0.94(t，3H)。

化合物11：6，7-二甲氧基-1-(4-丁氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.34(s，1H)，9.23(s，1H)，7.25(d，J＝8.4Hz，2H)，6.92(d，J＝8.5Hz，2H)，6.78(s，1H)，6.48(s，1H)，4.58(s，1H)，3.96(t，J＝6.4Hz，2H)，3.73(s，3H)，3.55(s，3H)，3.46-3.20(m，9H)，2.96(m，2H)，1.75-1.62(m，2H)，1.43(m，2H)，0.93(t，J＝7.3Hz，3H)。

化合物12：6，7-二甲氧基-1-(4-己氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.53(s，2H)，7.25(d，J＝8.5Hz，2H)，6.91(d，J＝8.5Hz，2H)，6.78(s，1H)，6.46(s，1H)，4.56(s，1H)，4.10(s，4H)，3.94(t，J＝6.4Hz，2H)，3.73(s，3H)，3.54(s，3H)，3.26-2.79(m，6H)，1.68(m，2H)，1.41(s，2H)，1.35-1.23(m，4H)，0.88(t，J＝6.5Hz，3H)。

化合物13：6，7-二甲氧基-1-(4-辛氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.37(s，2H)，7.25(d，J＝8.4Hz，2H)，6.91(d，J＝8.6Hz，2H)，6.78(s，1H)，6.48(s，1H)，4.57(s，1H)，3.94(t，J＝6.3Hz，2H)，3.73(s，3H)，3.55(s，3H)，3.49-3.19(m，6H)，2.96(m，2H)，1.76-1.61(m，2H)，1.32(m，9H)，0.86(d，J＝6.7Hz，3H)。

化合物14：6，7-二甲氧基-1-(4-十二烷氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.28(d，2H)，7.25(d，J＝8.4Hz，2H)，6.92(d，J＝8.5Hz，2H)，6.79(s，1H)，6.48(s，1H)，4.58(s，1H)，3.94(t，J＝6.4Hz，2H)，3.83(s，2H)，3.74(s，3H)，3.55(s，3H)，3.43-3.19(m，5H)，3.05-2.82(m，2H)，1.69(d，J＝6.9Hz，2H)，1.40(s，2H)，1.25(s，15H)，0.86(t，J＝6.6Hz，3H)。

化合物15：6，7-二甲氧基-1-(4-氯苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.47(s，2H)，7.42(d，J＝9.2Hz，4H)，6.80(s，1H)，6.56(s，1H)，4.64(s，1H)，3.74(s，3H)，3.59(s，3H)，3.47-3.39(m，3H)，3.30-3.11(m，2H)，2.96(m，2H)，2.09(s，1H)。

化合物16：6，7-二甲氧基-1-(2，6-二氯苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.87(br.s，2H)，7.51(d，J＝7.9Hz，2H)，7.43-7.35(m，1H)，6.81(s，1H)，5.69(s，1H)，4.61(t，J＝7.7Hz，1H)，3.71(s，3H)，3.65-3.39(m，5H)，3.28(s，3H)，3.01(s，2H)。

化合物17：1-(4-苄氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.25(d，2H)，7.43(m，2H)，7.36(m3H)，7.27(d，J＝6.1Hz，2H)，7.18(d，J＝8.6Hz，2H)，7.00(t，J＝8.6Hz，2H)，5.10(d，J＝4.2Hz，2H)，4.12(s，1H)，3.35(s，3H)，3.01-2.88(m，3H)，1.23(s，1H)。

化合物18：6，7-二甲氧基-1-(4-苄氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.60(s，2H)，7.49-7.32(m，5H)，7.28(d，J＝8.5Hz，2H)，7.00(d，J＝8.5Hz，2H)，6.77(s，1H)，6.43(s，1H)，5.11(s，2H)，4.56(t，J＝6.3Hz，1H)，3.73(s，3H)，3.50(s，3H)，3.37(s，2H)，3.32-3.18(m，3H)，3.07-2.82(m，2H)。

化合物19：6，7-二甲氧基-1-(4-甲氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.25(s，2H)，7.27(d，J＝8.6Hz，2H)，6.94(d，J＝8.5Hz，2H)，6.79(s，1H)，6.49(s，1H)，4.59(s，1H)，3.75(d，J＝3.0Hz，3H)，3.73(s，3H)，3.56(s，3H)，3.21(m，3H)，3.03-2.86(m，2H)。

化合物20：1-(4-甲氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.20(s，2H)，7.38-7.30(m，2H)，7.27(m，2H)，7.18(d，J＝8.6Hz，2H)，6.90(d，J＝8.6Hz，2H)，3.73(s，3H)，3.35(s，2H)，3.12(s，4H)，3.03-2.88(m，4H)。

化合物21：6，7-二甲氧基-1-(2-甲氧基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.39(s，2H)，7.32(t，J＝7.9Hz，1H)，7.21(d，J＝7.1Hz，1H)，7.06(d，J＝8.2Hz，1H)，6.93(t，J＝7.0Hz，1H)，6.79(s，1H)，6.28(s，1H)，4.58(t，J＝7.0Hz，1H)，3.83(s，3H)，3.73(s，3H)，3.49(s，3H)，3.34(s，2H)，3.23(d，J＝7.1Hz，2H)，2.97(d，J＝6.9Hz，2H)。

化合物22：6，7-二甲氧基-1-(4-甲基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.42(s，2H)，7.21(m，4H)，6.78(s，1H)，6.45(s，1H)，4.61(t，J＝7.0Hz，1H)，3.74(s，3H)，3.53(s，3H)，3.39-3.09(m，6H)，2.94(m，2H)，2.31(s，3H)。

化合物23：1-(4-甲基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.09(s，2H)，7.34(d，J＝6.1Hz，2H)，7.29-7.25(m，2H)，7.15(s，4H)，3.34(s，2H)，3.15(m，4H)，2.94(m，4H)，2.28(s，3H)。

化合物24：6，7-二甲氧基-1-(2-甲基苄基)-1，2，3，4-四氫異喹啉的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.42(s，2H)，7.21(dd，J＝20.7，7.9Hz，4H)，6.78(s，1H)，6.45(s，1H)，4.61(t，J＝7.0Hz，1H)，3.74(s，3H)，3.53(s，3H)，3.39-3.09(m，6H)，2.94(m，2H)，2.31(s，3H)。

化合物25：6-乙氧基-1-苄基-1，2，3，4-四氫異喹啉鹽酸鹽的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.32(s，2H)，7.26-7.34(m，5H)，6.69-6.77(m，2H)，6.93(d，J＝8.7Hz，1H)，4.67(br.s，1H)，3.84(q，J＝6.9Hz，2H)，2.89-3.34(m，6H)，1.28(t，J＝6.9Hz，3H)。

化合物26：6-甲氧基-7-丙氧基-1-苄基-1，2，3，4-四氫異喹啉鹽酸鹽的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.50(s，2H)，7.27-7.39(m，5H)，6.78(s，1H)，6.37(s，1H)，4.65(br.s，1H)，3.73(s，3H)，3.59(m，2H)，2.87-3.36(m，6H)，1.60(m，2H)，0.89(t，J＝7.5Hz，3H)。

化合物27：6，7-二乙氧基-1-苄基-1，2，3，4-四氫異喹啉鹽酸鹽的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.54(s，2H)，7.27-7.36(m，5H)，6.77(s，1H)，6.40(s，1H)，4.63(t，J＝6.9Hz，1H)，3.98(q，J＝6.9Hz，2H)，3.72(q，J＝6.9Hz，2H)，2.88-3.36(m，6H)，1.30(t，J＝6.9Hz，3H)，1.20(t，J＝6.9Hz，3H)。

化合物28：6，7-二丙氧基-1-苄基-1，2，3，4-四氫異喹啉鹽酸鹽的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.45(s，2H)，7.29-7.40(m，5H)，6.78(s，1H)，6.39(s，1H)，4.64(br.s，1H)，3.88(t，J＝6.3Hz，2H)，3.61(t，J＝6.3Hz，2H)，2.85-3.37(m，6H)，1.71(m，2H)，1.58(m，2H)，0.96(s，J＝7.5Hz，3H)，0.90(s，J＝7.5Hz，3H)。

化合物29：6-丁氧基-1-苄基-1，2，3，4-四氫異喹啉鹽酸鹽的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.37(br.s，2H)，7.32(m，5H)，6.96(d，J＝8.5Hz，1H)，6.80(s，1H)，6.72-6.76(dd，J＝8.5Hz，2.4Hz，1H)，4.69(br.s.1H)，3.94(s，J＝6.4Hz，2H)，2.97-3.36(m，6H)，1.66(m，J＝7.6Hz，2H)，1.42(m，J＝7.6Hz，2H)，0.92(t，J＝7.3Hz，3H)。

化合物30：7-丁氧基-1-苄基-1，2，3，4-四氫異喹啉鹽酸鹽的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，8.99(br.s，2H)，7.31(m，5H)，7.17(m，J＝8.4Hz，2H)，6.89(d，J＝8.6Hz，1H)，4.67(br.s.1H)，3.94(s，J＝6.45Hz，2H)，2.97-3.36(m，6H)，1.68(m，J＝7.6Hz，2H)，1.42(m，J＝7.6Hz，2H)，0.92(t，J＝7.3Hz，3H)。

化合物31：6，7-丁氧基-1-苄基-1，2，3，4-四氫異喹啉鹽酸鹽的製備：製法同上，得白色固體化合物，TLC檢測為一點，紫外燈254nm下及365nm下均有螢光，碘化鉍鉀顯色橘紅。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6，δppm)，9.41(s，2H)，7.32(m，5H)，6.79(s，1H)，6.38(s，1H)，4.65(s，1H)，3.91(t，J＝6.5Hz，3H)，3.63(m，3H)，3.27-3.37(m，4H)，2.89-2.95(m，2H)，1.61(m，4H)，1.38(m，4H)，0.91(q，J＝7.4Hz，3H)。

實施例2

取代四氫異喹啉衍生物α-澱粉酶抑制活性的測定。

測定儀器為THERMO Varioskan Flash全波長多功能酶標儀。

以實施例1方法所得的化合物以以下方法測α-澱粉酶抑制活性：

實驗原理：利用α澱粉酶水解澱粉產生的麥芽糖與3，5-二硝基水楊酸(DNS顯色劑)顯色的原理設計。二硝基水楊酸(DNS顯色劑)與還原糖發生氧化還原反應，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產物在煮沸條件下顯棕紅色，且在一定濃度範圍內顏色深淺與麥芽糖含量成比例關係，用比色法測定麥芽糖含量。

溶液配製：pH 6.9的磷酸鹽緩衝溶液；磷酸鹽緩衝液溶解的可溶性澱粉作為底物溶液；由3，5-二硝基水楊酸和酒石酸鉀鈉配製的DNS顯色劑；α-澱粉酶溶液；精密稱取化合物樣品10-5mol，加少量DMSO溶解後，加PBS稀釋到所需濃度的樣品溶液。

測定時每個樣品有4個體系：樣品組(取0.25mL的酶溶液，0.1mL的樣品抑制劑)，空白組(不加酶)，陽性對照組(不加抑制劑)，陰性對照組(不加酶和抑制劑)。加完，37℃預熱10min。後加入0.5mL同樣已預熱的底物溶液，按最佳反應時間3min進行反應，後加入0.5mL DNS顯色劑，混合後沸水加熱顯色。冷卻至室溫後加入適量去離子水稀釋至2mL，移液槍吸取0.1mL至96孔板，並在540nm處測定吸光度值。

扣除空白後，在540nm處測得樣品組吸光度為AI，扣除陰性後，在540nm處測定陽性對照組吸光度為AE。每個樣品水平測定3次，依公式計算抑制率。

樣品單體抑制率(％)＝[(AE-AI)/AE]×100％。對於抑制率高於50％的化合物，選擇5個濃度測定其抑制率，每個樣品重複3次，並計算該化合物IC50值。

表1：在100μmol/L濃度下化合物的抑制率及IC50

測定結果表明：本發明公開的部分化合物對α-澱粉酶具有抑制作用，且呈現一定的構效關係。其中，C環引入基團的鏈長對活性影響較大，在R1、R4、R5位引入較大疏水基團時，其α-澱粉酶抑制活性也相應增大。4′位烷氧基的碳鏈長度在2～8時，其抑制活性隨碳鏈長度增加。

實施例3

取代四氫異喹啉衍生物胰脂肪酶活性的測定。

以實施例1方法所得的化合物以以下方法測胰脂肪酶活性：

實驗原理：胰脂肪酶能水解4-硝基苯棕櫚酸酯(PNPP)產生黃色的4-硝基苯酚(PNP)和棕櫚酸，PNP在水溶液中顯黃色，且其最大吸收波長為405nm，因此可以通過測定在405nm處的吸光度來計算出PNP的含量變化，來測得胰脂肪酶活力。

溶液配製：樣品化合物，先用少量DMSO溶解後，再加Tris-HCl緩衝液稀釋到所需濃度。胰脂肪酶用Tris-HCl緩衝液配成1.2mg/mL的酶溶液，PNPP先用少量異丙醇溶解，再加Tris-HCl緩衝液稀釋配製成1mmol/L的底物溶液。

測定時每個樣品由4個體系：樣品組(取0.05mL的酶溶液，0.02mL的樣品抑制劑，0.11mL的緩衝液)，空白組(不加酶)，陽性對照組(不加抑制劑)，陰性對照組(不加酶和抑制劑)。於37℃水浴下保溫10min，然後加入1mmol/L的底物溶液，在37℃水浴下反應30min。在405nm波長下測定各體系吸光度值。

以空白組調零，測定樣品組吸光度，即為AI；以陰性對照組調零，測定陽性對照組吸光度，即為AE。每個樣品的每個濃度水平重複測定3次。

根據公式計算抑制率。樣品單體抑制率(％)＝[(AE-AI)/AE]×100％。對於抑制率高於50％的化合物，選擇5個濃度測定其抑制率，每個樣品重複3次，並計算該化合物IC50值。

表2：在100μmol/L濃度下抑制率高於50％的化合物的IC50值

測定結果表明，本發明公開的部分化合物對胰脂肪酶具有抑制作用，且呈現一定的構效關係。

實施例4

取代四氫異喹啉衍生物對3T3-L1前脂肪細胞增殖抑制活性的測定。

細胞株：3T3-L1前脂肪細胞，購於中科院上海細胞庫。

主要試劑或儀器：胎牛血清(FBS)，DMEM培養基購於Gibco公司。酶聯免疫檢測儀Thermo Electron Corporation 1500；倒置顯微鏡，重慶光學儀器廠XSZ-D2；脫色搖床，金壇市醫療儀器廠TY-80R。

以實施例1方法所得的化合物以MTT法測對3T3-L1前脂肪細胞增殖活性影響：

收集3T3-L1對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入200μL細胞懸浮液鋪板，使細胞密度至2000-5000個細胞/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。5％CO2，37℃孵育12h，至細胞生長至合適密度，單層貼壁孔底(96孔平底板)，吸出孔中原培養液，給藥組換上濃度100μg/mL和200μg/mL樣品化合物的200μL完全培養基，空白組和細胞對照組換上200uL完全培養基。設6個復孔。5％CO2，37℃孵育24h，顯微鏡下觀察。每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，繼續培養4h。終止培養，小心吸去孔內培養液。每孔加入150μL二甲基亞碸，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀570nm處測量各孔的吸光值。細胞存活率＝(給藥組OD值-空白對照組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)*100％。重複實驗3次。抑制率＝1-細胞存活率。

實施例5

取代四氫異喹啉衍生物對3T3-L1前脂肪細胞分化抑制活性的測定。

以實施例1方法所得的化合物以油紅O脂肪染色法測對3T3-L1前脂肪細胞分化抑制活性：首先是細胞分化，收集3T3-L1對數期細胞，調整細胞懸液濃度，得細胞濃度為(2-3)*104個/mL，將細胞接種於24孔培養板，每孔加入細胞懸液1mL，每種處理設6個復孔。先使用含10％FBS的完全培養基培養2d，當細胞長滿後更換新的完全培養液1mL繼續培養2d，使細胞達到接觸抑制。然後更換為含10μg/mL胰島素、0.5mmol/LIBMX、1μmol/L DEX的完全培養液(細胞初級誘導液)1mL，培養2d後，換隻含10μg/mL胰島素的完全培養液1mL，培養2d，再換用完全培養液1mL培養1～3d，直到分化結束，90％左右細胞呈脂肪細胞表型。給藥組完全培養液中除上述分化過程中需要的藥物外，自分化第1d起，同時加入樣品溶液，使終濃度分別為10μg/mL和20μg/mL，直至分化結束。

分化結束後進行油紅O染色及吸光度值測定：小心移去24孔板中的細胞培養液，注意不要將細胞吸走以及吹散，加入0.5mL PBS清洗3次，吸走及加液的過程要輕柔。加入0.5mL 4％多聚甲醛PBS水溶液固定15min，PBS洗3次。將細胞瞭幹20min，加入0.5mL油紅O染液，染色30min後去除染液，再加適量70％乙醇迅速清洗細胞1次清除多餘的染料，加純水洗3次。置於倒置顯微鏡下觀察並拍攝照片。加入1mL異丙醇，於520nm波長下測定吸光值。

實施例6：化合物對3T3-L1前脂肪細胞增殖活性的影響

對3T3-L1前脂肪細胞增殖活性影響的研究。結果表明，與各化合物在不同濃度下培養24h，抑制率隨濃度升高而增大，與對照組相比，存在顯著性差異(p＜0.01)，具有統計學意義。

MTT實驗數據表明，當化合物濃度達到50μmol/L時，化合物對3T3-L1前脂肪細胞表現出了極明顯的增殖抑制作用，其抑制率如表3所示：

表3：濃度為50μmol/L時，部分化合物對3T3-L1前脂肪細胞的增殖抑制作用

實施例7：化合物對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響

對3T3-L1前脂肪細胞分化影響的研究結果表明，在不同濃度藥物作用下，3T3-L1前脂肪細胞的分化受到不同程度的抑制，且隨著藥物濃度的升高，抑制作用也在增強，細胞中的脂肪積累逐漸減少，油紅O染色後於鏡下的觀察中，給藥組和對照組有明顯差異。通過對油紅O吸光度值定量發現，當化合物濃度達到10μmol/L時，化合物對3T3-L1前脂肪細胞表現出了極明顯的分化抑制作用，其抑制率如下表4所示：

表4：濃度為10μmol/L時，部分化合物對3T3-L1前脂肪細胞的分化抑制作用