嗜酸性粒細胞疾病的治療劑的製作方法

2023-10-07 12:54:09 4

專利名稱：嗜酸性粒細胞疾病的治療劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑或治療方法或其它相關手段，所述嗜酸性粒細胞增多性疾病是由外周血或組織中增加的嗜酸性粒細胞引起的，所述治療劑包含通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子而誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質作為活性成分。
背景技術：
炎症是一種病理狀態，其中多種炎症細胞如肥大細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和嗜鹼性粒細胞通過多種介質形成複雜的網絡而引起組織損傷。對炎症特別是過敏性炎症的傳統療法集中於抑制組織反應，即炎症細胞的趨化、浸潤和活化，所述組織反應是由特異性IgE介導的肥大細胞或嗜鹼性粒細胞脫顆粒/釋放化學介質而引起的。脫敏治療、脫顆粒抑制劑/化學介質釋放抑制劑和化學介質拮抗劑非常有助於治療過敏性炎症。過敏治療集中於抑制該IgE依賴性機制，新的化學介質，特別是類花生酸物質合成抑制劑/拮抗劑現仍處於廣泛開發之中。
另一方面，近來的研究顯示嗜酸性粒細胞顆粒蛋白直接誘導組織損傷或炎症，表明嗜酸性粒細胞在炎症反應特別是過敏性炎症中起著關鍵作用。在炎症的病理學中，已知嗜酸性粒細胞表現出「在骨髓中產生增加」，「選擇性浸潤進入炎症區域並活化」和「存活延長」。結果存活的活化的嗜酸性粒細胞增多，通過持續釋放細胞毒性嗜酸性粒細胞顆粒蛋白而導致嚴重的組織損傷。臨床發現還顯示在例如慢性支氣管哮喘患者中外周血嗜酸性粒細胞增加。還已報導了外周血嗜酸性粒細胞的數目或支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞的數目與支氣管過敏性相關，並且隨著病情改善，外周血嗜酸性粒細胞的數目恢復正常。因此，調節嗜酸性粒細胞也是炎症治療的重要目標之一，因為多種疾病如過敏性疾病、寄生蟲感染和自身免疫病的一個主要症狀就是炎症反應。
對靶向嗜酸性粒細胞的炎症治療的研究迄今為止針對 「抑制骨髓中產生增加」，「抑制選擇性浸潤進入組織」，「抑制趨化作用」，「抑制活化(脫顆粒)」，「滅活顆粒蛋白(MBP，EPO，ECP，EDN)或活性氧」等，阻斷由促嗜酸性粒細胞生成的細胞因子IL-5介導的信號途徑(抗IL-5R抗體，可溶性IL-5R或抗IL-5抗體)臨床應用於過敏性炎症目前正在研發之中。但是，迄今為止臨床上尚未確立任何靶向嗜酸性粒細胞的療法。
在嗜酸性粒細胞中誘導凋亡在終止炎症信號作用方面非常有效，因為嗜酸性粒細胞的存活通過抑制凋亡而得以延長，增加的活化的嗜酸性粒細胞經歷壞死而通過在發炎部位分泌顆粒蛋白來延長炎症，通過去除促進存活的細胞因子(IL-3，IL-5，GM-CSF，IFN-γ等)，容易導致幾乎不表達負責凋亡抑制的Bcl-2的嗜酸性粒細胞凋亡。換句話說，誘導嗜酸性粒細胞凋亡對於終止炎症是很重要的。
已提出了能在嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的因子如TGF-β、抗-Fas抗體和FasL的治療應用。已提示在嗜酸性粒細胞中誘導凋亡是甾體類抗炎效應的一部分(J.Clin.Invest.881982-1987，1991)。然而，一些報導顯示施用抗Fas抗體具有副作用的問題，因為它們誘導暴發性肝炎(Cell，88355-365，1997)，或者IL-5或類似物減少甾體類在嗜酸性粒細胞中誘導凋亡(J.Clin.Invest.881982-1987，1991)。因此，迄今為止還不存在任何通過在嗜酸性粒細胞中誘導凋亡而對嗜酸性粒細胞增多性疾病有效的治療劑或治療方法。
另一方面，CD30被鑑定為由單克隆抗體Ki-1識別的細胞表面分子，所述單克隆抗體Ki-1是針對源自霍奇金病的Reed-Sternberg細胞系L428作為抗原在1982年製備的，並且該分子被報導為霍奇金病細胞特異性的抗原(Nature，29965，1982)。隨後，顯示該分子在某些非霍奇金淋巴瘤、退行性大細胞淋巴瘤、腫瘤細胞如惡性黑素瘤和間質性軟骨肉瘤細胞、多種細胞系、促分裂原活化的T和B細胞、被病毒(HIV，HTLV-I，-II，EBV)轉化的T和B細胞、活化的巨噬細胞、活化的NK細胞、子宮蛻膜等中表達。先前的分析報導，來自CD30的信號顯示出廣泛的效應，如T細胞的生長和細胞死亡以及細胞因子產生增加(Blood，832045，1994)，但其機制大部分未知。在CD30缺陷小鼠中，觀察到CD4+8+雙陽性胸腺細胞數目的顯著增加，提示抑制對胸腺細胞(自身反應性T細胞)的負選擇(J.Exp.Med.，187427-432，1998)。另一報導顯示，某些識別CD30配體結合部位的單克隆抗體本身具有對抗退行性大細胞淋巴瘤的抗腫瘤效應。這提示CD30介導的信號作用在某些細胞中誘導凋亡(Clinical Immunology，3467-71，2000)。基於其胞外結構域的結構，CD30分子顯示出是TNF受體(TNFR)超家族的成員，一種CD30配體(CD153)顯示出是TNF超家族的成員。還報導，CD30的胞質結構域沒有在Fas中發現的死亡結構域但包括兩個TNFR-相關因子(TRAF)-結合部位以通過TRAF分子活化NF-kB(Int.Immunol.10203，1998)。
一項近來的報導進一步顯示，CD30信號作用不僅依賴於其配體的結合，而且還依賴於其表達水平，即它們是通過本身過表達而自我活化的，從而不依賴於配體而活化NF-kB(Clinical Immunology，34812-819，2000)。CD30的表達水平在細胞類型以及活化和分化階段之間變化相當大，表明CD30的多種效應似乎在部分程度上是由表達水平的變化引起的，但在許多情況下它們不能僅僅用表達水平來解釋，提示它們對細胞的作用可能還通過胞內衝動傳導系統的變化來修飾。可溶性CD30血清水平升高與霍奇金病、愛滋病、B型肝炎、特應性疾病或Omenn症候群患者或自身免疫病如類風溼性關節炎和系統性紅斑狼瘡患者的預後相關(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，948670-8674，1997，J.Neuroimmunol.，97，182-190，1999，J.Neurol.Sci.，17149-55，1999，Clin.Endocrinol.，49609-613，1998，Br.J.Dermatol.，14073-78，1999)。特別地，霍奇金病患者血清可溶性CD30水平升高以及特應性皮炎中血清ECP(嗜酸性粒細胞陽離子蛋白)水平或者愛滋病的階段或預後與血清可溶性CD30水平之間的關聯提示CD30涉及這些疾病。
在霍奇金病中，也報導了嗜酸性粒細胞的增多(Ann.Oncol.，889-96，1997，Blood，951207-1213，2000)，但原因和機制未知，並且沒有報導顯示CD30在嗜酸性粒細胞中表達。因此，迄今為止還沒有報導將嗜酸性粒細胞增加與升高的可溶性CD30水平聯繫起來。
為了終止炎症，必需抑制嗜酸性粒細胞新產生或其浸潤進入炎症區域並活化並且消除活化的嗜酸性粒細胞。但是如果嗜酸性粒細胞在壞死過程中溶解，則組織會受到由於細胞膜破壞而引起的顆粒蛋白分泌的進一步損傷，炎症加重。因此，本發明旨在提供使用誘導嗜酸性粒細胞迅速和強烈凋亡的物質而用於嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑或治療方法或相關手段。

發明內容
本發明計劃克服上述現有技術的問題。我們基於以下發現而完成了本發明，即經由抗人CD30單克隆抗體或類似物的CD30介導的信號作用可誘導嗜酸性粒細胞迅速和強烈凋亡，從而有效治療嗜酸性粒細胞增多性疾病包括過敏性疾病。
在本發明公開之前，不知道CD30分子在人外周血嗜酸性粒細胞中表達以及CD30介導的信號作用具有生理學活性誘導嗜酸性粒細胞凋亡。
我們對以下假設繼續進行研究CD30調節嗜酸性粒細胞的凋亡，並且如果凋亡誘導受到可溶性CD30的抑制，則由增加的嗜酸性粒細胞或嗜酸性粒細胞增多引起的疾病就會發生。結果我們基於以下發現完成了本發明，即CD30介導的信號作用較已知的信號作用可選擇性地在人外周血嗜酸性粒細胞中更為迅速和強烈地誘導凋亡，並且這種凋亡誘導不是簡單地由對IL-5介導的存活信號作用的拮抗所致，而是通過不依賴於IL-5信號轉導的途徑發生。如以下實施例中詳細顯示，我們發現在固定有識別CD30配體結合部位的某些抗人CD30單克隆抗體的平板上培養的50％或更多的人外周血嗜酸性粒細胞中，在1-4小時之內迅速誘導凋亡。
由此，我們基於以下發現完成了本發明，即通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質可以是嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑。
因此，本發明涉及(1)嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，包含通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質作為活性成分；(2)如以上(1)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是識別由Ber-H8或HRS-4識別的位點的免疫球蛋白或其活性片段、肽或低分子量化合物；(3)如(1)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是免疫球蛋白或其活性片段(包括那些得自天然來源或通過基因重組獲得的)；(4)如以上(2)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是識別SEQ ID NO1的胺基酸序列(CD30胺基酸序列的第112和412位之間的胺基酸序列)的至少一部分或全部的免疫球蛋白或其活性片段；(5)如以上(4)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述免疫球蛋白是Ber-H8或HRS-4；(6)如以上(1)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是CD30配體或其活性片段(包括那些得自天然來源或通過基因重組獲得的)；(7)如以上(6)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述CD30配體是CD153；(8)如以上(1)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是編碼CD30配體或其活性片段的核酸；(9)如以上(8)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述核酸是編碼SEQ ID NO2的胺基酸(CD153的胺基酸序列)的DNA；(10)如以上(1)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是表達和/或分泌CD30配體的吞噬細胞；(11)如以上(1)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是使吞噬細胞表達和/或分泌CD30配體的物質；(12)如以上(1)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是能調節CD30表達和/或聚集的物質；(13)如以上(1)-(12)之任一項中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述嗜酸性粒細胞增多性疾病是選自下組的疾病過敏性疾病、呼吸系統疾病、皮膚疾病、自身免疫病、免疫缺陷疾病、消化系統疾病、腫瘤性疾病、寄生蟲感染或特發性嗜酸性粒細胞增多症候群；(14)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述過敏性疾病是選自藥物過敏、支氣管哮喘和過敏性鼻炎的疾病；(15)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述呼吸系統疾病是嗜酸性粒細胞肺浸潤；(16)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述皮膚疾病是選自特應性皮炎、蕁麻疹、血管性水腫、牛皮癬、木村病、伴有嗜酸性粒細胞增多的發作性血管性水腫、嗜酸性粒細胞性膿皰性毛囊炎和淋巴瘤樣丘疹病的疾病；(17)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述自身免疫病是選自多動脈炎、類風溼性關節炎和系統性紅斑狼瘡的疾病；(18)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述免疫缺陷疾病是選自高IgE症候群、Wiscott-Aldrich症候群和Omenn症候群的疾病；(19)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述消化系統疾病是選自過敏性胃腸炎、嗜酸性粒細胞性胃腸炎、潰瘍性結腸炎和胰腺炎的疾病；(20)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述腫瘤性疾病是霍奇金病；(21)如以上(13)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述寄生蟲感染是選自異尖線蟲病、旋毛蟲病、類圓線蟲病、日本血吸蟲病和肺吸蟲病的疾病；(22)嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，包括施用通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質；(23)如以上(22)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是識別由Ber-H8或HRS-4識別的位點的免疫球蛋白或其活性片段或低分子量化合物；(24)如以上(22)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是免疫球蛋白或其活性片段(包括那些得自天然來源或通過基因重組獲得的)；(25)如以上(23)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是識別SEQ ID NO1的胺基酸序列(CD30胺基酸序列的第112和412位之間的胺基酸序列)的至少一部分或全部的免疫球蛋白或其活性片段；(26)如以上(24)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述免疫球蛋白是Ber-H8或HRS-4；(27)如以上(22)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是CD30配體或其活性片段(包括那些得自天然來源或通過基因重組獲得的)；(28)如以上(27)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述CD30配體是CD1 53；(29)如以上(22)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是編碼CD30配體或其活性片段的核酸；(30)如以上(29)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述核酸是編碼SEQ ID NO2的胺基酸(CD153的胺基酸序列)的DNA；(31)如以上(22)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是表達和/或分泌CD30配體的吞噬細胞；(32)如以上(22)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是使吞噬細胞表達和/或分泌CD30配體的物質；(33)如以上(22)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是能調節CD30表達和/或聚集的物質；(34)如以上(22)-(33)之任一項中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述嗜酸性粒細胞增多性疾病是選自下組的疾病過敏性疾病、呼吸系統疾病、皮膚疾病、自身免疫病、免疫缺陷疾病、消化系統疾病、腫瘤性疾病、寄生蟲感染或特發性嗜酸性粒細胞增多症候群；(35)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述過敏性疾病是選自藥物過敏、支氣管哮喘和過敏性鼻炎的疾病；(36)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述呼吸系統疾病是嗜酸性粒細胞肺浸潤；(37)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述皮膚疾病是選自特應性皮炎、蕁麻疹、血管性水腫、牛皮癬、木村病、伴有嗜酸性粒細胞增多的發作性血管性水腫、嗜酸性粒細胞性膿皰性毛囊炎和淋巴瘤樣丘疹病的疾病；(38)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述自身免疫病是選自多動脈炎、類風溼性關節炎和系統性紅斑狼瘡的疾病；(39)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述免疫缺陷疾病是選自高IgE症候群、Wiscott-Aldrich症候群和Omenn症候群的疾病；(40)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述消化系統疾病是選自過敏性胃腸炎、嗜酸性粒細胞性胃腸炎、潰瘍性結腸炎和胰腺炎的疾病；(41)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述腫瘤性疾病是霍奇金病；(42)如以上(34)中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療方法，其中所述寄生蟲感染是選自異尖線蟲病、旋毛蟲病、類圓線蟲病、日本血吸蟲病和肺吸蟲病的疾病；(43)嗜酸性粒細胞增多性疾病的診斷方法，包括測量血清可溶性CD30水平，以基於所述水平的變化診斷該疾病；和(44)CD30介導的嗜酸性粒細胞凋亡誘導物的篩選方法，包括以下步驟(a)基於抑制抗CD30抗體與表達CD30的細胞結合的初級篩選，(b)基於在外周血-、臍帶血-或骨髓-來源的培養的嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的二級篩選，和(c)基於在外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的三級篩選。
附圖簡要說明

圖1顯示使用6種小鼠抗人CD30單克隆抗體或對照小鼠IgG對人外周血嗜酸性粒細胞中CD30表達的分析的結果。
圖2顯示使用6種小鼠抗人CD30單克隆抗體或對照小鼠IgG對由IL-5活化的人外周血嗜酸性粒細胞中CD30表達的分析的結果。
圖3是電泳圖，顯示對人外周血嗜酸性粒細胞中CD30 mRNA表達的分析的結果。
圖4顯示抗人CD30單克隆抗體在人外周血嗜酸性粒細胞中的凋亡誘導測定的結果。
圖5顯示對嗜酸性粒細胞供體之間在抗人CD30單克隆抗體在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡方面個體變異的評價的結果。
圖6顯示抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的隨時間變化。
圖7是電泳圖，顯示基於DNA斷裂對抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的評價的結果圖8顯示對抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的能力的評價的結果，與抗人Fas單克隆抗體相比較。
圖9顯示對抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在中性粒細胞中誘導凋亡的能力的評價的結果。
圖10顯示對抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在淋巴細胞中誘導凋亡的能力的評價的結果。
圖11顯示對抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在培養的人肥大細胞中誘導凋亡的能力的評價的結果。
圖12顯示高濃度IL-5對抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的影響。
圖13顯示對抗小鼠CD30單克隆抗體(YMSM636.4.10)在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的評價的結果。
圖14顯示對小鼠CD30配體在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的評價的結果。
圖15顯示對固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的評價的結果。
圖16顯示使用來源於臍帶血的巨噬細胞對人外周血嗜酸性粒細胞的吞噬作用測定的結果，在所述外周血嗜酸性粒細胞中由固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8誘導凋亡。
圖17顯示使用PMA刺激的人單核的細胞系U937的細胞對人外周血嗜酸性粒細胞的吞噬作用測定的結果，在所述外周血嗜酸性粒細胞中由固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8誘導凋亡。
本發明最優選的實施方案如本文所用，參與CD30信號轉導的分子不僅意指直接或間接作用於在嗜酸性粒細胞表面上表達的CD30的分子，而且還意指參與CD30介導的胞內信號轉導的分子以及參與細胞表面到核水平細胞信號轉導的每一步驟的分子。因此，如本文所用的通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質意指直接或間接作用於胞外或胞內信號作用的這些多種步驟中的各分子以誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質。
通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質不僅是抗CD30抗體，而且還可以是任何能在嗜酸性粒細胞中誘導凋亡並滿足臨床應用的必要條件的物質。實例為CD30配體、表達和/或分泌CD30配體的吞噬細胞、能調節CD30表達和/或聚集的物質、使吞噬細胞表達和/或分泌CD30配體的物質或在嗜酸性粒細胞中誘導CD30介導的凋亡的物質，所述物質通過下文所述的篩選方法獲得。
表達和/或分泌CD30配體的吞噬細胞、能調節CD30表達和/或聚集的物質和使吞噬細胞表達和/或分泌CD30配體的物質預期也可通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡。表達和/或分泌CD30配體的吞噬細胞、能調節CD30表達和/或聚集的物質和使吞噬細胞表達和/或分泌CD30配體的物質可通過例如用抗CD30配體抗體對吞噬細胞進行免疫染色或通過ELISA測定吞噬細胞的培養上清中的CD30配體來篩選。
優選的通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是識別由抗CD30抗體Ber-H8或HRS-4識別的位點的免疫球蛋白或其活性片段、肽或低分子量化合物。Ber-H8和HRS-4被描述為小鼠抗人CD30單克隆抗體(Hybridoma 19，43-48，2000)並可購得(Ber-H8可購自PharMingen，San Diego，CA而HRS-4可購自Immunotech，Marseilles，France)。
特別優選的通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是識別至少一部分或全部的SEQ ID NO1的胺基酸序列(CD30胺基酸序列的112與412位之間的胺基酸序列)的免疫球蛋白或其活性片段。特別優選的免疫球蛋白是抗CD30單克隆抗體。
可使用任何來源和類型的抗CD30單克隆抗體，只要它們是高度純化的，但特別優選的是來自哺乳動物的單克隆抗體。
產生單克隆抗體的細胞的動物種類可以是任何哺乳動物，包括人或非人哺乳動物。來自非人哺乳動物的單克隆抗體優選來源於兔或齧齒動物，因為其便於製備。齧齒動物的實例優選包括(但不限於)小鼠、大鼠和倉鼠。從轉基因動物製備的人抗體也是優選的實例。
這種抗CD30單克隆抗體的實例是但不限於Ber-H8或HRS-4。抗CD30單克隆抗體可基本上由如下的已知技術提供。將合適的宿主用CD30作為免疫抗原根據標準的免疫接種技術進行免疫，並通過標準的細胞融合技術將所得的經免疫細胞與已知的親本細胞融合，然後通過標準的篩選方法篩選融合細胞中產生單克隆抗體的細胞。
在本發明中所用的單克隆抗體不限於那些由雜交瘤產生的單克隆抗體，而可以是那些經人工修飾以降低相對於人來說異種的材料的抗原性或其它目的的單克隆抗體。例如，可以使用由來自非人哺乳動物如小鼠的單克隆抗體的可變區、人抗體的恆定區和TXF FR＝0002HE＝250 WI＝080 LX＝1100 LY＝0300組成的嵌合抗體，這種嵌合抗體可通過已知的用於製備嵌合抗體的方法製備，特別是基因重組。在本發明中也可以使用重構人源化抗體。這些是通過用來自非人哺乳動物如小鼠的抗體的互補決定區替換人抗體的互補決定區而獲得的，並且用於製備它們的典型基因重組技術也是已知的。可用於本發明的重構人源化抗體可通過使用這些已知的技術來獲得。
在本發明中，通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質可以是CD30配體或其活性片段。優選的CD30配體包括(但不限於)具有SEQ ID NO2的胺基酸序列的來源於人的CD153和具有SEQ ID NO5的胺基酸序列的來源於小鼠的CD153。通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質還可以是編碼CD30配體或其活性片段的核酸。優選的編碼CD30配體的核酸包括(但不限於)編碼SEQ ID NO2的胺基酸(來源於人的CD153的胺基酸序列)的DNA和編碼SEQ ID NO5的胺基酸(來源於小鼠的CD153的胺基酸序列)的DNA。
篩選通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質的方法的實例包括(但不限於)基於抑制抗CD30抗體(例如HRS-4，Ber-H8，YMSM636.4.10等)與表達CD30的細胞(例如Jurkat，K562，RD等)結合的初級篩選，基於在來源於外周血、臍帶血或骨髓的培養的嗜酸性粒細胞中凋亡誘導的次級篩選，和基於在外周血嗜酸性粒細胞中凋亡誘導的三級篩選。
凋亡誘導效應的存在可在嗜酸性粒細胞是否顯示出凋亡特徵的基礎上進行確定，特別是觀察形態學特徵，如細胞體積減小、DNA斷裂和形成凋亡小體(通過透射電鏡)，或嗜酸性粒細胞的生存。細胞體積可通過電子大小測定技術(electronic sizing technique)使用例如Coulter計數器來測量。核小體之間的DNA斷裂可使用市售的用於檢測凋亡的梯檢測試劑盒(來自例如Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)作為DNA梯來檢測。細胞生存可例如使用比色MTT測定通過線粒體脫氫酶活性來評價。MTT可被甲臘試劑如WAT-1或WST-8替代。細胞生存還可基於活細胞排斥臺盼藍染色而確定。可供選擇地，具有結合的FITC-標記的膜聯蛋白V的凋亡細胞可通過流式細胞儀(例如FACScan Becton Dickinson)測定，使用市售的試劑盒如MEBCYTO-凋亡試劑盒(Medical BiologicalLaboratories，Nagoya，Japan)。
與涉及顆粒蛋白分泌的細胞壞死相比，凋亡的嗜酸性粒細胞在細胞膜破壞而分泌顆粒蛋白之前被吞噬細胞如巨噬細胞吞噬並被除去，而不損傷周圍的組織/細胞。
一般而言，認為由吞噬細胞的吞噬作用而排除凋亡細胞經由以下4個階段發生。
1.吞噬細胞遷移到凋亡細胞周圍在炎症區域，吞噬細胞已經鄰近凋亡細胞。
2.吞噬細胞識別凋亡細胞吞噬細胞通過吞噬作用受體識別凋亡細胞表面上的吞噬作用標誌分子。最為公知的吞噬作用標誌分子之一是磷脂醯絲氨酸(PS)。作為吞噬作用受體，已鑑定了識別PS的B類清除劑受體I型(SR-BI)和LOX-1(凝集素樣氧化的低密度脂蛋白受體-1)。
3.吞噬細胞對凋亡細胞的吞入(吞噬作用)響應來自吞噬作用受體的信號，吞噬細胞的吞噬作用經由一種未知的信號轉導機制而發生。
4.轉運至胞內細胞器如溶酶體並加工被吞噬的凋亡細胞。
嗜酸性粒細胞增多性疾病的具體實例包括過敏性疾病、呼吸系統疾病、皮膚疾病、自身免疫病、免疫缺陷疾病、消化系統疾病、特發性嗜酸性粒細胞增多症候群、腫瘤性疾病(例如霍奇金病)和寄生蟲感染。
本發明的包含如上篩選的通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質作為活性成分的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑與用於常規製劑的載體、賦形劑和其它添加劑一起製備。
用於配製的載體或賦形劑包括例如乳糖、硬脂酸鎂、澱粉、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、橄欖油、芝麻油、可可脂、乙二醇和其它常用添加劑。
合適的口服固體組合物包括片劑、藥丸、膠囊、粉劑和顆粒劑。在這種固體組合物中，至少一種活性成分與至少一種惰性稀釋劑如乳糖、甘露醇、葡萄糖、羥丙基纖維素、微晶纖維素、澱粉、聚乙烯吡咯烷酮或矽鋁酸鎂(magnesium aluminometasilicate)混合。所述組合物可常規含有除惰性稀釋劑之外的其它添加劑，例如潤滑劑如硬脂酸鎂；崩解劑如羧甲基纖維素鈣；和增溶劑如穀氨酸或天冬氨酸。片劑或藥丸可用糖包衣如蔗糖、明膠或羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯，或胃溶性或腸溶性材料的膜，或兩層或多層包衣。可被吸收的材料如明膠的膠囊也包括在內。
口服液體組合物包括藥學可接受的乳劑、溶液、懸浮劑、糖漿和酏劑，並可含有常規惰性稀釋劑如純淨水和乙醇。除惰性稀釋劑之外，這些組合物還可含有輔劑如潤溼劑或懸浮劑、甜味劑、矯味劑、芳香劑和防腐劑。
腸胃外給藥的注射劑包括無菌的含水或非水溶液、懸浮劑和乳劑。水溶液和含水懸浮劑含有例如注射用水和注射用生理鹽水。非水溶液和懸浮劑含有例如丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、醇如乙醇和聚山梨酯80。這些組合物還可含有輔劑如防腐劑、潤溼劑、乳化劑、分散劑、穩定劑(例如乳糖)和增溶劑(例如穀氨酸和天冬氨酸)。這些物質可以通過常規滅菌方法滅菌，如採用微孔過濾膜的機械滅菌、熱滅菌如高壓滅菌或包含殺菌劑。注射劑可以是溶液製劑或在用前重構的凍幹製劑。對於凍幹合適的賦形劑包括例如糖醇或糖如甘露醇或葡萄糖。
當本發明的治療劑用於基因治療時，可將通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質的核酸整合入病毒載體，優選慢病毒屬載體、腺伴隨病毒載體，更優選腺病毒載體，或整合入已知的適於基因治療的載體，如化學合成的脂質體、病毒包膜或病毒包膜與化學脂質體的複合體，位於在宿主細胞中有功能的啟動子序列如巨細胞病毒啟動子(CMV啟動子)的下遊。
本發明的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑優選經由藥學上常規的途徑如口服或腸胃外途徑給藥。當活性成分是抗體時，它們通常經由腸胃外途徑如注射(皮下、靜脈內、肌內或腹膜內注射)或經皮、黏膜、鼻或肺給藥而給予，但也可以口服給藥。
本發明的製劑中所包含的作為活性成分的通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質的量可取決於有待治療的疾病類型、疾病的嚴重程度、患者的年齡和其它因素來確定，但通常可以以0.01-500mg/ml的範圍給予，優選0.1-200mg/ml，表示為終濃度。
工業實用性本發明的通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質可用作嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，在嗜酸性粒細胞中CD30介導的凋亡誘導基於一種新的機制可用作對嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療。這種疾病的實例是那些與炎症反應作為主要症狀有關的疾病，其中嗜酸性粒細胞起著關鍵作用，如過敏性疾病、寄生蟲感染和自身免疫病。
本發明的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑可在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡，其比先前已知誘導嗜酸性粒細胞凋亡的抗Fas抗體要迅速和強烈得多。凋亡誘導是對嗜酸性粒細胞高度特異性的，在中性粒細胞、淋巴細胞和肥大細胞中不誘導凋亡。此外，本發明的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑在嗜酸性粒細胞中誘導凋亡不能被IL-5或類似物質減弱。因此，本發明的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑預期可作為臨床上非常有用的治療劑。
實施例以下實施例進一步例示說明本發明，但並不將本發明的範圍限定於此。
實施例1分析人外周血嗜酸性粒細胞中的CD30表達將肝素化的人外周血用PBS稀釋並鋪層於Percoll(密度1.090g/ml，Pharmacia，Uppsala，Sweden)上，然後離心(1500rpm，30分鐘)。將最底下層中的粒細胞部分用冷純淨水溶血。然後，使用固定有抗CD16抗體的磁珠(MACS CD16微珠，Miltenyi Biotec，BergischGladbach，Germany)通過負選擇獲得嗜酸性粒細胞部分。嗜酸性粒細胞的生存率(臺盼藍染料排斥，Nakarai)和純度(DIFF-QUICK染色，International Reagents Corporation)均為99％或更高。
將分離的人嗜酸性粒細胞製備為2×105細胞/管，並與6種小鼠抗人CD30單克隆抗體或對照小鼠IgG(10μg/ml)作為初級抗體於4℃反應30分鐘。衝洗後，將細胞用FITC標記的山羊抗小鼠IgG F(ab』)2作為二抗進行染色(於4℃反應，30分鐘)，並用1％低聚甲醛固定，然後通過流式細胞儀(FACScan Becton Dickinson)進行檢測。用IL-5(1ng/ml，R D systems，Inc.，Minneapolis，MN)活化(37℃，30分鐘)的嗜酸性粒細胞也以相同的方式進行測試。所用的小鼠抗人CD30單克隆抗體為HRS-4(Immunotech，Marseilles，France)、Ber-H2(DAKO，Glostrup，Denmark)、Ber-H8(PharMingen，San Diego，CA)、AC-10(Ancel，Bayport，MN)、1G12(YLEM Avezzano，Roma，Italy)和Ki-1(YLEM Avezzano，Roma，Italy)，所用的對照小鼠IgG為MOPC-21(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)。
對來自6名外周血供體的嗜酸性粒細胞的流式細胞儀分析顯示，人外周血嗜酸性粒細胞被HRS-4和AC10顯著染色，證實CD30表達(圖1)。AC10染色的平均螢光強度為8.9±3.2，顯示嗜酸性粒細胞中的CD30表達可與IL-5受體α鏈的表達相比。當細胞用IL-5活化時，AC10顯示出顯著的表達，而HRS-4或Ber-H8顯示出相對增加的表達(圖2)。
實施例2分析人外周血嗜酸性粒細胞中的CD30mRNA表達將人外周血嗜酸性粒細胞溶於Isogen(Nippon Gene，Osaka，Japan)以提取RNA，然後使用來自Invitrogen Corp(San Diego，CA)的試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。利用識別人CD30基因3』-非翻譯區的上遊有義引物(5′-GCC CAG GAT CAA GTC ACT CAT-3′)(SEQID NO3)和下遊反義引物(5′-TAC ACG TCT GAA GGC CCTAGG-3′)(SEQ ID NO4)通過PCR擴增501bp片段，所述PCR反應在熱循環儀(Gene Amp PCR System 9700；PE Biosystem)中進行(1個循環的94℃變性1分鐘；40個循環的94℃ 1分鐘/55℃ 1分鐘/72℃2分鐘；以及最後1個循環的72℃延伸10分鐘)。反應完成後，將反應產物在0.8％瓊脂糖凝膠(BRL Life Technologies Inc.)上電泳，所述凝膠中含有0.05％溴化乙錠(Sigma)，顯示目標PCR產物為約500bp的條帶。由此顯示CD30 mRNA在人外周血嗜酸性粒細胞中表達(圖3)。
實施例3評價抗人CD30單克隆抗體在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡將抗人CD30單克隆抗體在PBS中製成多種不同濃度(0.01，0.1，1和10μg/ml)，將1ml的每種製備物加入24孔微量反應板(Costar Corp.，Cambridge，MA)，然後於4℃靜置12小時以固定化。衝洗之後，將板用2ml 1％人血清白蛋白(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)於37℃封閉2小時。衝洗後，加入在含有10％ FCS，10-5M 2-巰基乙醇(GIBCO)，青黴素/鏈黴素(GIBCO)和1ng/ml人重組IL-5(RDsystems，Inc.，Minneapolis，MN)的IMDM(Iscove’s改良Dulbecco’s培養基，GIBCO)中製備為1×106細胞/ml的分離的人外周血嗜酸性粒細胞。於37℃溫育4小時後，收穫細胞並衝洗，然後使用MEBCYTO凋亡試劑盒(Medical Biological Laborato ries，Nagoya，Japan)檢測凋亡細胞。通過流式細胞儀(FACScan Becton Dickinson)測量結合有FITC-標記的膜聯蛋白V的凋亡細胞。
結果顯示，抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8濃度依賴性地在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡。以1和10μg/ml濃度固定化的HRS-4分別在16.3％和78.8％的嗜酸性粒細胞中誘導凋亡；而以0.01，0.1，1和10μg/ml濃度固定化的Ber-H8分別在7.8％，11.4％，44.8％和71.9％的嗜酸性粒細胞中誘導凋亡(圖4)。但是，抗人CD30單克隆抗體Ber-H2，AC10，1G12和Ki1以及對照小鼠IgG在人外周血嗜酸性粒細胞中不誘導凋亡。
實施例4評價嗜酸性粒細胞供體之間在抗人CD30單克隆抗體在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡方面的個體變異評價了抗人CD30單克隆抗體在從3名供體的外周血分離的嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的能力。以10μg/ml的濃度將抗人CD30單克隆抗體固定化。抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在來自所有供體的外周血嗜酸性粒細胞中強烈誘導凋亡(圖5顯示3名供體的平均值)。由此顯示嗜酸性粒細胞供體之間在HRS-4和Ber-H8在外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的能力方面無個體變異發生。但是，抗人CD30單克隆抗體Ber-H2，AC10，1G12和Ki1以及對照小鼠IgG在來自任何供體的嗜酸性粒細胞中均未誘導凋亡。
實施例5抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的時間動力學評價了抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在分離的人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的時間動力學。當將嗜酸性粒細胞培養在以10μg/ml濃度固定化HRS-4和Ber-H8的平板上時，1小時後兩種抗體均在約50％的嗜酸性粒細胞中誘導凋亡，4小時後凋亡的嗜酸性粒細胞增加至70％(圖6)。由此發現HRS-4和Ber-H8在外周血嗜酸性粒細胞中非常迅速地誘導凋亡。
實施例6抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡(基於DNA斷裂)基於DNA斷裂評價抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在分離的人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡。將嗜酸性粒細胞在以10μg/ml濃度固定化HRS-4和Ber-H8的平板上培養24小時後，收穫細胞並用凋亡梯檢測試劑盒(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)提取DNA，通過瓊脂糖電泳評價DNA斷裂。
HRS-4和Ber-H8均誘導嗜酸性粒細胞DNA斷裂(圖7)。但是，抗人CD30單克隆抗體Ber-H2和對照小鼠IgG均不誘導嗜酸性粒細胞DNA斷裂。由此通過DNA斷裂可以證實，HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡。
實施例7評價抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的能力，與抗人Fas單克隆抗體相比較與抗人Fas單克隆抗體(CH-11，Medical Biological Laboratories，Nagoya，Japan)相比，評價了抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在分離的人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的能力。將嗜酸性粒細胞培養在以10μg/ml濃度固定有所述單克隆抗體的平板上。
培養1小時後，HRS-4和Ber-H8在約50％的嗜酸性粒細胞中誘導凋亡，並且4小時後凋亡的嗜酸性粒細胞增加至70％。當使用抗人Fas單克隆抗體時，在培養24小時之後出現凋亡的嗜酸性粒細胞，但即使在72小時後也只是輕微增加(圖8)。由此發現與抗人Fas單克隆抗體相比，抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細胞中非常迅速和強烈地誘導凋亡。
實施例8評價抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8的凋亡誘導能力的細胞選擇性將肝素化的人外周血用PBS稀釋並鋪層於Percoll(密度1.090g/ml，Pharmacia，Uppsala，Sweden)上，然後離心(1500rpm，15分鐘)。將最底下層中的粒細胞部分用冷純淨水溶血。然後，使用固定有抗CD16抗體的磁珠(MACS CD16微珠，Miltenyi Biotec，BergischGladbach，Germany)通過正選擇獲得中性粒細胞部分。中性粒細胞的生存率為99％。通過流式細胞儀評估固定化抗人CD30單克隆抗體在分離的人外周血中性粒細胞中誘導凋亡的能力。
上述6種抗人CD30單克隆抗體在中性粒細胞中都不誘導凋亡(圖9)。使用來自6名供體的外周血中性粒細胞作進一步評價，但6種抗人CD30單克隆抗體都不誘導凋亡。
然後通過矽膠(IBL Co.，Ltd.)於37℃1小時的作用耗盡肝素化的人外周血中的巨噬細胞，並用PBS稀釋，然後鋪層於LSM(密度1.077g/ml，ICN)上，隨後離心(1500rmp，15分鐘)，得到淋巴細胞部分。淋巴細胞的生存率為99％。以相同的方式通過流式細胞儀測量固定化抗人CD30單克隆抗體在分離的人外周血淋巴細胞中誘導凋亡的能力。HRS-4和Ber-H8在淋巴細胞中均不誘導凋亡(圖10)，儘管兩者在嗜酸性粒細胞中誘導凋亡。
還通過流式細胞儀測量了固定化抗人CD30單克隆抗體在培養的人肥大細胞中誘導凋亡的能力。HRS-4和Ber-H8在培養的人肥大細胞中均不誘導凋亡(圖11)，儘管兩者在嗜酸性粒細胞中誘導凋亡。所用的培養的人肥大細胞是來自外周血的成熟肥大細胞(P-肥大細胞)和來自臍帶血的成熟肥大細胞(C-肥大細胞)，所述細胞根據Saito等的方法(J.Immunol.157，343-350，1996和J.Allergy Clin.Immunol.106，321-328，2000)獲得。
此外，HRS-4和Ber-H8在CD30陽性的人細胞系Jurkat(T細胞淋巴瘤)、K562(紅白血病)和RD(橫紋肌肉瘤)中均不誘導凋亡。
由此發現抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8選擇性地在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡。
實施例9高濃度IL-5對抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的影響先前的證據顯示抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在10ng/ml人重組IL-5的存在下在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡。但是，如果IL-5以高濃度存在，嗜酸性粒細胞本身的生存力可增加以減弱HRS-4和Ber-H8的凋亡誘導能力。由此，在0，1，10和100ng/ml的IL-5存在下，評價HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡的能力。考慮到嗜酸性粒細胞供體之間的個體變異，使用來自4名供體的外周血嗜酸性粒細胞。
HRS-4以IL-5濃度依賴性方式誘導凋亡，在缺乏IL-5條件下不誘導凋亡，但其甚至在100ng/ml下也誘導凋亡。但是，Ber-H8無論IL-5是否存在均誘導凋亡(圖12)。
這提示在人外周血嗜酸性粒細胞中CD30介導的凋亡經由IL-5參與和不參與的信號作用途徑而發生。但是，顯示HRS-4和Ber-H8的凋亡誘導即使在至少高濃度的IL-5存在下也不減弱。
實施例10評價抗小鼠CD30單克隆抗體在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡對抗小鼠CD30單克隆抗體YMSM636.4.10(Serotec Ltd，OxfordUK)和2SH12-5F-2D(BD PharMingen，San Diego，USA)在分離的人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡進行了評價。當將人嗜酸性粒細胞培養在以10μg/ml的濃度固定化YMSM636.4.10的平板上時，4小時後在約30％的嗜酸性粒細胞中誘導了凋亡(圖13)。但是，2SH12-5F-2D和大鼠對照IgG不誘導凋亡。
實施例11評價小鼠CD30配體在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡對重組小鼠CD30配體(R D Systems Inc.Minneapolis，USA)在分離的人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡進行了評價。當將人嗜酸性粒細胞培養在以10和100μg/ml的濃度固定化重組小鼠CD30配體的平板上時，4小時後在28％和35％的嗜酸性粒細胞中誘導了凋亡(圖14)。
實施例12評價固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡對固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在分離的人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡進行了評價。根據Kita等的方法(Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.，18675-686，1998)，將200μg的抗人CD30單克隆抗體加入0.5ml直徑為1.444μM的聚苯乙烯微珠(2.56％固體乳膠，Sigma)，用0.1M硼酸鹽緩衝液洗，並於4℃靜置12小時以固定化。衝洗後，將珠用0.5ml的2.5％人血清白蛋白於4℃封閉2小時。衝洗後，將珠懸於0.5ml的PBS中以製備固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體。向96孔U底微量反應板(NUNC)加入2×105的分離的人外周血嗜酸性粒細胞以及固定在聚苯乙烯微珠上的HRS-4和Ber-H8(10μl)。於37℃溫育4小時後，通過流式細胞儀測量凋亡細胞。通過在前向相對於側向散射散點圖上分選來除外來自聚苯乙烯微珠的信號。
固定在聚苯乙烯微珠上的HRS-4和Ber-H8分別在27.9％和44.0％的嗜酸性粒細胞中誘導凋亡(圖15)。但是，固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體Ber-H2和對照小鼠IgG在人外周血嗜酸性粒細胞中不誘導凋亡。由此發現抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8當固定在聚苯乙烯微珠上時也以與固定在微量反應板上相同的方式在人嗜酸性粒細胞中誘導凋亡。
實施例13吞噬細胞對人外周血嗜酸性粒細胞的吞噬作用測定，固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體HRS-4和Ber-H8在所述人外周血嗜酸性粒細胞中誘導凋亡對分離的嗜酸性粒細胞進行吞噬細胞的吞噬作用測定，固定在聚苯乙烯微珠上的HRS-4和Ber-H8在所述分離的嗜酸性粒細胞中誘導凋亡。根據Brown等的方法(J.Biol.Chem.，2755987-5996，2000)，將CD34陰性的細胞首先從人臍帶血單核的部分中分級分離出來，並在10ng/ml人重組M-CSF(巨噬細胞集落刺激因子，RD)存在下培養7天，以製備成熟的巨噬細胞。然後，將嗜酸性粒細胞與固定在聚苯乙烯微珠上的HRS-4和Ber-H8反應30分鐘，在凋亡誘導期間，根據Fadok等人的方法(J.Biol.Chem.，2761071-1077，2001)對它們測定由預先在chamber slides(NUNC)上培養24小時的來源於臍帶血的巨噬細胞的吞噬作用。基於4小時後在嗜酸性粒細胞單一培養物和嗜酸性粒細胞/巨噬細胞共培養物的培養上清中分泌的嗜酸性粒細胞顆粒蛋白EDN(嗜酸性粒細胞源神經毒素)濃度的差異來評價吞噬效應。使用ELISA試劑盒(MBL)測量EDN濃度。
固定在聚苯乙烯微珠上的HRS-4和Ber-H8在其中誘導凋亡的嗜酸性粒細胞顯示出在培養上清中分泌的EDN減少，這是與來源於臍帶血的巨噬細胞共培養所致的吞噬作用的結果。特別地，來源於臍帶血的巨噬細胞顯示出對HRS-4在其中誘導凋亡的嗜酸性粒細胞的顯著吞噬效應(圖1 6)。但是，與固定在聚苯乙烯微珠上的抗人CD30單克隆抗體Ber-H2和對照小鼠IgG反應的嗜酸性粒細胞的單一培養物和共培養物均顯示出非常低的EDN分泌。在使用人單核細胞系U937(例如可得自ATCC，編號為ATCC No.CRL-1593.2)的吞噬作用測定中獲得了相類似的結果，所述細胞系通過用10ng/ml PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，Sigma)刺激1小時而活化，用於引發作為巨噬細胞的功能觸發其吞噬能力的目的(圖17)。
這提示HRS-4和Ber-H8在其中誘導凋亡的人外周血嗜酸性粒細胞在細胞膜破壞而分泌顆粒蛋白之前被吞噬細胞如巨噬細胞吞噬。
序列表110SUNTORY LIMITEDSUNTORY BIOMEDICAL RESEARCH LIMITED120嗜酸性粒細胞疾病的治療劑13001147216052101211595212PRT213智人(Homo sapiens)4001Met Arg Val Leu Leu Ala Ala Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu5 10 15Arg Ala Phe Pro Gln Asp Arg Pro Phe Glu Asp Thr Cys His Gly Asn20 25 30Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys Cys Tyr Arg Cys35 40 45Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln Arg Pro Thr Asp50 55 60Cys Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg65 70 75 80Cys Thr Ala Cys Val Thr Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr85 90 95Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Val Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met100 105 110Phe Cys Ser Thr Ser Ala Val Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe His115 120 125Ser Val Cys Pro Ala Gly Met Ile Val Lys Phe Pro Gly Thr Ala Gln
130 135 140Lys Asn Thr Val Cys Glu Pro Ala Ser Pro Gly Val Ser Pro Ala Cys145 150 155 160Ala Ser Pro Glu Asn Cys Lys Glu Pro Ser Ser Gly Thr Ile Pro Gln165 170 175Ala Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro Ala Thr Ser Ser Ala Ser Thr Met180 185 190Pro Val Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ser Lys Leu195 200 205Thr Arg Ala Pro Asp Ser Pro Ser Ser Val Gly Arg Pro Ser Ser Asp210 215 220Pro Gly Leu Ser Pro Thr Gln Pro Cys Pro Glu Gly Ser Gly Asp Cys225 230 235 240Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg Cys245 250 255Thr Ala Cys Val Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro260 265 270Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Ile275 280 285Cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser Cys Ala Arg Cys Val Pro Tyr Pro290 295 300Ile Cys Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Pro Gln Asp Met Ala Glu Lys305 310 315 320Asp Thr Thr Phe Glu Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn325 330 335Pro Thr Pro Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln340 345 350Ser Leu Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr355 360 365
Ser Ala Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala370 375 380Gly Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly385 390 395 400Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile405 410 415Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys420 425 430Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg435 440 445Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met450 455 460Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu465 470 475 480Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser485 490 495Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn500 505 510Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly515 520 525Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala530 535 540Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr545 550 555 560Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met565 570 575Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala580 585 590Ser Gly Lys
5952102211234212PRT213智人4002Met Asp Pro Gly Leu Gln Gln Ala Leu Asn Gly Met Ala Pro Pro Gly5 10 15Asp Thr Ala Met His Val Pro Ala Gly Ser Val Ala Ser His Leu Gly20 25 30Thr Thr Ser Arg Ser Tyr Phe Tyr Leu Thr Thr Ala Thr Leu Ala Leu35 40 45Cys Leu Val Phe Thr Val Ala Thr Ile Met Val Leu Val Val Gln Arg50 55 60Thr Asp Ser Ile Pro Asn Ser Pro Asp Asn Val Pro Leu Lys Gly Gly65 70 75 80Asn Cys Ser Glu Asp Leu Leu Cys Ile Leu Lys Arg Ala Pro Phe Lys85 90 95Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val Ala Lys His Leu Asn Lys Thr Lys100 105 110Leu Ser Trp Asn Lys Asp Gly Ile Leu His Gly Val Arg Tyr Gln Asp115 120 125Gly Asn Leu Val Ile Gln Phe Pro Gly Leu Tyr Phe Ile Ile Cys Gln130 135 140Leu Gln Phe Leu Val Gln Cys Pro Asn Asn Ser Val Asp Leu Lys Leu145 150 155 160Glu Leu Leu Ile Asn Lys His Ile Lys Lys Gln Ala Leu Val Thr Val165 170 175
Cys Glu Ser Gly Met Gln Thr Lys His Val Tyr Gln Asn Leu Ser Gln180 185 190Phe Leu Leu Asp Tyr Leu Gln Val Asn Thr Thr Ile Ser Val Asn Val195 200 205Asp Thr Phe Gln Tyr Ile Asp Thr Ser Thr Phe Pro Leu Glu Asn Val210 215 220Leu Ser Ile Phe Leu Tyr Ser Asn Ser Asp225 230210321121212DNA213人工序列4003gcccaggatc aagtcactca t210421121212DNA213人工序列4004tacacgtctg aaggccctag g2105211239212PRT213小鼠4005Met Glu Pro Gly Leu Gln Gln Ala Gly Ser Cys Gly Ala Pro Ser Pro
5 10 15Asp Pro Ala Met Gln Val Gln Pro Gly Ser Val Ala Ser Pro Trp Arg20 25 30Ser Thr Arg Pro Trp Arg Ser Thr Ser Arg Ser Tyr Phe Tyr Leu Ser35 40 45Thr Thr Ala Leu Val Cys Leu Val Val Ala Val Ala Ile Ile Leu Val50 55 60Leu Val Val Gln Lys Lys Asp Ser Thr Pro Asn Thr Thr Glu Lys Ala65 70 75 80Pro Leu Lys Gly Gly Asn Cys Ser Glu Asp Leu Phe Cys Thr Leu Lys85 90 95Ser Thr Pro Ser Lys Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val Ser Lys His100 105 110Leu Asn Asn Thr Lys Leu Ser Trp Asn Glu Asp Gly Thr Ile His Gly115 120 125Leu Ile Tyr Gln Asp Gly Asn Leu Ile Val Gln Phe Pro Gly Leu Tyr130 135 140Phe Ile Val Cys Gln Leu Gln Phe Leu Val Gln Cys Ser Asn His Ser145 150 155 160Val Asp Leu Thr Leu Gln Leu Leu Ile Asn Ser Lys Ile Lys Lys Gln165 170 175Thr Leu Val Thr Val Cys Glu Ser Gly Val Gln Ser Lys Asn Ile Tyr180 185 190Gln Asn Leu Ser Gln Phe Leu Leu His Tyr Leu Gln Val Asn Ser Thr195 200 205Ile Ser Val Arg Val Asp Asn Phe Gln Tyr Val Asp Thr Asn Thr Phe210 215 220Pro Leu Asp Asn Val Leu Ser Val Phe Leu Tyr Ser Ser Ser Asp225 230 23權利要求
1.嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，包含通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質作為活性成分。
2.如權利要求1中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是識別由Ber-H8或HRS-4識別的位點的免疫球蛋白或其活性片段、肽或低分子量化合物。
3.如權利要求1中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是免疫球蛋白或其活性片段。
4.如權利要求2中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是識別至少一部分或全部的SEQ ID NO1的胺基酸序列(CD30胺基酸序列的112與412位之間的胺基酸序列)的免疫球蛋白或其活性片段。
5.如權利要求4中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述免疫球蛋白是Ber-H8或HRS-4。
6.如權利要求1中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是CD30配體或其活性片段。
7.如權利要求1中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質是編碼CD30配體或其活性片段的核酸。
8.如權利要求1中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述嗜酸性粒細胞增多性疾病是選自下組的疾病過敏性疾病、呼吸系統疾病、皮膚疾病、自身免疫病、免疫缺陷疾病、消化系統疾病、腫瘤性疾病或寄生蟲感染。
9.如權利要求8中定義的嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，其中所述過敏性疾病是選自下組的疾病藥物過敏、支氣管哮喘和過敏性鼻炎。
全文摘要
在此公開的是嗜酸性粒細胞增多性疾病的治療劑，包含通過CD30和/或參與CD30信號轉導的分子誘導嗜酸性粒細胞凋亡的物質作為活性成分。這種治療劑對過敏性疾病、呼吸系統疾病、皮膚疾病、自身免疫病、免疫缺陷疾病、消化系統疾病、腫瘤性疾病和寄生蟲感染有效。
文檔編號A61P35/00GK1518459SQ0281250
公開日2004年8月4日 申請日期2002年6月21日 優先權日2001年6月22日
發明者三浦健壽, 松林真紀, 齋藤博久, 松本健治, 久, 治, 紀 申請人:第一三得利製藥株式會社, 株式會社第一三得利生物醫學研究所